"МУК 4.1.3410-16. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств валифеналата в воде, почве, ботве и клубнях картофеля, винограде и виноградном соке и его метаболитов (IR 5839 и PCBA) в воде и почве методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 29.12.2016)

1. Разработаны сотрудниками ФГБНУ "Всероссийский НИИ защиты растений" и ООО "Инновационный центр защиты растений" (В.И. Долженко, И.А. Цибульская, А.С. Комарова, Т.Д. Черменская).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 22 декабря 2016 г. N 2).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 29 декабря 2016 г.

4. Введены впервые.

Свидетельство о метрологической аттестации N 01.5.04.233/01.00043/2016.

Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием для определения массовой концентрации валифеналата в воде в диапазоне концентраций 0,002 - 0,02 мг/л, в почве, ботве и клубнях картофеля, винограде и виноградном соке в диапазоне концентраций 0,01 - 0,1 мг/кг и его метаболитов в воде в диапазоне концентраций 0,002 - 0,02 мг/л, в почве в диапазоне концентраций 0,01 - 0,1 мг/кг.

Методические указания носят рекомендательный характер.

Валифеналат

N-(изопропоксикарбонил)-L-валил-(3RS)-3-(4-хлорфенил)--аланинат (ИЮПАК).

Брутто формула: C₁₉H₂₇ClN₂O₅.

Молекулярная масса: 398,9.

Эквимолярная смесь диастереомеров (S,S- и S,R-).

Белое кристаллическое вещество без запаха.

Растворимость в воде 24,1 мг/л (pH от 4,9 до 5,9), 45,5 мг/л (pH от 9,5 до 9,8). Растворимость: в ацетоне - 29,3 г/л, дихлорэтане - 14,4 г/л, этилацетате - 25,4 г/л, н-гептане - 25 мг/л, метаноле - 28,8 г/л, ксилоле - 2,31 г/л.

pKa = -1,78 (25 °C).

Гидролитическая стабильность: стабилен при pH 4 и 50 °C, медленно при pH 7 и 25 °C, быстро при pH 9 и 50 °C. Основной продукт гидролиза при pH 9 IR-5839. Оба метаболита стабильны к гидролизу при нормальных условиях.

Валифеналат имеет очень низкую персистентность в почве и быстро образует главный метаболит IR-5839, который, в свою очередь, также быстро деградирует до 4-хлорбензойной кислоты.

Валифеналат не обладает острой пероральной, дермальной и ингаляционной токсичностью, не является ирритантом.

IR-5839

Брутто формула: C₁₈H₂₅ClN₂O₅.

Молекулярная масса: 385.

Пероральная токсичность для крыс ЛД₅₀ > 2 000 мг/кг. Не генотоксичен.

4-хлорбензойная кислота (PCBA)

Брутто формула: C₇H₅ClO₂.

Молекулярная масса: 156,7.

pKa = 3,98 (25 °C)

Пероральная токсичность для крыс ЛД₅₀ 1 170 мг/кг. Не генотоксична.

Гигиенические нормативы для валифеналата и его метаболитов в России не установлены.

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций.

Метод основан на определении валифеналата и его метаболитов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием масс-спектрометрического детектора после извлечения из образцов ацетонитрилом и очистки ацетонитрильного экстракта на патронах для твердофазной экстракции (ТФЭ).

Идентификация проводится по времени удерживания, количественное определение - методом абсолютной калибровки.

Избирательность метода обеспечивается сочетанием условий подготовки проб и хроматографического анализа с масс-детектированием.

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Примечание. Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией, не требующих дополнительной очистки растворителей.

Примечание. Допускается применение оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-09, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф.

4.2. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией, соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и ГН 2.2.5.2308-07.

Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004-90.

Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист-химик, владеющий методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, ознакомленный с руководством по эксплуатации хроматографа, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 13.

При выполнении измерений выполняют следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C и относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Перед началом анализа аналитическую колонку кондиционируют в потоке подвижной фазы (0,1 - 0,2 см³/мин) до стабилизации нулевой линии.

7.2.1. Кондиционирование патрона N 1 с гидрофобным сорбентом с привитыми гексадецильными группами. Патрон промывают 2,5 см³ ацетонитрила, затем 3 см³ воды, подкисленной муравьиной кислотой до pH 2.

7.2.2. Кондиционирование патрона N 2 с гидрофильным слабокислотным сорбентом с постоянной активностью. Патрон последовательно промывают 2,5 см³ смеси N 6, затем 3 см³ смеси N 4.

7.3.1. Фаза A - 0,1%-й раствор муравьиной кислоты в ацетонитриле: 1 см³ муравьиной кислоты помещают в мерную колбу объемом 1 дм³ и доводят объем до метки ацетонитрилом.

7.3.2. Фаза B - 0,1%-й раствор муравьиной кислоты в воде: 1 см³ муравьиной кислоты помещают в мерную колбу объемом 1 дм³ и доводят объем до метки бидистиллированной водой.

7.3.3. Подвижная фаза для растворения проб: смешивают фазу A и фазу B в соотношении 1:1 по объему.

7.4.1.1. Основной раствор валифеналата с концентрацией 1,0 мг/см³: точную навеску валифеналата (50 +/- 0,5 мг) помещают в мерную колбу вместимостью 50 см³, растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки тем же растворителем.

7.4.1.2. Основной раствор IR-5839 с концентрацией 1,0 мг/см³: точную навеску IR-5839 (50 +/- 0,5 мг) помещают в мерную колбу вместимостью 50 см³, растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки тем же растворителем.

7.4.1.3. Основной раствор 4-хлорбензойной кислоты с концентрацией 1,0 мг/см³: точную навеску 4-хлорбензойной кислоты (50 +/- 0,5 мг) помещают в мерную колбу вместимостью 50 см³, растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки тем же растворителем.

Градуировочные растворы с концентрациями 2, 5, 10, 50 и 100 нг/см³ готовят методом последовательного разбавления по объему, используя в качестве растворителя подвижную фазу.

7.4.2.1. Раствор валифеналата N 1 с концентрацией 1,0 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 100 см³ вносят 0,1 см³ основного раствора валифеналата и доводят до метки ацетонитрилом.

7.4.2.2. Раствор IR-5839 N 2 с концентрацией 1,0 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 100 см³ вносят 0,1 см³ основного раствора IR-5839 и доводят до метки ацетонитрилом.

7.4.2.3. Раствор 4-хлорбензойной кислоты N 3 с концентрацией 1,0 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 100 см³ вносят 0,1 см³ основного раствора 4-хлорбензойной кислоты и доводят до метки ацетонитрилом.

7.4.2.4. Раствор N 4 с концентрацией 100 нг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают по 1,0 см³ раствора N 1, N 2 и N 3 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.4.2.5. Раствор N 5 с концентрацией 50 нг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают по 0,5 см³ раствора N 1, N 2 и N 3 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.4.2.6. Раствор N 6 с концентрацией 10 нг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 1,0 см³ раствора N 4 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.4.2.7. Раствор N 7 с концентрацией 5 нг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 0,5 см³ раствора N 4 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.4.2.8. Раствор N 8 с концентрацией 2 нг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 0,2 см³ раствора N 4 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.4.2.9. Раствор валифеналата N 9 с концентрацией 100 нг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 1,0 см³ раствора N 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.4.2.10. Раствор валифеналата N 10 с концентрацией 50 нг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 0,5 см³ раствора N 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.4.2.11. Раствор валифеналата N 11 с концентрацией 10 нг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 1,0 см³ раствора N 9 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.4.2.12. Раствор валифеналата N 12 с концентрацией 5 нг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 0,5 см³ раствора N 9 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.4.2.13. Раствор валифеналата N 13 с концентрацией 2 нг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 0,2 см³ раствора N 9 и доводят объем до метки подвижной фазой.

Основной раствор можно хранить в холодильнике при температуре 0 - 4 °C в течение 7 дней, градуировочные растворы использовать в день приготовления.

При изучении полноты определения валифеналата и его метаболитов используют растворы веществ, приготовленные из основного раствора методом последовательного разбавления по объему ацетонитрилом.

Для каждого из градуировочных растворов регистрируют хроматограммы в условиях, указанных в п. 9.7, и определяют абсолютное время удерживания и площадь пиков валифеналата, IR-5839 и 4-хлорбензойной кислоты (в усл. ед.), соответствующих MRM , MRM , и MRM соответственно. Одновременно в режиме автоматической обработки данных определяют соотношение площадей пиков для валифеналата, соответствующих MRM и MRM (S₁₅₅/S₁₄₄); для IR-5839 - MRM и MRM (S₁₈₆/S₁₁₆), для 4-хлорбензойной кислоты - MRM .

Для построения градуировочного графика (площадь пика - концентрация валифеналата или его метаболитов в растворе) в хроматограф вводят по 2 мм³ градуировочных растворов (не менее 5 параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4 точек по диапазону измеряемых концентраций) в условиях, указанных в п. 9.7. Затем измеряют площади пиков, и строят график зависимости площади пика от концентрации в градуировочном растворе.

Методом наименьших квадратов рассчитывают градуировочный коэффициент (K) в уравнении линейной регрессии:

S - площадь пика градуировочного раствора.

Градуировку признают удовлетворительной, если значение коэффициента линейной корреляции оказывается не ниже 0,99.

Градуировочную характеристику необходимо проверять при замене реактивов, хроматографической колонки или элементов хроматографической системы, а также при отрицательном результате контроля градуировочного коэффициента.

Градуировочную зависимость признают стабильной при выполнении следующего условия:

C - аттестованное значение массовой концентрации валифеналата или его метаболитов в градуировочном растворе;

C_к - результат контрольного измерения массовой концентрации валифеналата или его метаболитов в градуировочном растворе;

- норматив контроля градуировочного коэффициента, % ( при P = 0,95).

В круглодонную колбу емкостью 10 см³ отбирают по 1 см³ стандартных растворов валифеналата и его метаболитов с концентрацией 1 мкг/см³. Растворитель удаляют в вакууме. Остаток растворяют в 1 см³ ацетонитрила, добавляют 9 см³ воды, подкисленной муравьиной кислотой до pH 2, и переносят на подготовленный патрон (п. 7.2.1). Промывают патрон 3 см³ смеси N 1, 3 см³ смеси N 2, элюат отбрасывают. Затем элюируют валифеналат и метаболиты смесью N 3 со скоростью 1 - 2 капли в секунду. Отбирают фракции по 2 см³, упаривают досуха, растворяют в 1 см³ подвижной фазы и анализируют по п. 9.7.

Фракции, содержащие валифеналат и метаболиты, объединяют и вновь анализируют.

Устанавливают уровень вещества в элюате, определяют полноту смывания с патрона и необходимый для очистки объем элюата.

В круглодонную колбу емкостью 10 см³ отбирают по 1 см³ стандартных растворов валифеналата и его метаболитов с концентрацией 1 мкг/см³. Растворитель удаляют в вакууме. Остаток растворяют в 1 см³ смеси N 4 и переносят на подготовленный патрон (п. 7.2.2). Колбу обмывают 1 см³ смеси N 4 и смыв тоже переносят на патрон. Промывают патрон 5 см³ смеси N 5, элюат отбрасывают. Затем элюируют валифеналат и метаболиты смесью N 6 со скоростью 1 - 2 капли в секунду. Отбирают фракции по 2 см³, упаривают досуха, растворяют в 1 см³ подвижной фазы и анализируют по п. 9.7.

Фракции, содержащие валифеналат и метаболиты, объединяют и вновь анализируют.

Устанавливают уровень вещества в элюате, определяют полноту смывания с патрона и необходимый для очистки объем элюата.

Примечание. Проверку хроматографического поведения веществ на патронах для ТФЭ следует проводить обязательно, поскольку профиль вымывания может изменяться при использовании новой партии патронов и растворителей.

Отбор проб проводится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (N 2051-79 от 21.08.79), а также в соответствии с ГОСТ Р 31861-12 "Вода. Общие требования к отбору проб"; ГОСТ 28168-89 "Почвы. Отбор проб"; ГОСТ 32786-14 "Виноград столовый свежий. Технические условия"; ГОСТ 7194-81 "Картофель свежий. Правила приемки и методы определения качества". Отобранные пробы хранят до анализа в герметичной п/э упаковке в морозильной камере при -18 °C. Пробы картофеля перед анализом, не размораживая, измельчают на терке или в гомогенизаторе.

Пробы ягод винограда хранят до анализа в герметично закрытом двойном полиэтиленовом пакете в морозильной камере при температуре -18 °C в течение 6 месяцев. Пробы виноградного сока хранят до анализа в герметичной таре в морозильной камере при температуре -18 °C в течение месяца, в холодильнике при температуре 0 - 4 °C в стеклянной таре с притертой пробкой в течение недели.

Пробы воды хранят в холодильнике при температуре 0 - 4 °C в герметично закрытой стеклянной таре не более месяца.

Для длительного хранения пробы почвы подсушиваются при комнатной температуре в отсутствие прямого солнечного света. Сухие почвенные образцы могут храниться в течение года. Перед анализом сухую почву доводят до стандартной влажности, просеивают через сито с отверстиями диаметром 1 мм.

Из пробы воды (100 мл), подкисленной до pH 2 муравьиной кислотой, отбирают 10 мл и наносят на подготовленный патрон N 1 (п. 7.2.1). Промывают патрон 3 см³ смеси N 1 и 3 см³ смеси N 2. Элюируют 6 см³ смеси N 3, элюат собирают в круглодонную колбу емкостью 25 см³ и упаривают досуха на ротационном испарителе при температуре не выше 40 °C. Сухой остаток растворяют в 1 см³ подвижной фазы и анализируют по п. 9.7.

Навеску почвы (10 г) помещают в полипропиленовую центрифужную пробирку вместимостью 50 см³, добавляют 3 см³ воды, 8 г безводного сернокислого натрия, 2 г натрия хлористого и 30 см³ ацетонитрила. Пробирку плотно закрывают, помещают в перемешивающее устройство на 10 мин, затем центрифугируют. Экстракт декантируют. Экстракцию повторяют еще раз с 20 см³ ацетонитрила. Из объединенного экстракта отбирают аликвоту, соответствующую 1 г, переносят в круглодонную колбу и упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 40 °C. Сухой остаток подвергают очистке на патроне N 1 по п. 9.5.

Навеску растительного материала (10 г) помещают в полипропиленовую центрифужную пробирку вместимостью 50 см³, добавляют 8 г безводного сернокислого натрия, 2 г натрия хлористого и 30 см³ ацетонитрила. Пробирку плотно закрывают, помещают в перемешивающее устройство на 10 мин, затем центрифугируют. Экстракт декантируют. Экстракцию повторяют еще раз с 20 см³ ацетонитрила. Из объединенного экстракта отбирают аликвоту, соответствующую 1 г, переносят в круглодонную колбу и упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 40 °C. Сухой остаток подвергают очистке на патроне N 2 по п. 9.6.

Из представительной пробы сока отбирают 1 г, добавляют 8 см³ воды, 1 см³ ацетонитрила и наносят на подготовленный патрон N 1 (п. 7.2.1). Промывают патрон 5 см³ смеси N 2. Элюируют валифеналат 5 см³ смеси N 3, элюат собирают в круглодонную колбу емкостью 25 см³ и упаривают досуха на ротационном испарителе при температуре не выше 40 °C. Сухой остаток растворяют в 1 см³ подвижной фазы и анализируют по п. 9.7.

Сухой остаток, полученный по п. 9.2, растворяют в 1 см³ ацетонитрила, добавляют 9 см³ воды и наносят на предварительно кондиционированный патрон (п. 7.2.1). Промывают патрон 3 см³ смеси N 1 и 3 см³ смеси N 2. Элюируют 6 см³ смеси N 3, элюат собирают в круглодонную колбу емкостью 25 см³ и упаривают досуха на ротационном испарителе при температуре не выше 40 °C. Сухой остаток растворяют в 1 см³ подвижной фазы и анализируют по п. 9.7.

Сухой остаток, полученный по п. 9.3, растворяют в 1 см³ смеси N 4 и наносят на предварительно кондиционированный патрон (п. 7.2.2). Колбу ополаскивают еще 1 см³ смеси N 4, который также наносят на патрон. Патрон промывают 6 см³ смеси N 5, элюат отбрасывают. Валифеналат элюируют 5 см³ смеси N 6, элюат собирают, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 40 °C, остаток растворяют в 1 см³ подвижной фазы и анализируют по п. 9.7.

Хромато-масс-спектрометр, состоящий из высокоэффективного жидкостного хроматографа и масс-спектрометра с тройным квадруполем.

Аналитическая колонка, заполненная сорбентом C18 (100 x 2,1) мм, 2,2 мкм. Температура колонки (45 +/- 1) °C. Скорость потока элюента 0,3 см³/мин. Объем вводимой пробы 2 мм³.

Режим элюирования для валифеналата и его метаболитов - градиентный:

Время удерживания 4-хлорбензойной кислоты - (2,7 +/- 0,1) мин; IR-5839 - (3,0 +/- 0,1) мин; валифеналата - (3,5 +/- 0,1) мин.

Режим элюирования для валифеналата - градиентный:

Время удерживания валифеналата - (2,9 +/- 0,1) мин.

Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки. Содержание валифеналата или его метаболитов в пробе (X, мг/кг) вычисляют по формуле:

S_x - площадь пика аналита на хроматограмме испытуемого образца, (усл. ед.);

K - градуировочный коэффициент, найденный на стадии построения соответствующей градуировочной зависимости;

V - объем пробы, подготовленной для хроматографического анализа, см³;

P - навеска анализируемого образца, г.

Содержание остаточных количеств валифеналата или его метаболитов в образце вычисляют как среднее из двух параллельных определений.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор валифеналата или его метаболитов с концентрацией 1,0 мкг/см³, разбавляют подвижной фазой для ВЭЖХ.

Суммарное содержание валифеналата в воде или почве (, мг/дм³ или мг/кг) вычисляют с учетом метаболитов:

X_Val - содержание валифеналата в пробе, мг/дм³ или мг/кг;

X_IR-5839 - содержание IR-5839 в пробе, мг/дм³ или мг/кг;

X_PCBA - содержание PCBA в пробе, мг/дм³ или мг/кг.

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости:

X₁, X₂ - результаты параллельных определений, мг/кг;

r - значение предела повторяемости .

При невыполнении этого условия выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

Результат анализа представляют в виде:

- среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

- граница абсолютной погрешности, мг/кг:

- граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

В случае если содержание компонента меньше нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание вещества в пробе менее нижней границы определения" (например: менее 0,01 мг/кг, где 0,01 мг/кг - предел обнаружения валифеналата в винограде).

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-02 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.

Величина добавки C_д должна удовлетворять условию:

- характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой соответственно), мг/кг, при этом:

- граница абсолютной погрешности, мг/кг:

- граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

Результат контроля процедуры K_к рассчитывают по формуле:

, , C_д - среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки соответственно, мг/кг.

Норматив контроля K рассчитывают по формуле:

Проводят сопоставление результата контроля процедуры (K_к) с нормативом контроля (K).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры к их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):

X₁, X₂ - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;

R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций), %.