"МУК 4.1.3234-14. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств прогексадиона-кальция в зерне и соломе зерновых культур методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 22.12.2014)

1. Разработаны сотрудниками ФБГНУ Всероссийский НИИ защиты растений Федерального агентства научных организаций, Санкт-Петербург, Пушкин (В.И. Долженко, И.А. Цибульская, А.О. Берестецкий, Е.В. Полуэктова).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 6 ноября 2014 г. N 2).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия населения, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 22 декабря 2014 г.

4. Введены впервые.

Свидетельство о метрологической аттестации N 01.5.04.181/01.00043/2014.

Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения массовой концентрации прогексадиона-кальция в зерне зерновых культур в диапазоне концентраций 0,025 - 0,5 мг/кг, в соломе 0,25 - 2,5 мг/кг.

Методические указания носят рекомендательный характер.

Структурная формула:

Кальций 3-оксидо-5-оксо-4-пропионилциклогекса-3-енкарбоксилат (IUPAC).

Молекулярная масса: 250,3.

Брутто формула: C₁₀H₁₀CaO₅.

Химически чистое вещество представляет собой мелкодисперсный белый порошок без запаха.

Температура плавления > 360 °C.

Давление пара 1,33 x 10^-2 мРа (20 °C).

Коэффициент распределения в системе н-октанол-вода K_ow log P = -2,90.

Растворимость в воде (мг/дм³, 20 °C): 174.

Растворимость в органических растворителях (мг/дм³, 20 °C): метанол - 1,11; ацетон - 0,038.

Стабилен в водных растворах (ДТ₅₀ составляет 5 дней при pH 5,0 и температуре 20 °C и 83 дня при pH 9,0). Устойчив к нагреванию до 200 °C и воздействию солнечного света. рКа 5,15.

Краткая токсикологическая характеристика. Острая оральная токсичность для крыс и мышей > 5 000 мг/кг. При подкожном введении крысам LD₅₀ > 2 000 мг/кг. Оказывает слабое раздражающее действие на глаза, но не раздражает кожу (кролики). Ингаляционная токсичность для крыс LD₅₀ составляет 4,21 мг на 1 литр воздуха.

Область применения. Регулятор роста растений. Используется в качестве средства от полегания мелкозерновых злаков. Также может быть использован как замедлитель роста дерна, земляных орехов и цветов или для ингибирования удлинения новых побегов фруктовых деревьев.

В России для прогексадиона-кальция установлены гигиенические нормативы для плодовых семечковых культур - МДУ 0,5 мг/кг.

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1, для соответствующих диапазонов концентраций.

--------------------------------

<*> Соответствует расширенной неопределенности U_ОТН. при коэффициенте охвата k = 2.

Методика основана на определении прогексадиона-кальция по свободной кислоте прогексадиону методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием ультрафиолетового (УФ) детектора после его экстракции из образцов органическим растворителем с последующей очисткой экстрактов на концентрирующих патронах для твердофазной экстракции, заполненных ионообменной смолой.

Идентификация прогексадиона проводится по времени удерживания, количественное определение - методом абсолютной калибровки. Избирательность метода обеспечивается сочетанием условий подготовки проб и хроматографирования.

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Примечание. Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией, не требующих дополнительной очистки растворителей.

Примечание. Допускается применение оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4.1. При проведении работы необходимо соблюдать требования техники безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими, легковоспламеняющимися веществами (ГОСТ 12.1.005, ГОСТ 12.1.007). Организация обучения работников безопасности труда по ГОСТ 12.0.004.

При выполнении измерений с использованием жидкостного хроматографа и работе с электроустановками необходимо соблюдать правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 и инструкциями по эксплуатации приборов.

4.2. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией, соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 "Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны".

Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист-химик, имеющий опыт работы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, ознакомленный с руководством по эксплуатации хроматографа, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 13.

При выполнении измерений выполняют следующие условия:

процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C и относительной влажности не более 80%;

выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Перед началом работы аналитическую колонку кондиционируют в потоке подвижной фазы (0,3 см³/мин) до стабилизации нулевой линии.

7.2.1. Приготовление 0,005 М раствора ортофосфорной кислоты: в мерную колбу вместимостью 1 дм³ помещают 200 см³ воды для лабораторного анализа, прибавляют 0,5 г 98%-й ортофосфорной кислоты и доводят объем до метки водой.

7.2.2. Приготовление подвижной фазы: в мерную колбу вместимостью 1 дм³ помещают 250 см³ ацетонитрила и доводят объем до метки раствором 0,005 М ортофосфорной кислоты.

7.2.3. Приготовление 2,5 М раствора серной кислоты.

В мерную колбу объемом 1 дм³ добавляют 800 см³ бидистиллированной воды, 141,24 см³ серной кислоты и доводят до метки бидистиллированной водой.

7.2.4. Экстракционная смесь.

В мерную колбу объемом 1 дм³ помещают 990 см³ ацетонитрила и добавляют 10 см³ 2,5 М раствора серной кислоты.

7.2.5. Приготовление 5%-го раствора фосфорнокислого натрия.

В мерную колбу объемом 1 дм³ помещают 50 г натрия фосфорнокислого 1-замещенного 2-водного, растворяют при перемешивании в 600 см³ дистиллированной воды и доводят объем раствора до метки.

7.2.6. Приготовление 10 М раствора ортофосфорной кислоты.

В мерную колбу объемом 200 см³ добавляют 95,18 см³ бидистиллированной воды, затем осторожно добавляют 104,82 см³ концентрированной ортофосфорной кислоты.

7.2.7. Приготовление насыщенного раствора хлорида натрия.

В мерную колбу объемом 1 дм³ помещают 320 г кристаллического хлористого натрия, растворяют при перемешивании в 600 см³ бидистиллированной воды и доводят объем раствора до метки.

7.2.8. Приготовление 0,1 н раствора гидроксида натрия.

В мерную колбу объемом 1 дм³ помещают 4 г кристаллического гидроксида натрия и растворяют при перемешивании в 800 см³ бидистиллированной воды, доводя объем раствора до метки.

7.2.9. Приготовление элюента N 1 (метанол - 0,1 н гидроксид натрия в соотношении 20:80).

В мерной колбе объемом 100 см³ смешивают 20 см³ метанола и 80 см³ 0,1 н раствора гидроксида натрия. Полученную смесь перемешивают.

7.2.10. Приготовление элюента N 2 (1%-й водный раствор муравьиной кислоты).

В мерную колбу объемом 1 дм³ помещают 990 см³ бидистиллированной воды и добавляют 10 см³ муравьиной кислоты при перемешивании.

7.2.11. Приготовление 50%-го раствора метанола.

В мерную колбу объемом 100 см³ вносят 50 см³ метанола и доводят до метки бидистиллированной водой, полученную смесь перемешивают.

7.2.12. Приготовление элюента N 3 (1%-й раствор муравьиной кислоты в 50%-ом метаноле).

В мерную колбу объемом 100 см³ помещают 99 см³ смеси метанол-вода в соотношении 50:50 по объему и добавляют 1 см³ муравьиной кислоты.

7.2.13. Приготовление элюента N 4 (1%-й раствор муравьиной кислоты в метаноле).

В мерную колбу вместимостью 100 см³ добавляют 99 см³ метанола и при перемешивании добавляют 1 см³ муравьиной кислоты.

7.3.1. Основной раствор с концентрацией 0,1 мг/см³: точную навеску прогексадиона (10 +/- 0,1 мг) помещают в мерную колбу вместимостью 100 см³, растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки тем же растворителем.

Градуировочные растворы с концентрациями 0,125, 0,25, 0,5, 1,0 и 2,5 мкг/см³ готовят методом последовательного разбавления по объему, используя раствор подвижной фазы.

7.3.2. Раствор N 1 с концентрацией 2,5 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 100 см³ вносят 2,5 см³ основного раствора и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.3.3. Раствор N 2 с концентрацией 1,0 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 100 см³ вносят 1,0 см³ основного раствора и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.3.4. Раствор N 3 с концентрацией 0,5 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 5,0 см³ раствора N 2 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.3.5. Раствор N 4 с концентрацией 0,25 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 5,0 см³ раствора N 3 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.3.6. Раствор N 5 с концентрацией 0,125 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 5,0 см³ раствора N 4 и доводят объем до метки подвижной фазой.

Основной раствор можно хранить в холодильнике при температуре 0 - 4 °C в течение 4 недель, градуировочные растворы - в течение суток.

При изучении полноты определения для внесения в матрицу используют ацетонитрильные растворы прогексадиона с концентрациями 1,0 и 10,0 мкг/см³, которые готовят из основного стандартного раствора (п. 7.3.1) с концентрацией 0,1 мг/см³ методом последовательного разбавления ацетонитрилом.

Для установления градуировочной характеристики (площадь пика - концентрация прогексадиона в растворе) в хроматограф вводят по 10 мм³ градуировочных растворов (не менее 3 параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4 точек по диапазону измеряемых концентраций). Затем измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации прогексадиона в градуировочном растворе.

Методом наименьших квадратов рассчитывают градуировочный коэффициент (K) в уравнении линейной регрессии:

где S - площадь пика градуировочного раствора.

Градуировку признают удовлетворительной, если значение коэффициента линейной корреляции оказывается не ниже 0,99.

Градуировочную характеристику необходимо проверять при замене реактивов, хроматографической колонки или элементов хроматографической системы, а также при отрицательном результате контроля градуировочного коэффициента.

Градуировочную зависимость признают стабильной при выполнении следующего условия:

где C - аттестованное значение массовой концентрации прогексадиона в градуировочном растворе,

C_к - результат контрольного измерения массовой концентрации прогексадиона в градуировочном растворе,

- норматив контроля градуировочного коэффициента, %. ( при P = 0,95).

Патрон промывают 10 см³ 1%-го раствора муравьиной кислоты в метаноле и подсушивают током воздуха. Затем патроны последовательно промывают 5 см³ метанола и 5 см³ воды. Нельзя допускать высыхания верхнего слоя сорбента.

Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (N 2051-79 от 21.08.79), а также в соответствии с ГОСТ Р 50436-92 (ИСО 950-79) "Зерновые. Отбор проб зерна". Пробы зерна и соломы для определения остатков прогексадиона в урожае хранят в бумажной или тканевой упаковке при комнатной температуре. Перед анализом пробы зерна доводят до стандартной влажности и измельчают.

Образец измельченного зерна массой (5 +/- 0,1) г или соломы массой (1 +/- 0,1) г помещают в центрифужные пробирки вместимостью 50 см³, добавляют 35 см³ экстракционной смеси, приготовленной по п. 7.2.4, интенсивно перемешивают в течение 10 мин и центрифугируют при 4 000 об./мин в течение 5 мин. Надосадочную жидкость декантируют и переносят в испарительную колбу объемом 250 см³. Экстракцию повторяют дважды с 35 и 30 см³ смеси, после чего объединенный экстракт упаривают на роторном испарителе при температуре бани не выше 45 °C до объема 10 см³.

К полученному экстракту добавляют 50 см³ 5%-го раствора дигидрофосфата натрия и переносят в делительную воронку. Испарительную колбу обмывают 50 см³ новой порции 5%-го раствора дигидрофосфата натрия и переносят в ту же делительную воронку. Затем в нее добавляют 50 см³ н-гексана и встряхивают несколько минут. Водный слой отделяют (органический - отбрасывают) и доводят до pH 3 с помощью 10 М ортофосфорной кислоты, после чего добавляют 30 см³ насыщенного раствора хлорида натрия. Прогексадион переэкстрагируют дважды хлористым метиленом порциями по 50 см³, встряхивая делительную воронку в течение 2 - 3 мин. Органическую фазу фильтруют через слой безводного сульфата натрия (2 г) в испарительную колбу объемом 250 см³, осушитель промывают 10 - 15 см³ хлористого метилена и вносят в ту же испарительную колбу. Полученный раствор выпаривают досуха на роторном испарителе при температуре не выше 40 °C.

Остаток в колбе, полученный при упаривании экстрактов зерна или соломы, растворяют в 10 см³ 0,1 н раствора гидроксида натрия, помещая образцы в ультразвуковую ванну на 2 - 3 мин. Раствор вносят в кондиционированный анионообменный патрон со скоростью пропускания раствора 1 - 2 капли в секунду. После нанесения раствора патрон промывают 10 см³ 0,1 н раствора гидроксида натрия, элюат отбрасывают. Затем патрон промывают последовательно 10 см³ элюента N 1 и 10 см³ метанола, элюат отбрасывают. Патрон подсушивают током воздуха. После этого патрон последовательно промывают по 10 см³ элюентов N 2 и 3. Патрон подсушивают током воздуха, после чего прогексадион элюируют 10 см³ элюента N 4. Элюат упаривают на роторном испарителе при температуре не выше 45 °C. Сухой остаток растворяют в 2 см³ подвижной фазы для ВЭЖХ (приготовленной по п. 7.2.2) и анализируют на содержание прогексадиона. 10 мм³ полученного раствора вводят в хроматограф.

Жидкостный хроматограф с быстросканирующим УФ-детектором. Элюирование в системе ацетонитрил - 0,005 М ортофосфорная кислота в соотношении 25:75 по объему. Скорость потока 0,3 см³/мин. Дозируемый объем 10 мм³. Колонка, заполненная сорбентом с привитой фазой, включающей гидрофильную карбаматную группу в цепи С18, (100 x 2,1) мм, 1,7 мкм. Температура колонки 40 °C. Детектирование на длине волны 275 нм. Время удерживания прогексадиона 2,65 +/- 0,055 мин. Линейный диапазон детектирования сохраняется в интервале концентраций 0,125 - 2,5 мкг/см³.

Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки. Содержание прогексадиона-кальция в зерне (или соломе) X (мг/кг) вычисляют по формуле:

где S_x - площадь пика прогексадиона на хроматограмме испытуемого образца, (AU-сек);

K - градуировочный коэффициент, найденный на стадии построения соответствующей градуировочной зависимости;

V - объем пробы, подготовленной для хроматографического анализа, см³;

P - навеска (объем воды) анализируемого образца, г (см³);

f - полнота извлечения прогексадиона, приведенная в табл. 2;

F - фактор пересчета содержания прогексадиона в его кальциевую соль (250,3/212,2 = 1,18).

Содержание остаточных количеств прогексадиона-кальция в образце вычисляют как среднее из двух параллельных определений.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор прогексадиона с концентрацией 2,5 мкг/см³, разбавляют подвижной фазой для ВЭЖХ.

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

где X₁, X₂ - результаты параллельных определений, мг/кг;

r - значение предела повторяемости .

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

Результат анализа представляют в виде:

где - среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

- граница абсолютной погрешности, мг/кг;

- граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

В случае, если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание вещества в пробе "менее нижней границы определения" (например: менее 0,05 мг/кг*, где * - 0,05 мг/кг - предел обнаружения прогексадиона-кальция в зерне).

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1 - 6-02 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.

Величина добавки C_д должна удовлетворять условию:

где - характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой, соответственно), мг/кг; при этом:

где - граница абсолютной погрешности, мг/кг:

где - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

Результат контроля процедуры K_к рассчитывают по формуле:

где X', X, C_д - среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки, соответственно, мг/кг.

Норматив контроля K рассчитывают по формуле:

Проводят сопоставление результата контроля процедуры (K_к) с нормативом контроля (K).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры к их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):

где X₁, X₂ - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;

R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций), %.