"МУК 4.1.3449-17. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Измерение остаточного содержания глюфосината аммония и его метаболита 3-метилфосфино-пропионовой кислоты в семенах и масле сои методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с тандемным масс-спектрометрическим детектированием. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 14.03.2017)

1. Разработаны сотрудниками ФГБУ "Федеральный центр оценки безопасности и качества зерна и продуктов его переработки" (В.Л. Сухова, Н.И. Добрева, С.Д. Добрев).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 22 декабря 2016 г. N 2).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 14 марта 2017 г.

4. Введены впервые.

Свидетельство об аттестации N 01.00225/205-8-16.

Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии с тандемным масс-спектрометрическим детектированием (ВЭЖХ-МС/МС) для определения массовой доли глюфосината аммония и его основного метаболита 3-метилфосфино-пропионовой кислоты в семенах и масле сои в диапазоне измерений 0,02 - 6 мг/кг.

Методические указания носят рекомендательный характер.

Глюфосинат аммония (ГФА)

Аммоний DL-гомоаланин-4-ил-(метил)-фосфинат

C₅H₁₅N₂O₄P

Молекулярная масса: 198,16.

Кристаллический порошок со слабым специфическим запахом. Температура плавления: 215 °C. Давление паров при 20 °C: менее 0,1 МПа. Растворимость (г/дм³) при 20 °C: вода - 1 370; ацетон - 0,16; этанол - 0,65; этилацетат - 0,14; толуол - 0,14; гексан - 0,2. Вещество стабильно при нормальных условиях хранения, в умеренно кислых и щелочных средах. Коэффициент распределения н-октанол/вода K_ow log P < 0,1.

Краткая токсикологическая характеристика. Острая пероральная токсичность (LD₅₀) для крыс составляет 1 620 - 2 000 млн^-1 (мг/кг); острая ингаляционная токсичность (LC₅₀) для крыс - 1,26 - 2,9 мг/м³ воздуха (аэрозоль). LC₅₀ для рыб - 710 мг/дм³ (96 ч).

Глюфосинат аммония не обладает тератогенным, канцерогенным и мутагенным действием. Он нетоксичен для водорослей, дафний, дождевых червей, пчел, птиц и диких животных.

Область применения препарата. Глюфосинат аммоний - неселективный контактный гербицид с ограниченной системностью, передвигающийся только внутри обработанных листьев. В процессе поступления в растение вещество диссоциирует и в клетках присутствует только глюфосинат свободная кислота. Гербицид используется для уничтожения однолетних и многолетних широколистных и злаковых сорняков в парах, посадках плодовых и цитрусовых культур, ягодных кустарниках и виноградниках путем направленного опрыскивания в период активного роста сорных растений, а также на овощных культурах при довсходовом применении препарата. Применяется в России в качестве десиканта на посевах гороха, подсолнечника, сои, рапса, люцерны и льна-долгунца при норме расхода от 0,15 до 0,35 кг д.в./га.

Глюфосинат аммоний в воде и растениях подвергается разрушению, в результате чего образуется 3-метилфосфино-пропионовая кислота.

3-метилфосфино-пропионовая кислота (МФПК)

C₄H₉O₄P

Молекулярная масса: 152,09.

Белый кристаллический порошок. Температура плавления: 288 - 291 °C. Растворим в воде и метаноле.

МДУ глюфосината аммония в РФ согласно ГН 1.2.3111-13: плодовые семечковые и косточковые, ягоды и другие мелкие фрукты (кроме смородины), цитрусовые, виноград, морковь - 0,2; картофель - 0,5; подсолнечник (семена), рапс (зерно) - 5,0; гречиха, просо, зерно хлебных злаков - 0,4; растительные масла (кроме нерафинированных рапсового и подсолнечного масла) - 0,4; зернобобовые - 3,0; миндаль неочищенный, смородина (черная, красная и белая) - 0,5 <*^,**>; спаржа, тропические и субтропические фрукты (кроме бананов), корн-салат, яйца, мясо млекопитающих (кроме морских животных), лук-репка, сахарная свекла, мясо птицы, нерафинированные рапсовое и подсолнечное масло - 0,05 <*^,**>; бананы - 0,2 <*^,**>; субпродукты пищевых млекопитающих и птицы, кукуруза, древесные орехи - 0,1 <*^,**>; молоко - 0,02 <*^,**>.

--------------------------------

<*^,**> - ВМДУ для импортируемой продукции.

При соблюдении всех регламентированных условий и проведении анализа в точном соответствии с данной методикой значение погрешности (и ее составляющих) результатов измерений не превышает значений, приведенных в табл. 1.

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для всего диапазона измерений (n = 20) приведены в табл. 2.

Методика основана на определении ГФА и его метаболита МФПК с помощью ионообменной высокоэффективной жидкостной хроматографии с тандемным масс-спектрометрическим квадрупольным детектором (ВЭЖХ-МС/МС) после экстракции веществ из анализируемых образцов подкисленным метанолом и очистке экстрактов от механических примесей.

Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки.

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Примечание. Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией.

Примечание. Допускается использование вспомогательных средств измерений, устройств и материалов с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ Р 12.1.019-09, а также требования, изложенные в технической документации на систему жидкостной хроматографии.

4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и ГН 2.2.5.2308-07. Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004-90.

Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист, имеющий опыт работы на жидкостном хроматографе с тандемным масс-спектрометрическим детектированием, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений.

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C и относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на системе жидкостной хроматографии с тандемным масс-спектрометрическим детектированием проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Измерениям предшествуют следующие операции: подготовка, приготовление градуировочных растворов, подвижной фазы для ВЭЖХ, кондиционирование хроматографической колонки, установление градуировочной характеристики, приготовление смесей растворителей для экстракции.

Перед анализом посуду обрабатывают деионизированной водой не менее двух раз и сушат при температуре (200 +/- 10) °C. Не рекомендуется менять емкости для хранения элюентов с целью избежать повышения содержания ионов натрия.

7.2.1. Приготовление водного раствора лимоннокислого аммония (концентрация 1 моль/дм³). В мерную колбу вместимостью 50 см³ помещают навеску (12,16 +/- 0,01) г лимоннокислого аммония, добавляют 30 - 35 см³ деионизированной воды, перемешивают до полного растворения (при необходимости - с помощью ультразвуковой бани), раствор охлаждают до комнатной температуры, доводят объем водой до метки, перемешивают. Срок хранения - 3 месяца при температуре 4 - 8 °C.

7.2.2. Приготовление подвижной фазы для ВЭЖХ - элюент B. В мерную колбу вместимостью 500 см³ помещают 300 - 350 см³ деионизированной воды, вносят 500 мм³ раствора лимоннокислого аммония с молярной концентрацией 1 моль/дм³ (п. 7.2.1), доводят объем до метки, перемешивают, профильтровывают через мембранный фильтр. Срок хранения - 2 недели.

7.2.3. Приготовление раствора тетрабората натрия (концентрация 0,1 моль/дм³). В мерную колбу вместимостью 200 см³ помещают (7,62 +/- 0,01) г десятиводного тетрабората натрия, добавляют 160 - 180 см³ деионизированной воды, перемешивают до полного растворения (при необходимости - с помощью ультразвуковой бани), охлаждают, доводят водой до метки, перемешивают, отфильтровывают через мембранный фильтр. Срок хранения - 1 месяц.

7.2.4. Приготовление раствора гидроксида натрия (концентрация 0,03 моль/дм³). В мерную колбу вместимостью 200 см³ помещают (0,24 +/- 0,01) г гидроксида натрия, добавляют 160 - 180 см³ деионизированной воды, перемешивают до полного растворения (при необходимости - с помощью ультразвуковой бани), охлаждают, доводят объем водой до метки, перемешивают, отфильтровывают через мембранный фильтр. Раствор хранят в герметичной посуде при комнатной температуре. Срок хранения - 1 месяц.

7.2.5. Приготовление смеси растворителей вода-метанол для приготовления исходного градуировочного раствора ГФА (объемное соотношение 2:1). В коническую колбу вместимостью 50 см³ с помощью мерного цилиндра последовательно приливают 20 см³ деионизированной воды и 10 см³ метанола. Перемешивают и охлаждают до комнатной температуры. Смесь готовят непосредственно перед приготовлением градуировочного раствора ГФА.

7.2.6. Приготовление раствора для экстракции (смесь муравьиная кислота-метанол, объемное соотношение 1:100). В мерную колбу вместимостью 1 000 см³ наливают 300 - 400 см³ метанола. Добавляют 10 см³ муравьиной кислоты. Объем доводят до метки, перемешивают. Раствор хранят в герметичной посуде при комнатной температуре. Срок хранения - 3 месяца.

Кондиционирование хроматографических колонок проводят после длительного хранения и после продолжительной работы (100 - 200 последовательных вводов).

7.3.1.1. Колонки промывают раствором гидроксида натрия с молярной концентрацией 0,03 моль/дм³ со скоростью подачи раствора 0,2 см³/мин в течение 60 - 90 минут.

7.3.1.2. Колонки промывают элюентом A (деионизированной водой) со скоростью подачи подвижной фазы 0,2 см³/мин в течение 45 - 60 минут.

7.3.1.3. Устанавливают колонки в хроматографическую систему и запускают ее на полный режим градиента по п. 9.2. Проводят 3 - 4 последовательных ввода градуировочных растворов.

ВНИМАНИЕ! При выполнении операций 7.3.1.1 и 7.3.1.2 поток элюентов не должен поступать в масс-спектрометр.

Промывку проводят при загрязнении колонки и предколонки, выражающемся в поднятии давления в начале анализа свыше 1 600 psi (110 bar).

7.3.2.1. Колонки промывают обратным током деионизированной водой (элюент A) со скоростью подачи подвижной фазы 0,1 - 0,15 см³/мин в течение 60 - 90 минут. В процессе промывания колонки и предколонки постоянно контролируют давление.

7.3.2.2. Колонки промывают обратным током метанолом (либо ацетонитрилом) со скоростью подачи растворителя 0,2 см³/мин в течение 60 минут.

7.3.2.3. Колонки промывают обратным током деионизированной водой (элюент A) со скоростью подачи подвижной фазы 0,2 см³/мин в течение 45 - 60 минут.

7.3.2.4. Устанавливают колонки в хроматографическую систему и запускают ее на полный режим градиента по п. 9.2. Проводят 1 - 2 последовательных ввода градуировочных растворов или метанола.

ВНИМАНИЕ! При выполнении операций 7.3.2.1, 7.3.2.2 и 7.3.2.3 поток элюентов не должен поступать в масс-спектрометр.

Консервацию колонок проводят при остановке работы на продолжительный период времени (более двух недель).

7.3.3.1. Колонку и предколонку промывают обратным током деионизированной водой со скоростью подачи подвижной фазы 0,1 - 0,15 см³/мин в течение 60 - 90 минут. В процессе промывки контролируют давление.

7.3.3.2. Колонки промывают обратным током метанолом (либо ацетонитрилом) со скоростью подачи растворителя 0,2 см³/мин в течение 60 минут.

7.3.3.3. Колонки промывают деионизированной водой со скоростью подачи 0,2 см³/мин в течение 45 - 60 минут.

7.3.3.4. Колонку и предколонку промывают раствором тетрабората натрия с молярной концентрацией 0,1 моль/дм³ со скоростью подачи раствора 0,2 см³/мин в течение 45 - 60 минут.

7.3.3.5. Колонку и предколонку хранят под раствором тетрабората натрия с молярной концентрацией 0,1 моль/дм³.

Примечание. Условия 7.3.3.4 и 7.3.3.5 относятся только к конкретному виду колонок, указанному в п. 3.3. В случае использования аналогов, консервацию колонки и предколонки проводят с учетом рекомендаций фирмы-производителя.

ВНИМАНИЕ! При проведении операций по консервации колонок поток элюентов не должен поступать в масс-спектрометр.

7.4.1.1. Основной раствор ГФА (концентрация 1 000 мкг/см³). В мерную колбу вместимостью 25 см³ помещают (0,025 +/- 0,001) г ГФА, добавляют 15 - 20 см³ смеси вода-метанол (п. 7.2.5), перемешивают и доводят объем до метки этим же растворителем, вновь перемешивают. Раствор хранят в холодильнике при температуре (4 - 6) °C в течение 3 месяцев.

7.4.1.2. Основной раствор МФПК (концентрация 100 мкг/см³). В мерную колбу вместимостью 50 см³ помещают (0,005 +/- 0,001) г МФПК, добавляют 30 - 40 см³ ацетонитрила, перемешивают (при необходимости - с помощью ультразвуковой бани), охлаждают, доводят до метки этим же растворителем, вновь перемешивают. Раствор хранят в холодильнике при температуре (4 - 6) °C в течение 3 месяцев.

7.4.2.1. Исходный раствор N 1 (концентрация 10 мкг/см³). В мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 0,1 см³ ГФА (п. 7.4.1.1) и 1 см³ раствора МФПК (п. 7.4.1.2). Разбавляют до метки раствором для экстракции (п. 7.2.6), перемешивают. Раствор хранят в холодильнике при температуре (4 - 6) °C не более одного месяца.

7.4.2.2. Исходный раствор N 2 (концентрация 1 мкг/см³). В мерную колбу вместимостью 5 см³ помещают 0,5 см³ раствора N 1 (п. 7.4.2.1). Доводят до метки раствором для экстракции (п. 7.2.6), перемешивают. Раствор хранят в холодильнике при температуре 4 - 6 °C не более одной недели.

7.4.2.3. Рабочие растворы N 3 - 8 для градуировки (концентрация каждого вещества по 0,01 - 0,5 мкг/см³). В 4 мерные колбы вместимостью 5 см³ помещают по 0,05 см³, 0,125 см³, 0,25 см³ и 0,5 см³ исходного раствора N 2 (п. 7.4.2.2), доводят до метки раствором для экстракции (п. 7.2.6), тщательно перемешивают, получают рабочие растворы N 3 - 6 с концентрацией ГФА и МФПК по 0,01; 0,025; 0,05 и 0,1 мкг/см³ соответственно.

В 2 мерные колбы вместимостью 5 см³ помещают 0,1 см³ и 0,25 см³ исходного раствора N 1 (п. 7.4.2.1), доводят до метки раствором для экстракции (п. 7.2.6), тщательно перемешивают, получают градуировочные растворы N 7 и 8 концентрацией ФГА и МФПК по 0,2 мкг/см³ и 0,5 мкг/см³ соответственно.

Градуировочные растворы N 3 - 8 готовят непосредственно перед использованием.

Градуировочную характеристику по каждому анализу, выражающую зависимость площади пика (УЕИ·с) от массовой концентрации ГФА и МФПК в растворе (мкг/см³), устанавливают методом абсолютной градуировки по 6 градуировочным растворам N 3 - 8 (п. 7.4.2.3).

В инжектор хроматографа вводят 10 мм³ каждого градуировочного раствора N 3 - 8 и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.2. Осуществляют не менее 2 параллельных измерений. По полученным данным строят градуировочную характеристику.

Отбор проб проводят в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (N 2051-79 от 21.08.79) и правилами, определенными ГОСТ 17109-88 "Соя. Требования при заготовках и поставках".

Семена подсушивают в темноте до постоянного веса и хранят в тканевых мешочках в сухом, защищенном от света месте при комнатной температуре не более 6 месяцев. Пробы масла (помещенные в стеклянные флаконы) хранят в холодильнике в течение 3 месяцев. Для длительного хранения измельченные пробы зерна (аналитические образцы массой 20 г) замораживают и хранят при температуре -18 °C.

Образец измельченной пробы массой 5 г помещают в центрифужную пробирку вместимостью 50 см³, добавляют 10 см³ раствора для экстракции (п. 7.2.6), интенсивно встряхивают (до полного смачивания пробы), помещают на аппарат для встряхивания на 60 минут. Далее пробирки с пробами помещают в центрифугу и центрифугируют 5 минут при 3 000 об./мин. Отбирают надосадочную жидкость, фильтруют и анализируют на содержание ГФА и МФПК по п. 9.2.

Измерения проводят при следующих режимных параметрах хроматографической системы.

Жидкостный хроматограф, состоящий из дегазатора, автосамплера, бинарного насоса, термостата, совмещенный с масс-спектрометрической системой - тройной квадруполь (ВЭЖХ-МС/МС).

Разделительная ионообменная хроматографическая колонка стальная, заполненная анионообменной смолой длиной 250 мм, внутренним диаметром 2,0 мм.

Ионообменная предколонка стальная, заполненная анионообменной смолой, длиной 50 мм, внутренним диаметром 2,0 мм.

Температура колонок: 40 °C.

Режим элюирования - градиентный.

Элюент A: вода деионизированная.

Элюент B: 1 мМоль водный раствор трехзамещенного цитрата аммония по п. 7.2.2.

Градиент:

Объем вводимой пробы: 10 мм³.

Условия детектирования:

Детектор: квадрупольный тандемный масс-спектрометр.

Тип ионизации: Электроспрей - отрицательный режим.

Тип сканирования: Множественный мониторинг реакций (ММР).

Масс-спектрометрические (МС/МС) параметры для определения ГФА и его метаболита МФПК:

Каждый экстракт хроматографируют дважды.

Устанавливают площади пиков вещества (УЕИ·с), находят среднее значение, с помощью градуировочной характеристики, определяют концентрацию ГФА и МФПК в хроматографируемом растворе.

Экстракты образцов, при анализе которых площадь пиков больше, чем площадь пика градуировочного раствора N 8 с концентрацией 0,5 мкг/см³, разбавляют раствором для экстракции по п. 7.2.6, но не более чем в 10 раз.

Для обработки результатов хроматографического анализа используют программу сбора и обработки хроматографической информации прибора.

Содержание глюфосинат аммония в пробах семян и масла сои с учетом его основного метаболита 3-метилфосфино-пропионовой кислоты в эквиваленте действующего вещества (X, мг/кг) рассчитывают по формуле:

где A, B - концентрации глюфосинат аммония и 3-метилфосфино-пропионовой кислоты соответственно, найденные по градуировочным графикам в соответствии с величинами площадей хроматографических пиков, мкг/см³;

V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, см³;

m - масса анализируемого образца, г;

K - коэффициент разведения пробы (п. 9.2);

e - полнота извлечения, учитывающая все процедуры подготовки пробы (табл. 2).

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, если выполняется условие приемлемости

где X₁, X₂ - результаты параллельных определений массовой доли ГФА (МФПК), млн^-1 (мг/кг);

r - значение предела повторяемости, % (табл. 1).

Если условие (2) не выполняется, выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и повторяют выполнение измерений в соответствии с требованиями методики измерений.

Результат анализа представляют в виде:

где - среднее арифметическое значение результатов n определений, признанных приемлемыми, млн^-1 (мг/кг);

- границы относительной погрешности измерений, % (табл. 1).

В случае если полученный результат измерений менее нижней границы диапазона измерений, то результат анализа представляют в виде:

13.1. Контроль стабильности градуировочной характеристики.

Контроль стабильности градуировки по каждому из анализируемых компонентов проводят перед каждой серией измерений, анализируя три свежеприготовленных градуировочных раствора N 3, 5, 7 (0,01 мкг/см³; 0,05 мкг/см³; 0,2 мкг/см³), а также при смене реактивов или изменении условий анализа.

Для контроля стабильности используют вновь приготовленные градуировочные растворы с массовой концентрацией анализируемых компонентов в начале, середине и в конце диапазона измерений, которые анализируют в точном соответствии с методикой.

Градуировочную характеристику считают стабильной, если для каждого контрольного образца выполняется условие:

где S_изм, S_гр - значение площади пика ГФА и МФПК в образце для контроля, измеренное и найденное по градуировочной характеристике соответственно, УЕИ·с;

К_гр - норматив контроля, ;

- границы относительной погрешности, % (табл. 1).

Если условие стабильности не выполняется только для одного образца, то повторно анализируют этот образец для исключения результата, содержащего грубую ошибку.

Если градуировка нестабильна, выясняют причины нестабильности и повторяют контроль стабильности с использованием других образцов для градуировки, предусмотренных методикой. При повторном обнаружении нестабильности градуировки прибор градуируют заново.

13.2. Внутрилабораторный оперативный контроль.

Контроль качества результатов измерений в лаборатории при реализации методики проводят по ГОСТ Р ИСО 5725-6-02 ("Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений"), используя контроль стабильности среднеквадратического (стандартного) отклонения повторяемости по п. 6.2.2 ГОСТ Р ИСО 5725-6-02 и показателя правильности по п. 6.2.4 ГОСТ Р ИСО 5725-6-02. Проверку стабильности выполняют с применением контрольных карт Шухарта.

Периодичность контроля стабильности результатов выполнения измерений регламентируют в руководстве по качеству лаборатории.

Рекомендуется устанавливать контролируемый период так, чтобы количество результатов контрольных измерений было от 20 до 30.

При неудовлетворительных результатах контроля, например, при превышении предела действия или регулярном превышении предела предупреждения, выясняют причины этих отклонений, в том числе проводят смену реактивов, проверяют работу оператора.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений.

Проверку приемлемости результатов измерений в условиях воспроизводимости проводят:

а) при возникновении спорных ситуаций между двумя лабораториями;

б) при проверке совместимости результатов измерений, полученных при сличительных испытаниях (при проведении аккредитации лабораторий и инспекционного контроля).

Для проведения проверки приемлемости результатов измерений в условиях воспроизводимости каждая лаборатория использует пробы, оставленные на хранение.

Приемлемость результатов измерений, полученных в двух лабораториях, оценивают сравнением разности этих результатов с критической разностью CD_0,95 по формуле:

где C_ср1, C_ср2 - средние значения массовой доли ГФА (МФПК), полученные в первой и второй лабораториях, млн^-1 (мг/кг);

CD_0,95 - значение критической разности, % (табл. 1).

Если критическая разность не превышена, то приемлемы оба результата измерений, проводимых двумя лабораториями, и в качестве окончательного результата используют их среднеарифметическое значение. Если критическая разность превышена, то выполняют процедуры, изложенные в ГОСТ Р ИСО 5725-6-02 (п. 5.3.3).

При разногласиях руководствуются ГОСТ Р ИСО 5725-6-02 (п. 5.3.4).