"МУК 4.2.3256-14. 4.2. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Микробиологическое измерение концентрации клеток микроорганизма Yarrowia lipolytica 2kp ВКПМ Y-4043 в воздухе рабочей зоны. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 30.12.2014)

1. Разработаны и подготовлены ГБОУ ВПО "Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова" Минздрава России (д.б.н. Н.И. Шеина).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 6 ноября 2014 г. N 2).

3. Утверждены руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 30 декабря 2014 г.

4. Введены впервые.

Сборник методических указаний "Измерение концентраций штаммов микроорганизмов в воздухе рабочей зоны" (выпуск 2) разработан с целью обеспечения контроля соответствия фактических концентраций микроорганизмов их предельно допустимым концентрациям (ПДК), что является обязательным при осуществлении санитарно-эпидемиологического контроля.

Включенные в данный список методические указания по контролю биотехнологических штаммов в воздухе рабочей зоны разработаны в соответствии с требованиями ГОСТ 12.1.005-88 "ССТБ. Воздух рабочей зоны. Общие санитарно-гигиенические требования" и ГОСТ 8.563-96 ГСИ. "Методики выполнения измерений".

Методики выполнены с использованием современных и адекватных микробиологических методов исследования и позволяют контролировать концентрации биотехнологических штаммов на уровне и ниже их ПДК в воздухе рабочей зоны, установленных в гигиенических нормативах.

Методические указания по измерению концентраций штаммов микроорганизмов в воздухе рабочей зоны предназначены для лабораторий центров гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, санитарномикробиологических лабораторий промышленных предприятий, а также для научно-исследовательских институтов и других заинтересованных министерств и ведомств, аккредитованных в установленном порядке на право проведения микробиологических исследований, для осуществления контроля за содержанием штаммов в воздухе рабочей зоны.

1.1. Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода микробиологического количественного анализа концентрации Y. lipolytica 2kp ВКПМ Y-4043 в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 50 до 5 000 клеток в 1 м³ воздуха.

1.2. Методические указания носят рекомендательный характер.

Дрожжевая культура Yarrowia lipolytica 2kp выделена из загрязненных нефтепродуктами воды/стоков Московской области, природный изолят. Штамм отобран по способности эффективно снижать содержание нефти в загрязненной ею воде, песке и почвах. Растет на средах с гексадеканом и нефтью в качестве единственных источников углерода. Является компонентом биопрепарата по биоремедиации почв, грунтов, водоемов и стоков от нефти и нефтепродуктов.

По результатам проведенного анализа нуклеотидной последовательности, кодирующей часть 18S рРНК исследуемого штамма, установлено, что исследуемый штамм - Yarrowia lipolytica (98%).

Аэроб. Способен к росту на средах, содержащих источники углерода.

Мезофил. Рост очень хороший - через 24 ч при 25 - 28 °C образует колонии на глюкозо-пептонном агаре (ГПА). При температуре 42 °C не растет. Выдерживает концентрации хлорида натрия до 1% и немного более.

Штамм растет на агаризованных средах - глюкозо-пептонном агаре (ГПА), мясо-пептонном агаре (МПА), АГВ-среде, картофельном агаре (КА). Можно культивировать в LB-бульоне, на LB-агаре и глюкозо-пептонной среде (ГПС).

На ГПА на 1 - 2-е сутки вырастают колонии белого цвета, сухие, круглые, поднимающиеся над агаром. Края колонии ровные, у старой культуры возможно образование складок и концентрических кругов различной плотности. Максимальный диаметр - 10 - 12 мм.

Клетки круглые, эллипсоидные или удлиненные. Бесполое размножение - многосторонним почкованием на узком основании. Образуется псевдомицелий или истинный мицелий, который может иногда распадаться на артроспоры. Аски не конъюгативные, образуются из диплоидных клеток гиф. Оболочка аска быстро растворяется. В аске 1 - 4 аскоспоры, шаровидные, полусферические или шляповидные.

Способен расти в присутствии циклогексимида, обладает уреазной активностью, нитрат не использует, сахара не сбраживает. В роде Yarrowia один вид lipolytica, известный своей способностью к интенсивному образованию липолитических и протеолитических ферментов. Телеоморфа - Candida paralipolytica. Встречается у человека и других млекопитающих, в зерне, маслинах и нефтепродуктах.

Штамм Yarrowia lipolytica 2kp депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под номером ВКПМ Y-4043.

Предельно допустимая концентрация (ПДК) в воздухе рабочей зоны - 500 кл/м³, пометка А.

Методика обеспечивает выполнение измерений количества клеток гриба в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 50 до 5 000 клеток в 1 м³ воздуха при доверительной вероятности 0,95.

Метод основан на аспирации из воздуха рабочей зоны клеток псевдомицелия и подсчета количества выросших колоний по типичным культурально-морфологическим и физиолого-биохимическим признакам.

При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы.

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Примечание. Допускается применение оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

Примечание. Допускается использование других питательных сред и диагностических препаратов с аналогичными характеристиками.

При выполнении измерений концентрации клеток гриба в воздухе рабочей зоны соблюдают следующие требования.

6.1. СП 1.3.2322-08 "Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней".

6.2. СП 1.3.2518-09. Дополнения и изменения 1 к СП 1.3.2322-08.

6.3. Правила техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.005-88.

6.4. Электробезопасность при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-79 и инструкции по эксплуатации прибора.

6.5. Все виды работ с реактивами проводят только в вытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с биологическим материалом осуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными лампами.

К выполнению измерений и обработке их результатов допускают лиц с высшим или средним специальным образованием, прошедших соответствующую подготовку и имеющих навыки работы в области микробиологических исследований.

Приготовление сред, подготовку к анализу проводят в следующих условиях:

Для приготовления используют сухую готовую глюкозо-пептонную среду (ГПА): 50,0 г порошка размешивают в 1 000 см³ дистиллированной воды. Можно использовать отдельные компоненты среды следующего состава: пептон - 20,0 г; глюкоза - 10,0 г; хлорид натрия - 5,0 г; агар-агар - 15,0 г. Сухие компоненты растворяют в 1 000 см³ дистиллированной воды, тщательно перемешивают и нагревают до полного растворения агара.

Приготовленную среду разливают в стерильные колбы по 250 - 500 см³ и автоклавируют при 121 °C в течение 15 мин.

Для приготовления желточного агара смешивают указанные компоненты: пептон - 20 г; однозамещенный фосфорно-кислый натрий - 2,5 г; хлорид натрия - 1 г; 0,5%-й раствор серно-кислого магния - 1 см³, глюкоза - 1 г; агар - 12,5 г; дистиллированная вода - 500 см³. Смесь нагревают до растворения агара, стерилизуют автоклавированием при 121 °C в течение 15 мин и охлаждают до 60 °C.

Скорлупу яйца дезинфицируют спиртом. Яйцо разбивают, отделяют желток от белка и переносят с соблюдением правил асептики в расплавленный агар. Агар перемешивают до получения однородной суспензии, разливают по чашкам и оставляют до полного затвердевания.

Готовые среды хранят в защищенных от света условиях при температуре не выше 8 °C в течение 10 дней, не более.

Отбор проб воздуха проводят с учетом требований ГОСТ 12.1.005-88 с изменением 1 "ССБТ. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны" и ГОСТ 8.563-96. ГСИ. "Методики выполнения измерений".

Для этого воздух аспирируют при помощи пробоотборника на поверхность плотной питательной среды в соответствии с технической документацией (инструкцией) на прибор. Время аспирации и объем отбираемого воздуха зависит от предполагаемой концентрации микроорганизма.

Аппарат перед каждым отбором пробы воздуха тщательно протирают 96°-м этиловым спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхность подвижного диска и внутреннюю стенку прибора; наружную и внутреннюю стенку крышки. На подвижной диск устанавливают подготовленную чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышки прибора со средой недопустимо (количество питательной среды в чашки вносят в соответствии с инструкцией к прибору). После отбора пробы воздуха и остановки диска прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку контроля, время аспирации и дату отбора пробы.

При выполнении анализа воздуха прямым методом стерильную агаризованную среду (ГПА) расплавляют, остужают до 50 - 60 °C, с соблюдением правил асептики вносят стерильный раствор циклогексимида из расчета 0,5 г/л среды (для подавления посторонней микрофлоры), тщательно перемешивают и разливают в чашки Петри.

Контроль чистоты розлива проводят в соответствии с п. 7.1.1 МУК 4.2.2316-08. Для этого чашки с застывшей средой помещают в термостат при температуре 37 °C не менее, чем на 18 ч. Проросшие чашки бракуют, стерильные чашки используют для контроля воздуха. Разлитую в чашки питательную среду хранят при температуре (2 - 8) °C не более 10 дней.

После отбора проб воздуха чашки Петри помещают в термостат с температурой (28 +/- 2) °C. Через 1 - 3 суток производят подсчет выросших колоний по культурально-морфологическим признакам (прямой метод).

Ростовые свойства используемой питательной среды должны быть проверены до проведения анализа воздуха в соответствии с требованиями к ростовым свойствам питательных сред, руководствуясь МУК 4.2.2316-08. Для этого эталонный музейный штамм Y lipolytica 2kp ВКПМ Y-4043 высевается на 2 - 3 чашки используемой среды.

Лиофилизованную культуру музейного штамма необходимо использовать 2 - 3 пассажа во избежание потери им заданных ростовых свойств.

Дополнительным функциональным методом является отбор пробы воздуха на чашки Петри с желточным агаром. После отбора проб воздуха чашки инкубируют в термостате при (28 +/- 2) °C в течение 48 - 72 ч и внимательно просматривают в косом освещении. Вокруг колоний штамма, продуцирующего липазу, образуются маслянистые, блестящие с переливами или перламутровые зоны.

Расчет концентрации клеток производят по формуле:

К - концентрация штамма в воздухе, кл/м³;

П - количество типичных колоний, выросших на чашке Петри;

1 000 - коэффициент пересчета на 1 м³ воздуха;

C - скорость аспирации воздуха, л/мин;

T - время аспирации, мин.

Результаты измерений оформляют протоколом по нижеприведенной форме.