"МУК 4.1.3285-15. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств изопиразама в бананах методом капиллярной газожидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 08.07.2015)

1. Разработаны сотрудниками ФБУН "Федеральный научный центр гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана" Роспотребнадзора (В.Н. Ракитский, Т.В. Юдина, О.Е. Егорченкова).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 22 мая 2015 г. N 1).

3. Утверждены руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 8 июля 2015 г.

4. Введены впервые.

Свидетельство об аттестации МВИ N РОСС RU.0001.310430/0201.14.07.14 от 14.07.2014.

Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода капиллярной газожидкостной хроматографии для измерения концентрации изопиразама в бананах в диапазоне 0,01 - 0,1 мг/кг.

Методические указания носят рекомендательный характер.

Химический класс: карбоксимиды.

Смесь син- и анти-изомеров:

-3-(дифторометил)-1-метил-N-[(1RS,4SR,9RS)-1,2,3,4-тетрагидро-9-изопропил-1,4-метанонафталин-5-ил]пиразол-4-карбоксамид;

-3-(дифторометил)-1-метил-N-[(1RS,4SR,9RS)-1,2,3,4-тетрагидро-9-изопропил-1,4-метанонафталин-5-ил]пиразол-4-карбоксамид (IUPAC)

Эмпирическая формула: C₂₀H₂₃F₂N₃O.

Молекулярная масса: 359,4.

Беловатый порошок без запаха. Плотность 1,332 г/см³ при 20 °C. Температура плавления: син-изомер 130,2 °C, анти-изомер 144,5 °C. Температура кипения: термическое разложение начинается при температуре более 274 °C, до достижения точки кипения. Давление паров при 25 °C: 3,32 x 10^-5 МПа. Растворимость в органических растворителях (в г/дм³): ацетон - 314; дихлорметан - 330; этилацетат - 179; метанол - 119; толуол - 77,1; н-октанол - 44,1; гексан - 1,17. Растворимость в воде (в мг/дм³ при 25 °C): син-изомер 0,55; анти-изомер 1,05. Коэффициент распределения н-октанол/вода: K_ow log P = 4,1 (син-изомер), K_ow log P = 4,4 (анти-изомер). Гидролитически стабилен при температуре 25 °C и pH 5,7 и 9 (ДТ₅₀ = 30 дней).

Острая оральная токсичность (LD₅₀) (син:анти - 70:30) для крыс > 2 000 мг/кг; острая дермальная токсичность (LD₅₀) для крыс > 5 000 мг/кг; острая ингаляционная токсичность (LK₅₀) для крыс > 5,28 мг/м³.

Изопиразам - фунгицид, обладающий контактной активностью с необратимым связыванием с листовой поверхностью, ингибирует рост мицелия в тканях растений, предотвращает спорообразование. Предназначен для защиты плодовых культур от комплекса грибов-патогенов.

При соблюдении всех регламентируемых условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерения при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций.

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для всего диапазона измерений (n = 20) приведены в табл. 2.

Метод основан на определении изопиразама с использованием капиллярной газожидкостной хроматографии (ГЖХ) с масс-селективным (МСД) и/или электронозахватным (ЭЗД) детекторами после извлечения вещества из анализируемых образцов смесью ацетонитрил-вода (80:20, по объему), очистки экстрактов перераспределением в системе несмешивающихся растворителей и далее на концентрирующем патроне для твердофазной экстракции.

Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки.

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Примечание. Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией, не требующей дополнительной очистки растворителей.

Примечание. Допускается применение оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ Р 12.1.019-09, а также требования, изложенные в технической документации на газовый хроматограф.

4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и ГН 2.2.5.2308-07. Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004-90.

4.3. При работе с газами, находящимися в баллонах под давлением до 15 МПа (150 кгс/см²), необходимо соблюдать "Правила устройства и безопасной эксплуатации стационарных компрессорных установок, воздухопроводов и газопроводов под давлением", ПБ-03-576-03. Запрещается открывать вентиль баллона, не установив на нем понижающий редуктор.

К выполнению измерений допускают специалистов, прошедших обучение, освоивших методику, владеющих техникой, имеющих опыт работы на газовом хроматографе и подтвердивших соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности по п. 13.

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C и относительной влажности не более 80%;

выполнение измерений на газовом хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Измерениям предшествуют следующие операции: очистка органических растворителей (при необходимости), приготовление градуировочных растворов, растворов внесения, установление градуировочной характеристики, приготовление смесей растворителей для экстракции и очистки экстрактов на патроне, проверка поведения вещества на нем, подготовка концентрирующих патронов.

Ацетон перегоняют над небольшим количеством перманганата калия и прокаленным карбонатом калия или подвергают ректификационной перегонке на колонне с числом теоретических тарелок не менее 30.

Ацетонитрил кипятят с обратным холодильником над пентоксидом фосфора (на 1 дм³ ацетонитрила 20 г пентоксида фосфора) не менее 1 часа, после чего перегоняют, непосредственно перед употреблением ацетонитрил повторно перегоняют над прокаленным карбонатом калия (на 1 дм³ ацетонитрила 10 г карбоната калия).

Растворитель последовательно промывают порциями концентрированной серной кислоты до тех пор, пока она не перестанет окрашиваться в желтый цвет, водой до нейтральной реакции промывных вод, перегоняют над поташом.

7.1.3.1. Приготовление 10%-го раствора гидроксида натрия. В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 10 г гидроксида натрия, растворяют в 60 - 70 см³ деионизованной воды, доводят водой до метки, перемешивают.

7.1.3.2. Приготовление 2 М раствора соляной кислоты. В мерную колбу вместимостью 500 см³ помещают 200 - 250 см³ деионизованной воды, вносят 83 см³ концентрированной соляной кислоты, доводят водой до метки, перемешивают.

7.2.1. Исходный раствор изопиразама для градуировки (концентрация 100 мкг/см³). В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 0,01 г изопиразама, растворяют в 50 - 60 см³ ацетона, доводят ацетоном до метки, тщательно перемешивают.

Раствор хранят в холодильнике при температуре 4 - 6 °C в течение 6 месяцев.

7.2.2. Рабочий раствор N 1 изопиразама для градуировки внесения (концентрация 10,0 мкг/см³). В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 10,0 см³ исходного градуировочного раствора с концентрацией 100,0 мкг/см³ (п. 7.2.1), доводят до метки ацетоном, тщательно перемешивают, получают рабочий раствор N 1 с концентрацией изопиразама 10,0 мкг/см³.

Раствор хранят в холодильнике при температуре 4 - 6 °C в течение месяца.

Этот раствор используют для приготовления проб с внесением при оценке полноты извлечения действующего вещества методом "внесено-найдено" и контроля качества результатов измерений методом добавок.

7.2.3. Рабочие растворы N 2 - 5 изопиразама для градуировки (концентрация 0,05 - 0,5 мкг/см³). В 4 мерные колбы вместимостью 100 см³ помещают 0,5; 1,0; 2,0 и 5,0 см³ рабочего раствора N 1 с концентрацией 10,0 мкг/см³ (п. 7.2.2), доводят до метки ацетоном, тщательно перемешивают, получают рабочие растворы N 2 - 5 с концентрациями изопиразама 0,05; 0,1, 0,2 и 0,5 мкг/см³.

Растворы хранят в холодильнике при температуре 4 - 6 °C в течение 14 дней.

Градуировочную характеристику, выражающую линейную (с угловым коэффициентом) зависимость площади пика от концентрации изопиразама в растворе, устанавливают методом абсолютной калибровки по 4 растворам для градуировки.

В испаритель хроматографа вводят по 1 мм³ каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.4. Осуществляют не менее 5 параллельных измерений. Устанавливают площади пика изопиразама, на основании которых строят градуировочную зависимость. Градуировочный график проверяют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов. Если значения площадей отличаются более, чем на 10% от параметров градуировочной характеристики, ее строят заново, используя свежеприготовленные рабочие растворы для градуировки.

В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 0,1 г марганцовокислого калия, растворяют в 50 - 70 см³ деионизованной воды, доводят водой до метки, тщательно перемешивают.

7.5.1. Смесь ацетонитрил-вода (объемное соотношение 80:20). В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 80 см³ ацетонитрила и 20 см³ воды, перемешивают.

7.5.2. Смесь ацетонитрил-вода (объемное соотношение 25:75). В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 25 см³ ацетонитрила и 75 см³ воды, перемешивают.

Патрон устанавливают на аллонж с прямым отводом для вакуума <*>. Сверху в патрон устанавливают стеклянную пипетку вместимостью 5 см³, используемую в качестве емкости для элюента.

--------------------------------

<*> В отсутствие специального аллонжа, жидкость продавливают через патрон с помощью шприца, скорость продавливания раствора не должна превышать 2 - 3 капли в секунду.

Концентрирующий патрон промывают 2 см³ метанола и 2 см³ деионизированной воды, процедуру проводят с использованием вакуума, скорость потока растворителя через патрон не должна превышать 2 см³/мин, при этом нельзя допускать высыхания поверхности патрона. Патрон готовят непосредственно перед использованием.

В круглодонную колбу вместимостью 150 см³ помещают 0,1 см³ рабочего раствора N 1 изопиразама для внесения с концентрацией 10,0 мкг/см³ (п. 7.2.2), упаривают досуха на ротационном испарителе при температуре водяной бани не выше 35 °C. Сухой остаток растворяют в 1,5 см³ ацетонитрила и 8,5 см³ деионизованной воды, помещая на ультразвуковую баню на 30 с, перемешивают и наносят на подготовленный концентрирующий патрон для твердофазной экстракции (п. 7.6). Патрон промывают 2 см³ смеси вода-ацетонитрил (75:25, по объему), элюат отбрасывают.

Патрон высушивают воздухом (с использованием вакуума) в течение 5 минут.

Изопиразам элюируют с патрона 10 см³ метанола, отбирая фракционно (по 5 см³) элюат, упаривают, остатки растворяют в 2 см³ ацетона, анализируют содержание изопиразама по п. 9.4.

Фракции, содержащие изопиразам, объединяют и вновь анализируют. Устанавливают уровень вещества в элюате, определяют полноту смывания с патрона и необходимый для очистки объем элюента.

Примечание. Проверку хроматографического поведения изопиразама следует проводить обязательно, поскольку профиль вымывания может изменяться при использовании новой партии сорбентов и растворителей.

Отбор проб производится в соответствии с правилами, определенными: ГОСТ Р 51603-2000 "Бананы свежие. Технические условия"; ГОСТ 26313-84 "Продукты переработки плодов и овощей. Правила приемки, методы отбора проб", а также "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (N 2051-79 от 21.08.1979).

Отобранные пробы бананов хранят в стеклянной или полиэтиленовой таре в холодильнике в темноте не более 5 дней. Для длительного хранения образцы замораживают и хранят при температуре -18 °C.

Перед анализом образцы измельчают.

Измельченные образцы бананов массой 20 г помещают в коническую колбу вместимостью 250 см³, добавляют 40 см³ смеси ацетонитрил-вода (80:20, по объему) и помещают на аппарат для встряхивания на 30 минут. Пробе дают отстояться, затем надосадочную жидкость фильтруют на воронке Бюхнера с помощью разряжения, создаваемого водоструйным насосом, через бумажный фильтр средней плотности. Остаток повторно дважды экстрагируют 40 см³ смеси ацетонитрил-вода (80:20, по объему), выдерживая на встряхивателе 30 мин. Экстракт фильтруют на воронке Бюхнера, осадок на фильтре промывают 20 см³ смеси ацетонитрил-вода (80:20, по объему).

Объединенный отфильтрованный экстракт переносят в мерный цилиндр на 100 см³, перемешивают, измеряют объем, 1/2 часть экстракта переносят в колбу для упаривания на 150 см³ и упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 35 °C до водного остатка (объем 5 - 10 см³) и подвергают очистке по п. 9.2.

Водную фазу помещают в делительную воронку вместимостью 250 см³, вносят 5 см³ насыщенного раствора хлористого натрия, перемешивают. Затем в воронку добавляют 30 см³ дихлорметана, интенсивно встряхивают 5 мин. После полного разделения фаз нижний дихлорметановый слой переносят в колбу для упаривания вместимостью 150 см³, фильтруя через слой безводного сульфата натрия (толщиной около 1 см), помещенный на бумажном фильтре в химическую воронку.

Экстракцию изопиразама повторяют еще дважды порциями дихлорметана объемом 20 см³, встряхивая в течение 5 мин.

Осадок на фильтре дополнительно промывают 10 см³ дихлорметана.

Для полного разделения фаз содержимое воронки должно отстояться 10 - 15 мин. Следы дихлорметана в водной фазе недопустимы, поскольку это снижает полноту извлечения вещества.

Объединенную органическую фазу, пропущенную через слой сульфата натрия, упаривают на ротационном испарителе при температуре не выше 35 °C досуха и подвергают дополнительной очистке на патроне по п. 9.3.

Сухой остаток в круглодонной колбе, полученный по п. 9.2, растворяют с помощью ультразвуковой бани в 1,5 см³ ацетонитрила, затем добавляют 8,5 см³ деионизованной воды, перемешивают и переносят на подготовленный концентрирующий патрон на основе октадецилсилана (п. 7.7). Патрон промывают 2 см³ смеси вода-ацетонитрил (75:25, по объему), элюат отбрасывают. Патрон высушивают воздухом (с использованием вакуума) в течение 5 минут.

Изопиразам элюируют 10 см³ метанола в круглодонную колбу для упаривания вместимостью 150 см³. Раствор упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 35 °C. Сухой остаток растворяют в 2 см³ ацетона и анализируют содержание изопиразама по п. 9.4.

Хроматографическая капиллярная кварцевая колонка длиной 30 м, внутренним диаметром 0,25 мм, содержащая сорбент: 5% - фенил- и 95% - диметилполисилоксан (толщина пленки сорбента 0,25 мкм).

Температура испарителя: 275 °C.

Температура термостата колонки программированная. Начальная температура - 180 °C, выдержка 2 мин, нагрев колонки со скоростью 10 градусов в минуту до температуры 260 °C, выдержка 8 мин.

Газ 1 (гелий): поток в колонке 1,0 см³/мин.

Давление: 99,8 кПа.

Средняя линейная скорость: 38 см/с.

Хроматографируемый объем: 1 мм³.

Режим сканирования - SIM, m/z: 159, 303, 359.

Линейный диапазон детектирования: 0,05 - 0,5 нг.

Хроматографическая капиллярная кварцевая колонка длиной 30 м, внутренним диаметром 0,25 мм, содержащая сорбент: 14% - цианпропилфенил- и 86% - диметилполисилоксан (толщина пленки сорбента 0,25 мкм).

Температура термостата колонки программированная. Начальная температура - 220 °C, выдержка 2 мин, нагрев колонки со скоростью 7 градусов в минуту до температуры 270 °C, выдержка 12 мин.

Газ 1 (азот): давление 109,8 кПа, скорость 27 см/с, поток 0,8 см³/мин.

Хроматографируемый объем: 1 мм³.

Линейный диапазон детектирования: 0,5 - 0,5 нг.

Образцы, дающие пики большие, чем градуировочный раствор изопиразама с концентрацией 0,5 мкг/см³, разбавляют ацетоном не более, чем в 50 раз.

Содержание изопиразама в пробе (X, мг/кг) рассчитывают по формуле:

где X - содержание изопиразама в пробе, мг/кг;

A - концентрация изопиразама, найденная по градуировочной характеристике в соответствии с величиной площади хроматографического пика, мкг/см³;

V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, см³;

m - масса анализируемого образца, г.

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости:

где X₁, X₂ - результаты параллельных определений, мг/кг;

r - значение предела повторяемости (табл. 1), при этом .

При невыполнении условия выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

Результат анализа представляют в виде:

где - среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

- граница абсолютной погрешности, мг/кг:

где - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

Если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание изопиразама в пробе менее 0,01 мг/кг". <*>

--------------------------------

<*> 0,01 мг/кг - предел обнаружения изопиразама в бананах.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1 - 6-02 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

13.1. Контроль стабильности градуировочной характеристики.

Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят в начале и по окончании каждой серии анализов.

При контроле стабильности градуировочной характеристики проводят измерения не менее трех образцов концентраций для градуировки, содержание изопиразама в которых должно охватывать весь диапазон концентраций от 0,05 до 0,5 мкг/см³.

Градуировочная характеристика считается стабильной, если для каждого из используемого для контроля градуировочного раствора сохраняется соотношение:

где X - концентрация изопиразама в пробе при контрольном измерении, мкг/см³;

C - известная концентрация градуировочного раствора изопиразама, взятая для контроля стабильности градуировочной характеристики, мкг/см³;

B - норматив контроля погрешности градуировочной характеристики, % (B = 10% при P = 0,95).

Если величина расхождения (A) превышает 10%, делают вывод о невозможности применения градуировочной характеристики для дальнейших измерений. В этом случае выясняют и устраняют причины нестабильности градуировочной характеристики и повторяют контроль ее стабильности с использованием других градуировочных растворов изопиразама, предусмотренных МВИ. При повторном обнаружении нестабильности градуировочной характеристики устанавливают ее заново согласно п. 7.3.

Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом добавок.

Величина добавки C_д должна удовлетворять условию:

где - характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой соответственно) мг/кг, при этом:

где - граница абсолютной погрешности, мг/кг:

где - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

Результат контроля процедуры К_к рассчитывают по формуле:

где , , C_д - среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки соответственно, мг/кг.

Норматив контроля К рассчитывают по формуле:

Проводят сопоставление результата контроля процедуры (К_к) с нормативом контроля (К).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (1) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (1) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), не должно превышать предела воспроизводимости (R):

где X₁, X₂ - результаты измерений, выполненных в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), мг/кг;

R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.