"МУК 4.1.3511-17. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств клотианидина в зерне гороха, капусте, томатах и томатном соке, плодах и соке косточковых, ягодах и соке черной смородины методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 29.12.2017)

1. Разработаны сотрудниками ФГБНУ "Всероссийский НИИ защиты растений" (В.И. Долженко, И.А. Цибульская, Т.Д. Черменская, Е.Ю. Алексеев, Д.Р. Салимов), Санкт-Петербург, Пушкин.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 24 ноября 2017 г. N 1).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 29 декабря 2017 г.

4. Введены впервые.

Свидетельство об аттестации методики (метода) измерений N 01.5.04.236/01.00043/2016.

Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения массовой концентрации клотианидина в зерне гороха, капусте, томатах и томатном соке, плодах и соке плодовых косточковых, ягодах и соке черной смородины в диапазоне концентраций 0,02 - 0,2 мг/кг.

Методические указания носят рекомендательный характер.

Клотианидин

(Е)-1-(2-хлор-1,3-тиазол-5-илметил)-3-метил-2-нитрогуанидин (IUPAC).

Структурная формула:

Молекулярная масса: 249,7.

Брутто формула: C₆H₈ClN₅O₂S.

Клотианидин представляет собой порошок без цвета и запаха.

Температура плавления: 176,8 °C. Давление пара: 1,3 x 10^-4 МПа (25 °C). Коэффициент распределения в системе н-октанол-вода K_ow lgP = 0,7 (25 °C), pKa = 11,09 (20 °C).

Растворимость в воде (20 °C): 0,304 (pH 4), 0,34 (pH 10) г/дм³. Растворимость (г/дм³, 25 °C): в гептане < 0,001, в ксилоле - 0,013, дихлорметане - 1,32, метаноле - 6,26, октаноле - 0,94, ацетоне - 15,2, этилацетате - 2,03.

Краткая токсикологическая характеристика. Острая оральная токсичность для крыс LD₅₀ > 5 000 мг/кг, ингаляционная токсичность для крыс LC₅₀ (4 ч) > 6,1 мг/дм³. Не мутаген, не онкоген для крыс и мышей, не тератоген для крыс и кроликов. При прямом контакте опасен для пчел, но неопасен при использовании в качестве протравителя и в случае обработок не непосредственно на цветущие культуры.

Область применения. Инсектицид из группы неоникотиноидов для борьбы с сосущими и грызущими насекомыми на рисе, кукурузе, рапсе, овощных и фруктовых культурах. Используется для протравливания семян, обработки почвы и вегетирующей культуры.

Гигиенические нормативы для клотианидина в России: МДУ в томатах - 0,05; капусте - 0,2; плодовых косточковых - 0,2; ягодах и других мелких фруктах - 0,07 мг/кг; в зерне гороха не установлен.

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1, для соответствующих диапазонов концентраций.

Метод основан на определении клотианидина методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием ультрафиолетового (УФ) детектора после извлечения из образцов ацетонитрилом в присутствии цитратного буфера, насыщенного сульфатом магния, и обеспечивающего разделение водной и органической фаз; очистке ацетонитрильного экстракта с помощью дисперсионной твердофазной экстракции при одновременном удалении воды безводным сульфатом магния.

Идентификация клотианидина проводится по времени удерживания, количественное определение - методом абсолютной калибровки.

Избирательность метода обеспечивается сочетанием условий подготовки проб и хроматографирования.

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Примечание. Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией, не требующих дополнительной очистки растворителей.

Примечание. Допускается использование вспомогательных устройств и материалов с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-09, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф.

4.2. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией, соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и ГН 2.2.5.2308-07.

Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004-90.

4.3. При работе с газами, находящимися в баллонах под давлением до 15 МПа (150 кгс/см²), необходимо соблюдать Федеральные нормы и правила в области промышленной безопасности "Правила промышленной безопасности опасных производственных объектов, на которых используется оборудование, работающее под избыточным давлением" (утв. Приказом Ростехнадзора от 25.03.2014 N 116). Запрещается открывать вентиль баллона, не установив на нем понижающий редуктор.

Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист, имеющий опыт работы на жидкостном хроматографе, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений.

При выполнении измерений выполняют следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C и относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Перед началом анализа аналитическую колонку кондиционируют в потоке подвижной фазы (0,5 - 1,0 см³/мин) до стабилизации нулевой линии.

7.2.1. 0,005 М раствор ортофосфорной кислоты: 0,5 +/- 0,01 г 98% ортофосфорной кислоты помещают в мерную колбу объемом 1 дм³, растворяют в деионизированной воде и доводят объем до метки.

7.3.1. Основной раствор клотианидина с концентрацией 0,5 мг/см³: точную навеску клотианидина (50 +/- 0,5 мг) помещают в мерную колбу вместимостью 100 см³, растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки ацетонитрилом.

7.3.2. Приготовление градуировочных растворов. Градуировочные растворы с концентрациями клотианидина 0,01; 0,02; 0,05; 0,1; 0,2 и 1,0 мкг/см³ готовят методом последовательного разбавления по объему, используя ацетонитрил).

7.3.2.1. Раствор N 1 с концентрацией 1,0 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 100 см³ вносят 0,2 см³ основного раствора и доводят до метки подвижной фазой.

7.3.2.2. Раствор N 2 с концентрацией 0,2 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 2,0 см³ раствора N 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.3.2.3. Раствор N 3 с концентрацией 0,1 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 1,0 см³ раствора N 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.3.2.4. Раствор N 3 с концентрацией 0,05 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 0,5 см³ раствора N 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.3.2.5. Раствор N 4 с концентрацией 0,02 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 1,0 см³ раствора N 2 и доводят объем до подвижной фазой.

7.3.2.6. Раствор N 5 с концентрацией 0,01 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 1,0 см³ раствора N 3 и доводят объем до метки подвижной фазой.

Основной раствор клотианидина можно хранить в холодильнике при температуре 0 - 4 °C в течение 6 месяцев, градуировочные растворы - в течение недели.

При изучении полноты определения клотианидина используют ацетонитрильные растворы веществ, приготовленные из основного раствора методом последовательного разбавления по объему ацетонитрилом.

Для установления градуировочной характеристики (площадь пика - концентрация клотианидина в растворе) в хроматограф вводят по 20 мм³ градуировочных растворов (не менее 3 параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4 точек по диапазону измеряемых концентраций). Затем измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации клотианидина в градуировочном растворе.

Методом наименьших квадратов рассчитывают градуировочный коэффициент (K) в уравнении линейной регрессии:

где S - площадь пика градуировочного раствора.

Градуировку признают удовлетворительной, если значение коэффициента линейной корреляции оказывается не ниже 0,99.

Градуировочную характеристику необходимо проверять при замене реактивов, хроматографической колонки или элементов хроматографической системы, а также при отрицательном результате контроля градуировочного коэффициента.

Градуировочную зависимость признают стабильной при выполнении следующего условия:

где C - аттестованное значение массовой концентрации клотианидина в градуировочном растворе;

C_к - результат контрольного измерения массовой концентрации клотианидина в градуировочном растворе;

- норматив контроля градуировочного коэффициента, % ( при P = 0,95).

Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (N 2051-79 от 21.08.79). Отбор проб зерна гороха проводят в соответствии с ГОСТ 6201-68 "Горох шлифованный. Технические условия". Пробы гороха хранят в бумажной или тканевой упаковке при комнатной температуре. Пробы капусты отбирают в соответствии с ГОСТ 1724-85 "Капуста белокочанная свежая, заготовляемая и поставляемая. Технические условия (с Изменениями N 1 - 4)"; томатов - в соответствии с ГОСТ 1725-85 "Томаты свежие. Технические условия". Отбор проб вишни производят в соответствии с ГОСТ 21921-76 "Вишня свежая. Технические условия" и ГОСТ Р 56672-15 "Вишня свежая для промышленной переработки. Технические условия"; смородины - в соответствии с ГОСТ 6829-15 "Смородина черная свежая. Технические условия". Пробы капусты, томатов и томатного сока, вишни и вишневого сока, смородины и смородинового сока хранят до анализа в герметичной таре в морозильной камере при температуре не выше -18 °C, в холодильнике сок хранят при температуре 0 - 4 °C в стеклянной таре с притертой пробкой в течение недели.

Навеску измельченной матрицы 10 г помещают в полипропиленовую центрифужную пробирку вместимостью 50 см³, последовательно добавляют 10 см³ ацетонитрила, 4 г безводного сульфата магния, 1 г хлористого натрия, 1 г цитрата натрия двуводного и 0,5 г динатрия цитрата сесквигидрата. Пробирку плотно закрывают и помещают в перемешивающее устройство на 10 мин, затем центрифугируют в течение 10 мин при скорости 4 000 об./мин. От верхнего ацетонитрильного слоя отбирают 5 см³, переносят в центрифужную пробирку вместимостью 15 см³, содержащую 150 мг смеси первичных и вторичных аминов и 900 мг безводного сульфата магния. Пробирку плотно закрывают и помещают в перемешивающее устройство на 10 мин, затем центрифугируют в течение 10 мин при скорости 4 000 об./мин. От верхнего ацетонитрильного слоя отбирают 1 см³ и упаривают растворитель в токе воздуха. Сухой остаток растворяют в 1 см³ подвижной фазы и анализируют ВЭЖХ по п. 9.2.

Высокоэффективный жидкостной хроматограф с УФ-детектором, снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки. Аналитическая колонка, заполненная сорбентом с привитыми бифункциональными полярными группами C18, (250 x 4,6) мм, 5 мкм. Температура колонки (30 +/- 1) °C. Подвижная фаза: ацетонитрил - 0,005 М H₃PO₄ в соотношении 30:70 (для проб плодов и сока вишни, ягод и сока смородины); в соотношении 25:75 (для проб гороха, капусты, плодов и сока томатов). Скорость потока элюента 1 см³/мин. Длина волны 270 нм. Объем вводимой пробы 20 мм³.

Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки. Содержание клотианидина в пробе (X, мг/кг) вычисляют по формуле:

где S_x - площадь пика клотианидина на хроматограмме испытуемого образца, (AU);

K - градуировочный коэффициент, найденный на стадии построения соответствующей градуировочной зависимости;

V - объем пробы, подготовленной для хроматографического анализа, см³;

P - навеска анализируемого образца, г.

Содержание остаточных количеств клотианидина в образце вычисляют как среднее из двух параллельных определений.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор клотианидина с концентрацией 0,2 мкг/см³, разбавляют подвижной фазой.

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости:

где X₁, X₂ - результаты параллельных определений, мг/кг;

r - значение предела повторяемости .

При невыполнении условия выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

Результат анализа представляют в виде:

где - среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

- граница абсолютной погрешности, мг/кг:

где - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

В случае если содержание компонента меньше нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание вещества в пробе "менее нижней границы определения" (например: менее 0,02 мг/кг*, где * 0,02 мг/кг - предел обнаружения клотианидина в капусте).

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1 - 6-02 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода "добавок".

Величина добавки C_д должна удовлетворять условию:

где - характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой соответственно), мг/кг; при этом:

где - граница абсолютной погрешности, мг/кг:

где - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

Результат контроля процедуры K_к рассчитывают по формуле:

где X', X, C_д - среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки, соответственно, мг/кг.

Норматив контроля K рассчитывают по формуле:

Проводят сопоставление результата контроля процедуры (K_к) с нормативом контроля (K).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры к их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):

где X₁, X₂ - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;

R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций), %.