"МУК 4.1.3501-17. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств ацибензолар-C-метила в салате, дыне, томатах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 29.12.2017)

Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения массовой концентрации ацибензолар-C-метила в салате, дыне, томатах в диапазоне 0,01 - 0,1 мг/кг.

Методические указания носят рекомендательный характер.

S-метил бензо[1,2,3]тиадиазол-7-карбоксилат (IUPAC).

Структурная формула:

Эмпирическая формула: C₈H₆N₂OS₂.

Молекулярная масса: 210,3.

Светло-бежевый порошок. Давление паров: 4,4·10^-1 МПа (при 25 °C). Температура плавления: 132,9 °C. Растворимость в органических растворителях (при 25 °C, г/дм³): метанол - 4,2; этилацетат - 25; гексан - 1,3; толуол - 36; ацетон - 28; дихлорметан - 160. Растворимость в воде при 25 °C - 7,7 мг/дм³.

Область применения. Ацибензолар-C-метил - фунгицид химического класса бензотиадиазола, используется для борьбы с рядом инфекционных заболеваний пшеницы на ранней стадии болезни или как профилактическое средство. Эффективен также против ряда заболеваний риса, табака, овощных культур.

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций.

Полнота извлечения ацибензолар-C-метила, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для всего диапазона измерений (n = 20) приведены в табл. 2.

Методика основана на определении вещества с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на обращенной фазе с тройным квадрупольным масс-спектрометрическим детектором.

Уровни ацибензолар-C-метила в образцах салата, дыни, томатов определяют после его щелочного гидролиза при 65 - 70 °C, очистки с применением картриджа для твердофазной экстракции.

Нижний предел измерения ацибензолар-C-метила в анализируемом объеме пробы - 0,01 нг.

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Примечание. Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией, не требующих дополнительной очистки растворителей.

Примечание. Допускается использование вспомогательных устройств и материалов с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ Р 12.1.019-09, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф.

4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-15. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и ГН 2.2.5.2308-07. Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004-90.

4.3. При работе с газами, находящимися в баллонах под давлением до 15 МПа (150 кгс/см²), необходимо соблюдать Федеральные нормы и правила в области промышленной безопасности "Правила промышленной безопасности опасных производственных объектов, на которых используется оборудование, работающее под избыточным давлением" (утв. Приказом Ростехнадзора от 25.03.2014 N 116). Запрещается открывать вентиль баллона, не установив на нем понижающий редуктор.

Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист, имеющий опыт работы на жидкостном хроматографе, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений.

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C и относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Измерениям предшествуют следующие операции: очистка ацетонитрила (при необходимости), приготовление подвижной фазы для ВЭЖХ, кондиционирование хроматографической колонки, приготовление растворов, смесей для экстракции, подготовка концентрирующих патронов для очистки экстрактов, приготовление градуировочных растворов, растворов внесения, установление градуировочной характеристики.

Ацетонитрил кипятят с обратным холодильником над пентоксидом фосфора (на 1 дм³ ацетонитрила 20 г пентоксида фосфора) не менее 1 часа, после чего перегоняют. Непосредственно перед употреблением ацетонитрил повторно перегоняют над прокаленным карбонатом калия (на 1 дм³ ацетонитрила 10 г карбоната калия).

Компонент А (0,1%-й раствор муравьиной кислоты в воде): в мерную колбу вместимостью 1 000 см³ помещают 500 см³ деионизированной воды, вносят 1,0 см³ муравьиной кислоты, доводят до метки водой, перемешивают, фильтруют через мембранный фильтр, дегазируют.

Компонент Б (метанол): фильтруют через мембранный фильтр, дегазируют.

Каждый компонент подвижной фазы хранят в темном месте (в емкости из темного стекла) не более 14 дней.

Промывают колонку подвижной фазой (смесь компонентов А и Б, приготовленных по п. 7.2, в соотношении 1:1) при скорости подачи растворителя 0,3 см³/мин до установления стабильной базовой линии.

7.4.1. В мерную колбу вместимостью 1 000 см³ помещают 500 см³ деионизированной воды, вносят 2,0 см³ муравьиной кислоты, доводят до метки водой, перемешивают, получают водный раствор муравьиной кислоты.

7.4.2. В мерную колбу вместимостью 500 см³ помещают 100 см³ деионизированной воды, вносят 20 г гидроксида натрия, доводят до метки водой, перемешивают, получают 1 М водный раствор гидроксида натрия.

7.4.3. В мерную колбу вместимостью 1 000 см³ помещают 100 см³ деионизированной воды, вносят 0,4 г гидроксида натрия, доводят до метки водой, перемешивают, получают 0,01 М водный раствор гидроксида натрия

7.4.4. В мерную колбу вместимостью 250 см³ помещают 100 см³ метанола, вносят 2,5 см³ 1 М водного раствора гидроксида натрия, доводят до метки метанолом, перемешивают, получают 0,01 М раствор гидроксида натрия.

7.4.5. В мерную колбу вместимостью 500 см³ помещают 200 см³ метанола, вносят по каплям 5 см³ 37%-й соляной кислоты, добавляют 300 см³ метанола, перемешивают, получают 1%-й раствор соляной кислоты.

Растворы хранят в темном месте (в емкости из темного стекла) не более 14 дней.

Концентрирующие патроны с использованием медицинского одноразового шприца промывают со скоростью прохождения растворителя 1 - 2 капли в секунду: последовательно 5 см³ метанола и 5 см³ раствора, приготовленного по п. 7.4.4. Патроны готовят непосредственно перед использованием.

7.6.1. Исходный раствор ацибензолар-C-метила для внесения (концентрация 100 мкг/см³). В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают (0,0100 +/- 0,0001) г ацибензолар-C-метила, добавляют 50 - 70 см³ ацетонитрила, перемешивают, доводят ацетонитрилом до метки, вновь перемешивают. Раствор хранят в холодильнике при температуре (4 +/- 2) °C в течение 6 месяцев.

7.6.2. Раствор N 1 ацибензолар-C-метила для внесения (концентрация 1 мкг/см³). В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 1 см³ исходного раствора ацибензолар-C-метила (п. 7.6.1) с концентрацией 100 мкг/см³, разбавляют ацетонитрилом до метки, перемешивают. Раствор N 1 хранят в холодильнике при температуре (4 +/- 2) °C в течение 6 месяцев.

7.7.1. Исходный раствор бензо[1,2,3]тиадиазол-7-карбоновой кислоты для градуировки (концентрация 100 мкг/см³). В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают (0,0100 +/- 0,0001) г бензо[1,2,3]тиадиазол-7-карбоновой кислоты, добавляют 50 - 70 см³ ацетонитрила, перемешивают, доводят ацетонитрилом до метки, вновь перемешивают. Раствор хранят в холодильнике при температуре (4 +/- 2) °C в течение 6 месяцев.

Растворы N 1 - 6 готовят объемным методом путем последовательного разбавления исходных растворов для градуировки.

7.7.2. Раствор N 1 бензо[1,2,3]тиадиазол-7-карбоновой кислоты для градуировки (концентрация 1 мкг/см³). В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 1,0 см³ исходного раствора бензо[1,2,3]тиадиазол-7-карбоновой кислоты (п. 7.7.1) с концентрацией 100 мкг/см³, доводят до метки ацетонитрилом, тщательно перемешивают, получают рабочий раствор N 1 с концентрацией бензо[1,2,3]тиадиазол-7-карбоновой кислоты 1 мкг/см³. Раствор N 1 хранят в холодильнике при температуре (4 +/- 2) °C в течение одного месяца.

7.7.3. Рабочие растворы N 2 - 6 бензо[1,2,3]тиадиазол-7-карбоновой кислоты для градуировки (концентрации 2 - 50 нг/см³). В 5 мерных колб вместимостью 100 см³ помещают 5, 2, 1, 0,5 и 0,2 см³ градуировочного раствора N 1 с концентрацией бензо[1,2,3]тиадиазол-7-карбоновой кислоты 1 мкг/см³ (п. 7.7.2), доводят до метки смесью для разбавления градуировочных растворов (приготовленного по п. 7.4.1), тщательно перемешивают, получают рабочие растворы N 2 - 6 с концентрацией бензо[1,2,3]тиадиазол-7-карбоновой кислоты 50, 20, 10, 5 и 2 нг/см³ соответственно.

Растворы хранят в холодильнике при температуре (4 +/- 2) °C в течение 2 недель.

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади пика (I) от концентрации бензо[1,2,3]тиадиазол-7-карбоновой кислоты в растворе (нг/см³), устанавливают методом абсолютной калибровки по 5 растворам для градуировки.

В инжектор хроматографа вводят 5 мм³ градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.3. Осуществляют не менее 5 параллельных измерений.

Отбор проб осуществляют в соответствии с ГОСТ 33985-16 "Салат-латук, эндивий кудрявый, эндивий эскариол свежие. Технические условия"; ГОСТ 7178-15 "Дыни свежие. Технические условия"; ГОСТ 55906-13 "Томаты свежие. Технические условия"; "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (N 2051-79 от 21.08.79).

Образцы салата, дыни, томатов хранят в холодильнике при температуре (4 +/- 2) °C не более 5 дней. Для длительного хранения пробы замораживают и хранят при температуре не выше -18 °C.

Образец измельченного салата, дыни или томатов массой 5 г помещают в плоскодонную колбу с пришлифованной пробкой вместимостью 250 см³, добавляют 45 см³ деионизированной воды, затем 5 см³ раствора, приготовленного по п. 7.4.2, закрывают колбу пробкой и интенсивно встряхивают вручную 5 с, затем ставят на аппарат для встряхивания на 10 мин. Далее колбу помещают в сушильный шкаф при 65 - 70 °C на 30 мин, каждые 10 мин перемешивая содержимое. После доведения температуры раствора до комнатной температуры добавляют 100 см³ метанола, закрывают пробку и ставят на 30 мин на аппарат для встряхивания (на этой стадии пробу можно оставить на ночь). Раствор фильтруют через фильтровальную бумагу в мерный цилиндр на 250 см³, промывая трижды по 20 см³ порциями метанола. Доводят раствор до 200 см³ метанолом и перемешивают. Отбирают аликвоту экстракта объемом 20 см³, добавляют 30 см³ раствора, приготовленного по п. 7.4.3, перемешивают.

Полученный раствор фильтруют с помощью медицинского шприца через концентрирующий патрон, подготовленный по п. 7.5, со скоростью прохождения раствора 1 - 2 см³/мин, пропуская раствор до верхнего края сорбента. После нанесения пробы, патрон дополнительно промывают 10 см³ раствора, подготовленного по п. 7.4.3, и 10 см³ метанола. Патрон освобождают от следов влаги с помощью разрежения, создаваемого водоструйным насосом (15 минут). Бензо[1,2,3]тиадиазол-7-карбоновую кислоту (метаболит ацибензолар-C-метила) элюируют с патрона двумя порциями по 5 см³ раствора, приготовленного по п. 7.4.5, упаривают досуха, растворяют остаток в 2,15 см³ водного раствора муравьиной кислоты (подготовленного по п. 7.4.1), выдерживают 1 - 2 мин на ультразвуковой ванне, фильтруют через мембранный фильтр, анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.3.

Измерения выполняют при следующих режимных параметрах.

Жидкостный хроматограф с тандемным масс-спектрометрическим детектором: тройной квадруполь с источником ионизации, оснащенным соосной подачей горячего азота для эффективной десольвации ионов.

Источник ионизации: электростатическое распыление.

Режим работы: регистрация дочерних положительных ионов после разрушения материнских ионов (регистрация "перехода").

Материнский ион (масса/заряд): 181,0.

Дочерние ионы (масса/заряд): 65,1 (количественный расчет), 53,1.

Напряжение на фрагментаторе, В: 124.

Энергия разрушения (соударения), В: 25 , 37 .

Скорость сканирования: 200 мс.

Давление на распылителе: 35 psi.

Скорость осушающего газа 1 (азот): 10 дм³/мин.

Температура газа 1: 250 °C.

Скорость газа 2 (азот): 11 дм³/мин.

Температура газа 2: 340 °C.

Температура квадруполей (1 и 3): 100 °C.

Хроматографическая колонка стальная длиной 50 мм, внутренним диаметром 2,1 мм, заполненная обращенно-фазовым сорбентом с привитыми монофункциональными полярными группами C18, зернением 1,8 мкм.

Температура колонки: 40 °C.

Скорость потока элюента: 0,3 см³/мин.

Объем вводимой пробы: 5 мм³.

Подвижная фаза: компонент А - 0,1%-й раствор муравьиной кислоты в воде; компонент Б - метанол. Режим элюирования - изократический (А:Б в соотношении 75:25).

Линейный диапазон детектирования 0,01 - 0,25 нг.

Образцы, дающие пики большие, чем градуировочный раствор с концентрацией 50 нг/см³, разбавляют подвижной фазой (не более чем в 50 раз).

Содержание ацибензолар-C-метила в пробах салата, дыни, томатов (X, мг/кг) рассчитывают по формуле:

A - концентрация бензо[1,2,3]тиадиазол-7-карбоновой кислоты, найденная по градуировочному графику в соответствии с величиной площади хроматографического пика, нг/см³;

V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, см³;

m - масса (объем) анализируемого образца, г (см³);

K - коэффициент, учитывающий объема экстракта, взятого для анализа, K = 10;

1,167 - коэффициент пересчета содержания бензо[1,2,3]тиадиазол-7-карбоновой кислоты в содержание ацибензолар-C-метила (конверсивный фактор).

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости:

X₁, X₂ - результаты параллельных определений, мг/кг;

r - значение предела повторяемости (табл. 1), при этом .

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

Результат анализа представляют в виде:

- среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

- граница абсолютной погрешности, мг/кг:

- граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

Если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание ацибензолар-C-метила в пробах воды салата, дыни, томатах - менее 0,01 мг/кг".

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-02 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

13.1. Контроль стабильности градуировочной характеристики.

Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят в начале и по окончании каждой серии анализов.

При контроле стабильности градуировочной характеристики проводят измерения не менее двух образцов концентраций для градуировки, содержание бензо[1,2,3]тиадиазол-7-карбоновой кислоты в которых должно охватывать весь диапазон концентраций от 2 до 50 нг/см³.

Градуировочная характеристика считается стабильной, если для каждого из используемого для контроля градуировочного раствора сохраняется соотношение:

X - концентрация бензо[1,2,3]тиадиазол-7-карбоновой кислоты в пробе при контрольном измерении, нг/см³;

C - известная концентрация градуировочного раствора бензо[1,2,3]тиадиазол-7-карбоновой кислоты, взятая для контроля стабильности градуировочной характеристики, нг/см³;

B - норматив контроля погрешности градуировочной характеристики, % (равен 10% при P = 0,95).

Если величина расхождения (A) превышает 10%, делают вывод о невозможности применения градуировочной характеристики для дальнейших измерений. В этом случае выясняют и устраняют причины нестабильности градуировочной характеристики и повторяют контроль ее стабильности с использованием других градуировочных растворов бензо[1,2,3]тиадиазол-7-карбоновой кислоты, предусмотренных МИ. При повторном обнаружении нестабильности градуировочной характеристики устанавливают ее заново согласно п. 7.8.

Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом "добавок".

Величина добавки C_д должна удовлетворять условию:

- характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой соответственно) мг/кг, при этом:

- граница абсолютной погрешности, мг/кг:

- граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

Результат контроля процедуры К_к рассчитывают по формуле:

, , C_д - среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки соответственно, мг/кг.

Норматив контроля К рассчитывают по формуле:

Проводят сопоставление результата контроля процедуры (К_к) с нормативом контроля (К).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), не должно превышать предела воспроизводимости (R):

X₁, X₂ - результаты измерений, выполненных в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), мг/кг;

R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.