"МУК 4.1.3509-17. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств темботриона в воде, почве, зерне, масле и зеленой массе кукурузы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 29.12.2017)

Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения массовой концентрации темботриона в воде в диапазоне 0,0005 - 0,005 мг/дм³, почве - в диапазоне 0,025 - 0,25 мг/кг, зерне, масле и зеленой массе кукурузы - в диапазоне 0,01 - 0,1 мг/кг.

Методические указания носят рекомендательный характер.

Химический класс - трикетонов.

2-[2-хлоро-4-мезил-3-[(2,2,2-трифтороэтокси)метил]бензоил]-циклогексан-1,3-дион (IUPAC).

Структурная формула:

Эмпирическая формула: C₁₇H₁₆ClF₃O₆S.

Молекулярная масса: 440,82.

Бежевый порошок. Давление паров 1,1 x 10^-5 МПа (при 25 °C). Растворимость в органических растворителях (при 20 °C, г/дм³): ацетон - 600; хлористый метилен - 600; этилацетат - 180,2; гексан - 47,6 мг/дм³. Растворимость в воде при 20 °C (г/дм³): 0,22 (pH 4); 28,3 (pH 7); 29,7 (pH 9). Коэффициент распределения в системе н-октанол - вода при 20 °C (pH 7), K_OW logP = -1,1.

Краткая токсикологическая характеристика. Острая пероральная токсичность (LD₅₀) для крыс > 2 000 мг/кг; острая дермальная токсичность (LD₅₀) для крыс > 2 000 мг/кг; острая ингаляционная токсичность (LC₅₀) для крыс > 5,03 мг/дм³.

Область применения. Темботрион - гербицид из класса трикетонов, рекомендуется для уничтожения однолетних и многолетних злаковых и широколистных сорняков в посевах кукурузы.

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций.

Полнота извлечения темботриона, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для всего диапазона измерений (n = 20) приведены в табл. 2.

Методика основана на определении вещества с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на обращенной фазе с тройным квадрупольным масс-спектрометрическим детектором.

Уровни темботриона в образцах воды определяют после концентрирования пробы на патронах C18; в образцах почвы - после микроволновой экстракции из анализируемых проб смесью ацетонитрил - вода - муравьиная кислота (500:500:1, по объему) и центрифугирования. В зерне и зеленой массе кукурузы - после микроволновой экстракции из анализируемых проб смесью ацетонитрил - вода (7:3, по объему), центрифугирования и очистки на патронах C18. В масле кукурузы - после экстракции из анализируемых проб 1%-м раствором уксусной кислоты в ацетонитриле, последовательного центрифугирования и вымораживания, а также очистки на концентрирующих патронах C18.

Нижний предел измерения темботриона в анализируемом объеме пробы - 0,025 нг.

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Примечание. Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией, не требующих дополнительной очистки растворителей.

Примечание. Допускается использование вспомогательных средств измерений, устройств и материалов с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ Р 12.1.019-09, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф.

4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-15. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и ГН 2.2.5.2308-07. Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004-90.

4.3. При работе с газами, находящимися в баллонах под давлением до 15 МПа (150 кгс/см²), необходимо соблюдать Федеральные нормы и правила в области промышленной безопасности "Правила промышленной безопасности опасных производственных объектов, на которых используется оборудование, работающее под избыточным давлением" (утв. Приказом Ростехнадзора от 25.03.2014 N 116). Запрещается открывать вентиль баллона, не установив на нем понижающий редуктор.

Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист, имеющий опыт работы на жидкостном хроматографе, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментальное соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений.

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C и относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Измерениям предшествуют следующие операции: очистка органических растворителей (при необходимости), приготовление подвижной фазы для ВЭЖХ, кондиционирование хроматографической колонки, приготовление растворов, смесей для экстракции, подготовка концентрирующих патронов для очистки экстрактов, приготовление градуировочных растворов, растворов внесения, установление градуировочных характеристик.

Ацетонитрил кипятят с обратным холодильником над пентоксидом фосфора (на 1 дм³ ацетонитрила 20 г пентоксида фосфора) не менее 1 часа, после чего перегоняют. Непосредственно перед употреблением ацетонитрил повторно перегоняют над прокаленным карбонатом калия (на 1 дм³ ацетонитрила 10 г карбоната калия).

Компонент А (смесь вода - ацетонитрил - муравьиная кислота в объемном соотношении 900:100:5): в мерную колбу вместимостью 1 000 см³ помещают 900 см³ деионизированной воды, вносят 5,0 см³ муравьиной кислоты и 100 см³ ацетонитрила, перемешивают, фильтруют через мембранный фильтр, дегазируют.

Компонент Б (0,5%-й раствор муравьиной кислоты в ацетонитриле): в мерную колбу вместимостью 1 000 см³ помещают 500 см³ ацетонитрила, вносят 5,0 см³ муравьиной кислоты, доводят до метки ацетонитрилом, перемешивают, фильтруют через мембранный фильтр, дегазируют.

Каждый компонент подвижной фазы хранят в темном месте (в емкости из темного стекла) не более 14 дней.

Промывают колонку подвижной фазой (смесь компонентов А и Б, приготовленных по п. 7.2, в соотношении 1:1) при скорости подачи растворителя 0,3 см³/мин до установления стабильной базовой линии.

7.4.1. В мерную колбу вместимостью 1 000 см³ помещают 500 см³ ацетонитрила, вносят 1,0 см³ муравьиной кислоты, добавляют 500 см³ бидистиллированной воды, перемешивают.

7.4.2. В мерную колбу вместимостью 1 000 см³ помещают 500 см³ ацетонитрила, вносят 10 см³ уксусной кислоты, доводят до метки ацетонитрилом, перемешивают.

7.4.3. В мерную колбу вместимостью 1 000 см³ помещают 700 см³ ацетонитрила, доводят до метки бидистиллированной водой, перемешивают.

7.4.4. В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 50 см³ метанола, вносят 0,5 см³ муравьиной кислоты, доводят до метки метанолом, перемешивают.

Растворы хранят в темном месте (в емкости из темного стекла) не более 14 дней.

В мерную колбу вместимостью 1 000 см³ помещают 100 см³ ацетонитрила, вносят 1,0 см³ уксусной кислоты, доводят до метки бидистиллированной водой, перемешивают.

Концентрирующие патроны с использованием медицинского одноразового шприца промывают со скоростью прохождения растворителя 1 - 2 капли в секунду: последовательно 2 см³ метанола и 5 см³ бидистиллированной воды. Патроны готовят непосредственно перед использованием.

7.7.1. Исходный раствор темботриона для градуировки (концентрация 100 мкг/см³). В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают (0,0100 +/- 0,0001) г темботриона, добавляют 50 - 70 см³ ацетонитрила, перемешивают, доводят ацетонитрилом до метки, вновь перемешивают. Раствор хранят в холодильнике при температуре (4 +/- 2) °C в течение 6 месяцев.

Растворы N 1 - 6 готовят объемным методом путем последовательного разбавления исходных растворов для градуировки.

7.7.2. Раствор N 1 темботриона для внесения (концентрация 5 мкг/см³). В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 5 см³ исходного раствора темботриона (п. 7.7.1) с концентрацией 100 мкг/см³, разбавляют ацетонитрилом до метки, перемешивают. Раствор N 1 хранят в холодильнике при температуре (4 +/- 2) °C в течение 6 месяцев.

7.7.3. Раствор N 2 темботриона для градуировки (концентрация 1 мкг/см³). В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 1,0 см³ исходного раствора темботриона (п. 7.7.1) с концентрацией 100 мкг/см³, доводят до метки ацетонитрилом, тщательно перемешивают, получают рабочий раствор N 2 с концентрацией темботриона 1 мкг/см³. Раствор N 2 хранят в холодильнике при температуре (4 +/- 2 °C) в течение одного месяца.

7.7.4. Рабочие растворы N 3 - 6 темботриона для градуировки (концентрации 5 - 50 нг/см³). В 4 мерные колбы вместимостью 100 см³ помещают 5, 2, 1 и 0,5 см³ градуировочного раствора N 2 с концентрацией темботриона 1 мкг/см³ (п. 7.7.3), доводят до метки смесью для разбавления градуировочных растворов (приготовленного по п. 7.5), тщательно перемешивают, получают рабочие растворы N 3 - 6 с концентрацией темботриона 50, 20, 10 и 5 нг/см³ соответственно.

Растворы хранят в холодильнике при температуре (4 +/- 2) °C в течение одной недели.

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади пика (I) от концентрации темботриона в растворе (нг/см³), устанавливают методом абсолютной калибровки по 4 растворам для градуировки.

В инжектор хроматографа вводят 5 мм³ градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.2. Осуществляют не менее 5 параллельных измерений.

Отбор проб осуществляют в соответствии с ГОСТ 31861-12 "Вода. Общие требования к отбору проб"; ГОСТ 17.4.3.01-83 "Охрана природы. Почвы. Общие требования к отбору проб", ГОСТ 28168-89 "Почвы. Отбор проб"; ГОСТ 135634-90 "Кукуруза. Требования при заготовках и поставках", ГОСТ Р 53903-10 "Кукуруза кормовая. Технические условия", ГОСТ 8808-2000 "Масло кукурузное. Технические условия"; "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (N 2051-79 от 21.08.79).

Пробы воды отбирают и хранят в бутылях из полиэтилена (полипропилена) при температуре (4 +/- 2) °C одну неделю. Пробы почвы подсушивают и хранят при комнатной температуре в темноте. Образцы зерна, зеленой массы и масла кукурузы хранят в холодильнике при температуре (4 +/- 2) °C не более 5 дней. Для длительного хранения пробы замораживают и хранят при температуре не выше -18 °C.

Образец воды объемом 50 см³ отмеряют с помощью мерного цилиндра из полипропилена, пропускают через концентрирующий патрон, подготовленный по п. 7.6. После нанесения пробы патрон дополнительно промывают 2 см³ деионизованной воды, освобождают от следов влаги (сушат пропусканием воздуха в течение 2 мин). Темботрион элюируют с патрона 5 см³ смеси, приготовленной по п. 7.4.4.

Образец почвы массой 20 г помещают в плоскодонную колбу вместимостью 500 см³, добавляют 50 см³ смеси ацетонитрил - вода - муравьиная кислота (подготовленной по п. 7.4.1), подвергают микроволновой экстракции в течение 3 мин при 250 Вт.

Пробам дают отстояться, затем надосадочную жидкость в объеме приблизительно 20 см³ переносят в центрифужный стакан, центрифугируют 5 мин при 4 000 об./мин. После центрифугирования отбирают в градуированную пробирку на 25 см³ 10 см³ надосадочной жидкости и доводят до 20 см³ смесью для приготовления градуировочных растворов (п. 7.5). Пробу пропускают через мембранный фильтр, анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.2.

Образец измельченного зерна или зеленой массы кукурузы массой 5 г помещают в плоскодонную колбу вместимостью 500 см³, добавляют 50 см³ смеси ацетонитрил - вода (подготовленной по п. 7.4.3), подвергают микроволновой экстракции в течение 1 мин при 250 Вт. Надосадочную жидкость сливают в стеклянный центрифужный стакан, центрифугируют 5 мин при 3 000 об./мин. Раствор после центрифугирования переносят в плоскодонную колбу на 250 см³. Процедуру экстракции повторяют еще 2 раза, используя по 50 см³ смеси, подготовленной по п. 7.4.3. В результате получают 150 см³ экстракта. Отбирают 75 см³ экстракта и упаривают до водного остатка. Водный остаток с помощью медицинского шприца пропускают через концентрирующий патрон, подготовленный по п. 7.6. После этого патрон освобождают от следов влаги (пропусканием воздуха 2 мин). Темботрион элюируют с патрона 5 см³ раствора, приготовленного по п. 7.4.4, затем анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.2.

Образец масла кукурузы, массой 5 г помещают в центрифужную пробирку с крышкой вместимостью 50 см³, добавляют 10 см³ раствора уксусной кислоты в ацетонитриле (подготовленного по п. 7.4.2), встряхивают вручную 2 мин, затем центрифугируют 5 мин при 3 500 об./мин. И ставят пробу на 1 ч в морозильную камеру.

Отбирают аликвоту экстракта объемом 5 см³ в круглодонную колбу, фильтруя через стекловату. Добавляют 5 см³ бидистиллированной воды и ставят в морозильную камеру на 30 мин. После морозильной камеры пробу переносят в новую круглодонную колбу на 50 см³, упаривают до водного остатка и пропускают через концентрирующий патрон, подготовленный по п. 7.6. После этого патрон освобождают от следов влаги (пропусканием воздуха в течение 2 мин). Темботрион элюируют с патрона 5 см³ раствора, приготовленного по п. 7.4.4, затем анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.2.

Измерения выполняют при следующих режимных параметрах.

Жидкостный хроматограф с тандемным масс-спектрометрическим детектором (тройной квадруполь с источником ионизации, оснащенным соосной подачей горячего азота для эффективной десольвации ионов).

Источник ионизации: электростатическое распыление.

Режим работы: регистрация дочерних отрицательных ионов после разрушения материнских ионов (регистрация "перехода").

Материнский ион (масса/заряд): 439,0.

Дочерние ионы (масса/заряд): 403,1 (количественный расчет), 226,1.

Напряжение на фрагментаторе, В: 114.

Энергия разрушения (соударения), В: 9 , 37 .

Скорость сканирования: 200 мс.

Давление на распылителе: 35 psi.

Скорость осушающего газа 1 (азот): 10 дм³/мин.

Температура газа 1: 250 °C.

Скорость газа 2 (азот): 11 дм³/мин.

Температура газа 2: 340 °C.

Температура квадруполей (1 и 3): 100 °C.

Хроматографическая колонка стальная длиной 150 мм, внутренним диаметром 2,1 мм, заполненная обращенно-фазовым сорбентом с привитыми монофункциональными полярными группами C18, зернением 1,8 мкм.

Температура колонки: 40 °C.

Скорость потока элюента: 0,3 см³/мин.

Объем вводимой пробы: 5 мм³.

Подвижная фаза: компонент А - смесь вода - ацетонитрил - муравьиная кислота (900:100:5); компонент Б - 0,5%-й раствор муравьиной кислоты в ацетонитриле. Режим элюирования: изократический (А:Б в соотношении 30:70).

Линейный диапазон детектирования: 0,025 - 0,25 нг.

Образцы, дающие пики большие, чем градуировочный раствор с концентрацией 50 нг/см³, разбавляют подвижной фазой (не более чем в 50 раз).

Содержание темботриона в пробах воды, почвы, зерна, масла и зеленой массы кукурузы (X, мг/кг) рассчитывают по формуле:

A - концентрация темботриона, найденная по градуировочному графику в соответствии с величиной площади хроматографического пика, нг/см³;

V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, см³;

m - масса (объем) анализируемого образца, г (см³);

K - коэффициент, учитывающий объем экстракта, взятого для анализа, K = 1 (вода), K = 5 (почва), K = 2 (зерно, масло и зеленая масса кукурузы).

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости:

X₁, X₂ - результаты параллельных определений, мг/дм³, мг/кг;

r - значение предела повторяемости (табл. 1), при этом .

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

Результат анализа представляют в виде:

- среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг, мг/дм³;

- граница абсолютной погрешности, мг/кг:

- граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

Если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание темботриона в пробе воды - менее 0,0005 мг/дм³; в пробе почвы - менее 0,025 мг/кг; в пробах зерна, масла и зеленой массы кукурузы - менее 0,01 мг/кг".

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляют в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-02 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

13.1. Контроль стабильности градуировочной характеристики.

Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят в начале и по окончании каждой серии анализов.

При контроле стабильности градуировочной характеристики проводят измерения не менее двух образцов концентраций для градуировки, содержание темботриона в которых должно охватывать весь диапазон концентраций от 5 до 50 нг/см³.

Градуировочная характеристика считается стабильной, если для каждого из используемого для контроля градуировочного раствора сохраняется соотношение:

X - концентрация темботриона в пробе при контрольном измерении, нг/см³;

C - известная концентрация градуировочного раствора темботриона, взятая для контроля стабильности градуировочной характеристики, нг/см³;

B - норматив контроля погрешности градуировочной характеристики, % (равен 10% при P = 0,95).

Если величина расхождения (A) превышает 10%, делают вывод о невозможности применения градуировочной характеристики для дальнейших измерений. В этом случае выясняют и устраняют причины нестабильности градуировочной характеристики и повторяют контроль ее стабильности с использованием других градуировочных растворов темботриона, предусмотренных МИ. При повторном обнаружении нестабильности градуировочной характеристики устанавливают ее заново согласно п. 7.8.

Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом "добавок".

Величина добавки C_д должна удовлетворять условию:

- характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой соответственно) мг/кг, мг/дм³, при этом:

- граница абсолютной погрешности, мг/кг, мг/дм³:

- граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

Результат контроля процедуры К_к рассчитывают по формуле:

, , C_д - среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки соответственно, мг/кг, мг/дм³.

Норматив контроля К рассчитывают по формуле:

Проводят сопоставление результата контроля процедуры (К_к) с нормативом контроля (К).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), не должно превышать предела воспроизводимости (R):

X₁, X₂ - результаты измерений, выполненных в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), мг/дм³, мг/кг;

R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.