"МУК 4.1.3268-15. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Измерение остаточного содержания флуопирама в капусте, моркови и огурцах методом капиллярной газожидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 18.06.2015)

1. Разработаны сотрудниками ГНУ Всероссийского НИИ фитопатологии (Л.В. Дубовая, А.М. Макеев).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 22 мая 2015 г. N 1).

3. Утверждены руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 18 июня 2015 г.

4. Введены впервые.

Свидетельство о метрологической аттестации от 27.10.2014 N 01.00225/205-38-14.

Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода капиллярной газожидкостной хроматографии для определения массовых концентраций флуопирама в капусте, моркови и огурцах в диапазоне 0,05 - 0,5 мг/кг.

Методические указания носят рекомендательный характер.

Название действующего вещества по ИСО: флуопирам.

Название действующего вещества по ИЮПАК: N-{2-[3-хлор-5-(трифторметил)пиридин-2-ил]этил}-2-(трифторметил)бензамид.

Структурная формула:

Эмпирическая формула: C₁₆H₁₁ClF₆N₂O.

Молекулярная масса: 396,7.

Белый порошок без запаха. Температура плавления: 117,5 °C. Давление паров при 20 °C: 1,2 x 10^-6 Па. Коэффициент распределения н-октанол/вода при 40 °C: K_ow log P = 3,3 (pH 6,5). Растворимость (г/дм³) при 20 °C: ацетон, дихлорметан, метанол, этилацетат - все более 250, толуол - 62,2, гептан - 0,66, вода - 0,016.

Вещество стабильно на свету и в водных растворах (pH 4 - 9).

Краткая токсикологическая характеристика. Острая пероральная токсичность (LD₅₀) для крыс - более 5 000 млн^-1 (мг/кг); острая дермальная токсичность (LD₅₀) для крыс - более 2 000 млн^-1 (мг/кг); острая ингаляционная токсичность (LK₅₀) для крыс - более 5 112 мг/м³.

Область применения. Флуопирам - новый фунгицид из класса пиридинил-этилбензамидов. Он эффективен в борьбе с возбудителями мучнистой росы, серой гнили, склеротиниоза и монилиального ожога на виноградниках, посадках семечковых и косточковых плодовых, овощных и полевых культурах.

Проходит регистрационные испытания в Российской Федерации в качестве фунгицида в составе смесевого препарата на посевах моркови, посадках капусты и огурцов с нормой расхода до 125 г д.в./га.

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций.

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для всего диапазона измерений (n = 20) приведены в табл. 2.

Метод основан на экстракции флуопирама из кочанов капусты, корнеплодов моркови и плодов огурца водным раствором ацетона, очистке экстрактов от коэкстрактивных компонентов перераспределением в системе несмешивающихся растворителей и на колонке с силикагелем, разделении компонентов очищенных экстрактов методом капиллярной газожидкостной хроматографии при программировании температуры с последующим измерением содержания флуопирама с использованием электронозахватного детектора и обработкой хроматограмм методом абсолютной калибровки.

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Примечание. Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией.

Примечание. Допускается использование вспомогательных средств измерений, устройств и материалов с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

5.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ Р 12.1.019-09, а также требования, изложенные в технической документации на газовый хроматограф.

5.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 и 2.2.5.2308-07. Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004-90.

5.3. При работе с газами, находящимися в баллонах под давлением до 15 МПа (150 кгс/см²), необходимо соблюдать "Правила устройства и безопасной эксплуатации стационарных компрессорных установок, воздухопроводов и газопроводов под давлением", ПБ-03-576-03. Запрещается открывать вентиль баллона, не установив на нем понижающий редуктор.

К выполнению измерений допускают специалиста, прошедшего обучение, освоившего методику, владеющего техникой, имеющего опыт работы на газовом хроматографе, и подтвердившего соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений.

При выполнении измерений соблюдают следующие условия.

Перед выполнением измерений проводят следующие операции: очистка органических растворителей (при необходимости), приготовление растворов, кондиционирование хроматографической колонки, установление градуировочной характеристики, подготовка колонки с силикагелем, проверка хроматографического поведения флуопирама на колонке.

Растворитель последовательно промывают порциями концентрированной серной кислоты до прекращения окрашивания последней в желтый цвет, затем водой до нейтральной реакции промывных вод, перегоняют над калием углекислым. Срок хранения - 1 неделя.

Навеску (5 +/- 0,1) г натрия углекислого в конической колбе растворяют в 40 - 60 см³ деионизованной воды. Полученный раствор переносят в мерную колбу вместимостью 100 см³ и доводят объем раствора до метки деионизованной водой.

Срок хранения раствора 1 неделя.

Этилацетат промывают последовательно раствором натрия углекислого с массовой долей 5%, насыщенным раствором хлорида кальция, сушат над безводным углекислым калием и перегоняют. Срок хранения - 1 неделя.

Ацетон перегоняют над перманганатом калия и калием углекислым (на 1 дм³ ацетона - 10 г калия перманганата и 2 г калия углекислого). Срок хранения - 1 неделя.

В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают (0,010 +/- 0,0001) г флуопирама, растворяют в 40 - 50 см³ ацетона, доводят объем раствора этим же растворителем до метки, тщательно перемешивают. Получают раствор вещества с концентрацией 100 мкг/см³.

В мерные колбы вместимостью 100 см³ помещают 1 и 10 см³ исходного раствора флуопирама с концентрацией 100 мкг/см³, разбавляют ацетоном до метки и перемешивают. Получают растворы вещества с концентрациями 1 и 10 мкг/см³ соответственно. Эти растворы используются для приготовления проб кочанов, корнеплодов и плодов с внесением при оценке полноты извлечения флуопирама из исследуемых образцов. Растворы хранят при температуре не выше -18 °C в течение месяца.

Капиллярную кварцевую колонку устанавливают в термостат хроматографа и, не подсоединяя к детектору, кондиционируют при температуре 280 °C и скорости газа-носителя 2 см³/мин в течение 8 - 10 часов.

8.4.1. Исходный раствор флуопирама для градуировки с массовой концентрацией 100 мкг/см³. В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают (0,010 +/- 0,0001) г флуопирама, растворяют в 30 - 40 см³ этилацетата, доводят объем раствора до метки этилацетатом, тщательно перемешивают.

Раствор хранят при температуре не выше -18 °C в течение 2 месяцев.

8.4.2. Градуировочный раствор флуопирама с массовой концентрацией 1 мкг/см³ (раствор N 1). В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 1 см³ исходного раствора флуопирама с концентрацией 100 мкг/см³ (п. 8.4.1), разбавляют смесью гексан-этилацетат в объемном соотношении 8:2 до метки. Этот раствор используют для приготовления рабочих градуировочных растворов N 2 - 5.

Градуировочный раствор N 1 хранят при температуре не выше -18 °C в течение месяца.

8.4.3. Градуировочные растворы флуопирама с массовой концентрацией (0,01 - 0,1) мкг/см³ (растворы N 2 - 5). В 4 мерные колбы вместимостью 100 см³ помещают 1, 2, 5 и 10 см³ градуировочного раствора N 1 флуопирама с массовой концентрацией 1 мкг/см³ (п. 8.4.2), доводят до метки смесью гексан-этилацетат в объемном соотношении 8:2, тщательно перемешивают, получают рабочие растворы N 2 - 5 с концентрацией флуопирама 0,01; 0,02; 0,05 и 0,1 мкг/см³ соответственно.

Растворы готовят непосредственно перед использованием.

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади пика (мВ·с) от концентрации флуопирама в растворе (мкг/см³), устанавливают методом абсолютной калибровки по 4 градуировочным растворам.

В инжектор хроматографа вводят по 1 мм³ каждого градуировочного раствора (п. 8.4.3) и анализируют при условиях п. 7.2. Осуществляют не менее 3 параллельных измерений. Расхождение между параллельными определениями не должно превышать предел повторяемости r.

По полученным данным строят градуировочную характеристику.

Контроль стабильности градуировки проводят не реже 1 раза в три месяца, а также при смене реактивов или изменении условий анализа.

Для контроля стабильности используют вновь приготовленные градуировочные растворы с массовой концентрацией исследуемого вещества в начале, середине и в конце диапазона измерений, которые анализируют в точном соответствии с методикой.

Градуировочную характеристику считают стабильной, если для каждого контрольного образца выполняется условие:

где S_изм, S_гр - значение площади пика флуопирама в образце для контроля, измеренное и найденное по градуировочной характеристике соответственно, мВ·с;

К_гр - норматив контроля погрешности градуировочной характеристики, % (равен 10% при P = 0,95).

Если величина расхождения (A) превышает 10%, делают вывод о невозможности применения градуировочной характеристики для дальнейших измерений. В этом случае выясняют причины нестабильности градуировочной характеристики и повторяют контроль стабильности с использованием других образцов для градуировки, предусмотренных методикой. При повторном обнаружении нестабильности градуировки прибор градуируют заново.

Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

Нижнюю часть стеклянной колонки длиной 20 см и внутренним диаметром 8 - 10 мм уплотняют тампоном из стекловаты, медленно выливают в колонку (при открытом кране) суспензию 3 г силикагеля в 10 см³ гексана. Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента и помещают на него слой безводного сернокислого натрия высотой 1 см. Колонку промывают последовательно 20 см³ ацетона и 10 см³ гексана со скоростью 1 - 2 капли в секунду, после чего она готова к работе.

При отработке методики или поступлении новой партии силикагеля проводят определение объема элюента, необходимого для полного вымывания флуопирама из колонки с силикагелем.

В круглодонную колбу вместимостью 10 см³ помещают 0,5 см³ градуировочного раствора флуопирама в смеси гексан-этилацетат в объемном соотношении 8:2 с массовой концентрацией 1 мкг/см³ (п. 8.4.2) и выпаривают его досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 40 °C. Сухой остаток растворяют в 3 см³ смеси гексан-этилацетат (8:2 по объему), помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин. Раствор наносят на колонку с силикагелем, подготовленную по п. 8.7. Промывают колонку 40 см³ смеси гексан-этилацетат (8:2 по объему) со скоростью 1 - 2 капли в секунду, элюат отбрасывают. Затем через колонку пропускают 60 см³ смеси гексан-этилацетат в объемном соотношении 7:3, отбирая последовательно по 5 см³ элюата. Каждую фракцию упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 40 °C, сухие остатки растворяют в 2 см³ смеси гексан-этилацетат (8:2 по объему), помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин, и затем хроматографируют в соответствии с п. 7.2.

По результатам обнаружения флуопирама в каждой из фракций определяют объем смеси гексан-этилацетат (7:3 по объему), необходимый для полного вымывания флуопирама из колонки.

Отбор проб проводят в соответствии с требованиями ГОСТ 1726-85 "Огурцы свежие. Технические условия", ГОСТ 1724-85 "Капуста белокочанная свежая, заготовляемая и поставляемая. Технические условия", ГОСТ Р 51809-01 "Капуста белокочанная свежая, реализуемая в розничной торговой сети. Технические условия", ГОСТ Р 51782-01 "Морковь столовая свежая, реализуемая в розничной торговой сети. Технические условия", ГОСТ 28275-94 "Морковь столовая свежая. Руководство по хранению", ГОСТ 1721-85 "Морковь столовая свежая. Технические условия" и "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (N 2051-79 от 21.08.79).

Пробы кочанов капусты, корнеплодов моркови и плодов огурца хранят в стеклянной или полиэтиленовой таре в холодильнике в темноте при температуре 4 °C не более 5 дней; для длительного хранения пробы замораживают и хранят при температуре не выше -18 °C до анализа. Перед проведением анализа образцы измельчают.

В мерную колбу вместимостью 500 см³ вносят 100 см³ бидистиллированной воды и доводят объем раствора до метки ацетоном. Срок хранения - 1 неделя.

Измельченный образец моркови, капусты и огурцов массой 20 г помешают в стакан гомогенизатора вместимостью 500 см³, добавляют 100 см³ водного раствора ацетона с объемной долей 80% и гомогенизируют 3 минуты при 10 000 об./мин. Суспензию фильтруют под вакуумом на воронке Бюхнера через бумажный фильтр в колбу Бунзена вместимостью 250 см³. Осадок на фильтре промывают 50 см³ водного раствора ацетона с объемной долей 80%. Экстракт и промывную жидкость переносят в химический стакан, перемешивают, измеряют объем раствора. Аликвоту фильтрата, эквивалентную 2 г анализируемого образца, переносят в круглодонную колбу вместимостью 100 см³, добавляют 15 см³ бидистиллированной воды и упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 40 °C до водного остатка (5 - 7 см³). Далее проводят очистку экстракта по п. 10.2.

Водный остаток, полученный по п. 10.1, переносят в делительную воронку вместимостью 100 см³. Колбу ополаскивают 20 см³ бидистиллированной воды, которую также переносят в делительную воронку. Вносят в воронку 30 см³ гексана и содержимое интенсивно встряхивают в течение 2 минут. После разделения фаз органический слой фильтруют через слой безводного сернокислого натрия в круглодонную колбу вместимостью 100 см³. Операцию экстракции водной фазы повторяют еще дважды, используя 30 и 20 см³ гексана. Объединенную органическую фракцию упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 35 °C. Далее проводят очистку экстракта по п. 10.3.

Остаток экстракта в круглодонной колбе, полученный по п. 10.2, растворяют в 2 см³ смеси гексан-этилацетат в объемном соотношении 8:2, помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин. Раствор наносят на колонку, подготовленную по п. 8.7. Колбу обмывают 3 см³ смеси гексан-этилацетат (8:2 по объему), которую также наносят на колонку. Колонку промывают 40 см³ смеси гексан-этилацетат (8:2 по объему) со скоростью 1 - 2 капли в секунду, элюат отбрасывают. Флуопирам элюируют с колонки 40 см³ смеси гексан-этилацетат в объемном соотношении 7:3, собирая элюат непосредственно в круглодонную колбу вместимостью 100 см³. Раствор упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 40 °C. Сухие остатки экстрактов кочанов капусты, корнеплодов моркови и плодов огурца растворяют в 10 см³ гексана и растворы анализируют на содержание флуопирама по п. 11.1.

Полнота извлечения флуопирама при проведении всех операций подготовки пробы не менее 86% для образцов кочанов, корнеплодов и плодов.

11.1. В инжектор хроматографа вводят 1 мм³ очищенного экстракта анализируемой пробы (пп. 10.1 - 10.3), анализируют при условиях п. 7.2 и регистрируют хроматограмму. Каждый экстракт хроматографируют дважды.

11.2. Для каждого образца кочанов, корнеплодов и плодов повторяют операции по пп. 10.1 - 10.3, 11.1.

12.1. Для обработки результатов хроматографического анализа используется программа сбора и обработки хроматографической информации.

Альтернативная обработка результатов.

По градуировочной характеристике находят значение массовой концентрации флуопирама в экстрактах, C, мкг/см³.

Массовую долю флуопирама (X, мг/кг) в образцах кочанов, корнеплодов и плодов рассчитывают по формуле:

где C - значение массовой концентрации флуопирама в экстракте, мкг/см³;

V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, см³;

m - масса анализируемой части образца, соответствующая доле экстракта, использованной для очистки на колонке с силикагелем и последующего хроматографического определения, г;

0,86 - коэффициент извлечения флуопирама, учитывающий все процедуры подготовки пробы.

12.2. За результат измерений принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, если выполняется условие приемлемости:

где X₁, X₂ - результаты параллельных определений массовой доли флуопирама, мг/кг;

r - значение предела повторяемости, % (табл. 1).

Если условие (3) не выполняется, выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и повторяют выполнение измерений в соответствии с требованиями МИ.

12.3. Результат анализа в документах, предусматривающих его использование, представляют в виде:

где - среднее арифметическое значение результатов n определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

- границы относительной погрешности измерений, % (табл. 1).

В случае, если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание флуопирама в пробах капусты, моркови и огурца - менее 0,05 мг/кг"*

Экстракты, при хроматографировании которых получают аналитический сигнал флуопирама, превышающий аналитический сигнал, получаемый при хроматографировании градуировочного раствора с массовой концентрацией 0,1 мкг/см³, разбавляют и анализируют в соответствии с данной методикой.

13.1. Проверку приемлемости результатов измерений в условиях воспроизводимости проводят:

а) при возникновении спорных ситуаций между двумя лабораториями;

б) при проверке совместимости результатов измерений, полученных при сличительных испытаниях (при проведении аккредитации лабораторий и инспекционного контроля).

13.2. Для проведения проверки приемлемости результатов измерений в условиях воспроизводимости каждая лаборатория использует пробы, оставленные на хранение.

13.3. Расхождение между результатами измерений, выполненных в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), не должно превышать предела воспроизводимости (R)

где X₁, X₂ - результаты измерений массовой доли флуопирама, выполненных в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), мг/кг;

R - предел воспроизводимости (%), рассчитываемый по формуле .

Если предел воспроизводимости не превышен, то приемлемы все результаты измерений и в качестве окончательного результата используют их среднее арифметическое значение. Если предел воспроизводимости превышен, то выполняют процедуры, изложенные в ГОСТ Р ИСО 5725-6-02 (п. 5.3.3).

При разногласиях руководствуются ГОСТ Р ИСО 5725-6-02 (п. 5.3.4).

Контроль качества результатов измерений в лаборатории при реализации методики осуществляют по ГОСТ Р ИСО 5725-6-02 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений", используя контроль стабильности среднеквадратического (стандартного) отклонения повторяемости по п. 6.2.2 ГОСТ Р ИСО 5725-6-02 и показателя правильности по п. 6.2.4 ГОСТ Р ИСО 5725-6-02.

Рекомендуется устанавливать контролируемый период так, чтобы количество результатов контрольных измерений было от 20 до 30.

При неудовлетворительных результатах контроля, например, при превышении предела действия или регулярном превышении предела предупреждения, выясняют причины этих отклонений, в том числе проводят смену реактивов, проверяют работу оператора.