"МУК 4.1.3454-17. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств седаксана в воде, почве, зерне и соломе зерновых колосовых культур методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 15.03.2017)

1. Разработаны ФБУН "Федеральный научный центр гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана" Роспотребнадзора (В.Н. Ракитский, Н.Е. Федорова, В.В. Баюшева).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 22 декабря 2016 г. N 2).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 15 марта 2017 г.

4. Введены впервые.

Свидетельство об аттестации N РОСС RU.0001.310430/0267.27.04.16.

Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения в воде, почве, зерне и соломе зерновых колосовых культур массовой концентрации транс- и цис-седаксана в диапазонах 0,00002 - 0,0008 мг/дм³, 0,00025 - 0,01 мг/кг и 0,005 - 0,2 мг/кг (зерно, солома) соответственно.

Методические указания носят рекомендательный характер.

Седаксан - смесь цис- и транс-изомеров 2'[(1RS, 2SR)-1,1'-бициклопро-2-ил]-3-(дифторметил)-1-метилпиразол-4-карбоксанилид (ИЮПАК).

C₁₈H₁₉F₂N₃O

Молекулярная масса: 331,4.

Белое порошкообразное вещество без запаха. Температура плавления: 121,4 °C. Давление паров: 6,5 x 10^-5 МПа (при 20 °C); 1,7 x 10^-4 МПа (при 25 °C). Растворимость в органических растворителях при 25 °C (в г/дм³): ацетон - 410; н-гексан - 0,41; дихлорметан - 500; метанол - 110; октанол - 20; толуол - 70; этилацетат - 200. Растворимость в воде при 25 °C: 0,014 г/дм³. Седаксан гидролитически стабилен при температуре 25 °C и в диапазоне pH 5; 7 и 9.

Краткая токсикологическая характеристика. Острая пероральная токсичность (LD₅₀) для крыс > 5 000 мг/кг; острая дермальная токсичность (LD₅₀) для кроликов > 5 000 мг/кг; острая ингаляционная токсичность (LC₅₀) для крыс > 5,24 мг/дм³ (4 часа).

Область применения. Седаксан - фунгицид широкого спектра действия, рекомендуется к использованию в качестве протравителя семян злаковых культур для борьбы с широким спектром патогенов.

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций.

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для всего диапазона измерений (n = 20) приведены в табл. 2.

Методика основана на определении вещества с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на обращенной фазе с тройным квадрупольным масс-спектрометрическим детектором.

Уровни транс- и цис-седаксана в образцах почвы, зерна и соломы зерновых колосовых культур определяют после экстракции из анализируемых проб смесью ацетонитрил-вода, центрифугирования, очистки экстракта на концентрирующих патронах на основе сополимера дивинилбензола и N-винилпирролидона. Данные патроны использованы для концентрирования проб воды.

Нижний предел измерения каждого изомера седаксана в анализируемом объеме пробы - 0,001 нг.

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Примечание. Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией, не требующих дополнительной очистки растворителей.

Примечание. Допускается использование вспомогательных устройств и материалов с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ Р 12.1.019-09, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф.

4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и ГН 2.2.5.2308-07. Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004-90.

4.3. При работе с газами, находящимися в баллонах под давлением до 15 МПа (150 кгс/см²), необходимо соблюдать Федеральные нормы и правила в области промышленной безопасности "Правила промышленной безопасности опасных производственных объектов, на которых используется оборудование, работающее под избыточным давлением" (утв. Приказом Ростехнадзора от 25.03.2014 N 116). Запрещается открывать вентиль баллона, не установив на нем понижающий редуктор.

Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист, имеющий опыт работы на жидкостном хроматографе, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений.

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C и относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Измерениям предшествуют следующие операции: очистка ацетонитрила (при необходимости), приготовление растворов, градуировочных растворов, растворов внесения, смесей для экстракции, подвижной фазы для ВЭЖХ, кондиционирование хроматографической колонки, установление градуировочных характеристик, подготовка концентрирующих патронов для очистки экстрактов.

Ацетонитрил кипятят с обратным холодильником над пентоксидом фосфора (на 1 дм³ ацетонитрила 20 г пентоксида фосфора) не менее 1 часа, после чего перегоняют, непосредственно перед употреблением ацетонитрил повторно перегоняют над прокаленным карбонатом калия (на 1 дм³ ацетонитрила 10 г карбоната калия).

В мерную колбу вместимостью 1 000 см³ помещают 500 см³ ацетонитрила, вносят 0,22 см³ муравьиной кислоты, доводят до метки ацетонитрилом, перемешивают.

Раствор хранят в темном месте (в емкости из темного стекла) не более 14 дней.

Компонент А: в мерную колбу вместимостью 1 000 см³ помещают 500 см³ ацетонитрила, вносят 0,22 см³ муравьиной кислоты, доводят до метки ацетонитрилом, перемешивают, фильтруют через мембранный фильтр.

Компонент Б: в мерную колбу вместимостью 1 000 см³ помещают 500 см³ деионизированной воды, вносят 0,22 см³ муравьиной кислоты, доводят до метки деионизированной водой, перемешивают, фильтруют через мембранный фильтр.

Каждый компонент подвижной фазы хранят в темном месте (в емкости из темного стекла) не более 14 дней.

Промывают колонку подвижной фазой (смесь компонентов А и Б, приготовленных по п. 7.3, в соотношении 1:1) при скорости подачи растворителя 0,4 см³/мин до установления стабильной базовой линии.

7.5.1. В мерную колбу вместимостью 1 000 см³ помещают 800 см³ ацетонитрила, 200 см³ деионизованной воды, перемешивают.

7.5.2. В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 90 см³ ацетонитрила, 10 см³ деионизованной воды, перемешивают.

Растворы хранят в темном месте (в емкости из темного стекла) не более 14 дней.

В мерную колбу вместимостью 1 000 см³ помещают 500 см³ ацетонитрила, 500 см³ деионизованной воды, перемешивают.

Раствор хранят в темном месте (в емкости из темного стекла) не более 14 дней.

Патрон устанавливают на аллонж с прямым отводом для вакуума.

Концентрирующие патроны промывают с помощью разряжения, создаваемого водоструйным насосом, со скоростью прохождения растворителя через патрон 1 - 2 капли в секунду: последовательно метанолом и бидистиллированной водой (по 2 см³). Патроны готовят непосредственно перед использованием.

7.8.1. Исходный раствор транс-седаксана для градуировки (концентрация 100 мкг/см³). В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают (0,0100 +/- 0,0001) г транс-седаксана, добавляют 50 - 70 см³ ацетонитрила, перемешивают, доводят ацетонитрилом до метки, вновь перемешивают. Раствор хранятся в холодильнике при температуре (4 +/- 2) °C в течение 6 месяцев.

7.8.2. Исходный раствор цис-седаксана для градуировки (концентрация 100 мкг/см³). В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают (0,0100 +/- 0,0001) г цис-седаксана, добавляют 50 - 70 см³ метанола, перемешивают, доводят метанолом до метки, вновь перемешивают. Раствор хранятся в холодильнике при температуре (4 +/- 2) °C в течение 6 месяцев.

Растворы N 1 - 8 готовят объемным методом путем последовательного разбавления исходных растворов для градуировки.

7.8.3. Растворы N 1 транс- или цис-седаксана для градуировки и внесения (концентрация 10 мкг/см³). В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 10 см³ исходного раствора транс- (п. 7.8.1.) или цис-седаксана (п. 7.8.2) с концентрацией 100 мкг/см³, разбавляют ацетонитрилом до метки, перемешивают. Растворы N 1 хранятся в холодильнике при температуре (4 +/- 2) °C в течение 6 месяцев.

7.8.4. Раствор N 2 транс- и цис-седаксана для градуировки и внесения (концентрация каждого вещества 1 мкг/см³). В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают по 10,0 см³ градуировочных растворов N 1 с концентрацией транс- и цис-седаксана 10,0 мкг/см³ (п. 7.8.3), доводят до метки ацетонитрилом, тщательно перемешивают, получают рабочий раствор N 2 с концентрацией транс- и цис-седаксана 1 мкг/см³. Раствор N 2 хранится в холодильнике при температуре (4 +/- 2) °C в течение одного месяца.

7.8.5. Рабочие растворы N 3 - 8 транс- и цис-седаксана для градуировки (концентрация каждого вещества по 0,2 - 8,0 нг/см³). В 2 мерные колбы вместимостью 100 см³ помещают по 0,8 и 0,4 см³ градуировочного раствора N 2 с концентрацией транс- и цис-седаксана 1 мкг/см³ (п. 7.8.4), доводят до метки смесью растворителей, приготовленной по п. 7.6, тщательно перемешивают, получают рабочие растворы N 3 - 4 с концентрацией транс- и цис-седаксана 8,0 и 4,0 нг/см³ соответственно.

В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают по 25 см³ градуировочного раствора N 3 с концентрацией транс- и цис-седаксана 8,0 нг/см³, доводят до метки смесью растворителей, приготовленной по п. 7.6, тщательно перемешивают, получают рабочий раствор N 5 с концентрацией транс- и цис-седаксана по 2,0 нг/см³.

В 3 мерные колбы вместимостью 100 см³ помещают по 25, 12,5 и 5 см³ градуировочного раствора N 4 с концентрацией транс- и цис-седаксана 4,0 нг/см³, доводят до метки смесью растворителей, приготовленной по п. 7.6, тщательно перемешивают, получают рабочие растворы N 6 - 8 с концентрацией транс- и цис-седаксана 1,0; 0,5 и 0,2 нг/см³ соответственно.

Растворы хранятся в холодильнике при температуре (4 +/- 2) °C в течение одной недели.

Растворы с концентрацией 1 мкг/см³, 4 и 8 нг/см³ используют для приготовления проб с внесением при оценке полноты извлечения веществ методом "внесено-найдено", а также при контроле качества результатов измерений методом добавок.

Градуировочные характеристики, выражающие зависимость площади пика (I) от концентрации транс- и цис-седаксана в растворе (нг/см³), устанавливают методом абсолютной калибровки по 6 растворам для градуировки.

В инжектор хроматографа вводят по 5 мм³ каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.2. Осуществляют не менее 5 параллельных измерений.

Отбор проб осуществлен в соответствии с ГОСТ 31861-12 "Вода. Общие требования к отбору проб"; ГОСТ 17.4.3.01-83 "Охрана природы. Почвы. Общие требования к отбору проб", ГОСТ 28168-89 "Почвы. Отбор проб"; ГОСТ 13586.3-15 "Зерно. Правила приемки и методы отбора проб"; ГОСТ Р ИСО 24333-11 "Зерно и продукты его переработки. Отбор проб"; ГОСТ Р ИСО 6497-11 "Корма для животных. Отбор проб"; "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов (N 2051-79 от 21.08.79).

Пробы воды отбирают и хранят в бутылях из полиэтилена (полипропилена) при температуре (4 +/- 2) °C 1 неделю. Пробы почвы, зерна и соломы подсушивают и хранят при комнатной температуре не более 2 недель. Для длительного хранения образцы замораживают и хранят при температуре не выше -18 °C.

9.1.1. Вода. Образец воды объемом 50 см³ отмеряют с помощью мерного цилиндра из полипропилена, пропускают через концентрирующий патрон, подготовленный по п. 7.7. После нанесения пробы, патрон дополнительно промывают 2 см³ деионизованной воды, освобождают от следов влаги (сушат 10 мин) под вакуумом. Седаксан элюируют с патрона 5 см³ ацетонитрила.

9.1.2. Почва. Образец почвы массой 10 г помещают в плоскодонную колбу вместимостью 250 - 300 см³, добавляют 50 см³ смеси ацетонитрил-вода (подготовленной по п. 7.5.1), интенсивно встряхивают в течение 1 мин, затем помещают на аппарат для встряхивания на 60 мин.

Пробам дают отстояться. Затем раствор переносят в центрифужный стакан на 100 см³, центрифугируют 5 мин при 4 000 об./мин. Переносят аликвоту экстракта объемом 10 см³ (соответствующую 2 г пробы почвы) в колбу на 50 см³ и доводят водой до метки, перемешивают.

Далее проводят очистку экстракта на концентрирующем патроне. Для этого, полученный раствор фильтруют с помощью разряжения, создаваемого водоструйным насосом, через концентрирующий патрон, подготовленный по п. 7.7, со скоростью прохождения раствора 1 - 2 см³/мин, пропуская раствор до верхнего края сорбента. После нанесения пробы, патрон дополнительно промывают 2 см³ смеси ацетонитрил-вода (подготовленной по п. 7.5.2). Седаксан элюируют с патрона 1 см³ ацетонитрила, доводят конечный объем до 2,5 см³ деионизованной водой, перемешивают, выдерживают 1 - 2 мин на ультразвуковой ванне, фильтруют через мембранный фильтр, анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.2.

9.1.3. Зерно и солома. Образец измельченного зерна массой 10 г помещают в плоскодонную колбу вместимостью 250 - 300 см³, добавляют 100 см³ смеси ацетонитрил-вода (подготовленной по п. 7.5.1), интенсивно встряхивают в течение 1 мин, затем помещают на аппарат для встряхивания на 30 минут.

Образец измельченной соломы массой 5 г помещают в плоскодонную колбу вместимостью 250 - 300 см³, вносят 25 см³ деионизованной воды, оставляют на 30 мин, затем добавляют 100 см³ смеси ацетонитрил-вода (подготовленной по п. 7.5.1), интенсивно встряхивают в течение 1 мин, затем помещают на аппарат для встряхивания на 30 минут.

Пробам дают отстояться. Затем раствор переносят в центрифужный стакан на 100 см³, центрифугируют 5 мин при 3 500 об./мин.

Переносят аликвоту экстракта зерна объемом 1,0 см³ (соответствующую 0,1 г пробы), аликвоту экстракта соломы объемом 2,5 см³ (соответствующую 0,1 г пробы) в градуированную пробирку соответственно на 10 см³ (зерно) и 15 см³ (солома), доводят водой до 10 см³ (зерно) и 11,5 см³ (солома), перемешивают.

Далее проводят очистку экстракта на концентрирующем патроне. Растворы, находящиеся в градуированный пробирках, фильтруют с помощью разряжения, создаваемого водоструйным насосом через концентрирующий патрон, подготовленный по п. 7.7, со скоростью прохождения раствора 1 - 2 см³/мин, пропуская раствор до верхнего края сорбента. После нанесения пробы, патрон дополнительно промывают 1 см³ воды. Патрон сушат 15 мин под вакуумом. Седаксан элюируют с патрона 1,25 см³ ацетонитрила, доводят конечный объем до 2,5 см³ деионизованной водой, перемешивают, выдерживают 1 - 2 мин на ультразвуковой ванне, фильтруют через мембранный фильтр, анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.2.

Измерения выполняют при следующих режимных параметрах.

Жидкостный хроматограф с тандемным масс-спектрометрическим детектором: тройной квадруполь с источником ионизации, оснащенным соосной подачей горячего азота для эффективной десольвации ионов.

Источник ионизации: электростатическое распыление.

Режим работы: регистрация дочерних положительных ионов после разрушения материнских ионов (регистрация "перехода").

Транс-седаксан

Материнский ион (масса/заряд): 332,16.

Дочерние ионы (масса/заряд): 159,0 (количественный расчет), 292,1.

Напряжение на фрагментаторе, В: 110.

Энергия разрушения (соударения), В: 13 , 9 .

Цис-седаксан

Материнский ион (масса/заряд): 332,16.

Дочерние ионы (масса/заряд): 159,0 (количественный расчет), 292,1.

Напряжение на фрагментаторе, В: 110.

Энергия разрушения (соударения), В: 17 , 9 .

Скорость сканирования: 200 мс.

Давление на распылителе: 35 psi.

Скорость осушающего газа 1 (азот): 10 дм³/мин.

Температура газа 1: 350 °C.

Скорость газа 2 (азот): 12 дм³/мин.

Температура газа 2: 400 °C.

Температура квадруполей (1 и 3): 100 °C.

Хроматографическая колонка стальная, длиной 50 мм, внутренним диаметром 2,1 мм, заполненная обращено-фазовым сорбентом с привитыми монофункциональными полярными группами C18, зернением 1,8 мкм.

Температура колонки: 40 °C.

Скорость потока элюента: 0,4 см³/мин.

Объем вводимой пробы: 5 мм³.

Подвижная фаза: ацетонитрил-вода (1:1, по объему, 0,22 см³/дм³ муравьиной кислоты).

Линейный диапазон детектирования 1 - 40 пг.

Образцы, дающие пики большие, чем градуировочный раствор с концентрацией 8,0 нг/см³, разбавляют подвижной фазой (не более чем в 50 раз).

Содержание седаксана (в виде суммы транс- и цис-изомеров) в пробах воды, почвы, зерна и соломы (X, мг/дм³, мг/кг) рассчитывают по формуле:

A, B - концентрации транс- и цис-седаксана соответственно, найденные по градуировочным графикам в соответствии с величинами площадей хроматографических пиков, нг/см³;

V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, см³;

m - масса (объем) анализируемого образца, г, см³;

C - коэффициент, учитывающий объем экстракта, взятого для анализа, C = 100 (зерно), 50 (солома), C = 5 (почва), C = 10 (вода).

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости:

X₁, X₂ - результаты параллельных определений, мг/кг;

R - значение предела повторяемости (табл. 1), при этом .

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

Результат анализа представляют в виде: , мг/кг, мг/дм³ при вероятности P = 0,95, где

- среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг, мг/дм³;

- граница абсолютной погрешности, мг/кг:

- граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

Если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание седаксана (в виде суммы транс- и цис-изомеров) в пробе воды - менее 0,00004 мг/дм³; в пробе почвы - менее 0,0005 мг/кг; в пробе зерна и соломы - менее 0,01 мг/кг" <*>.

--------------------------------

<*> 0,00004 мг/дм³; 0,0005 мг/кг; 0,01 мг/кг - пределы обнаружения седаксана (в виде суммы транс- и цис-изомеров) в воде, почве, зерне и соломе соответственно.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-02 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

13.1. Контроль стабильности градуировочной характеристики.

Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят в начале и по окончании каждой серии анализов.

При контроле стабильности градуировочной характеристики проводят измерения не менее двух образцов концентраций для градуировки, содержание транс- и цис-седаксана в которых должно охватывать весь диапазон концентраций от 0,2 до 8,0 нг/см³.

Градуировочная характеристика считается стабильной, если для каждого из используемого для контроля градуировочного раствора сохраняется соотношение:

X - концентрация транс- и цис-седаксана в пробе при контрольном измерении, нг/см³;

C - известная концентрация градуировочного раствора транс- и цис-седаксана, взятая для контроля стабильности градуировочной характеристики, нг/см³;

B - норматив контроля погрешности градуировочной характеристики, % (равен 10% при P = 0,95).

Если величина расхождения (A) превышает 10%, делают вывод о невозможности применения градуировочной характеристики для дальнейших измерений. В этом случае выясняют и устраняют причины нестабильности градуировочной характеристики и повторяют контроль ее стабильности с использованием других градуировочных растворов транс- и цис-седаксана, предусмотренных МИ. При повторном обнаружении нестабильности градуировочной характеристики устанавливают ее заново согласно п. 7.9.

Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом добавок.

Величина добавки C_д должна удовлетворять условию:

- характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой соответственно), мг/кг, мг/дм³, при этом:

- граница абсолютной погрешности, мг/кг, мг/дм³:

- граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

Результат контроля процедуры К_к рассчитывают по формуле:

, , C_д - среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки соответственно, мг/кг, мг/дм³.

Норматив контроля К рассчитывают по формуле:

Проводят сопоставление результата контроля процедуры (К_к) с нормативом контроля (К).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (3) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (3) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), не должно превышать предела воспроизводимости (R):

X₁, X₂ - результаты измерений, выполненных в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), мг/кг;

R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.