"МУК 4.1.3173-14. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Измерение массовой концентрации (3R,5S,6E)-7-[4-(4-фторфенил)-6-(1-метилэтил)-2-(метил(метилсульфонил)амино)-5-пиримидинил]-3,5-дигидрокси-6-гептеновая кислота, кальциевая соль (2:1) (розувастатин кальция) в воздухе рабочей зоны методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 23.07.2014)

Разработаны сотрудниками ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России (Н.Г. Иванов), ОАО "ВНЦ БАВ" (М.И. Голубева, Л.И. Крымова) и ЗАО "Алгама" (Н.П. Сергеюк), ОАО "Фармстандарт Томскхимфарм" (С.А. Еникеева, Ю.Н. Шубенкова).

Свидетельство о государственной метрологической аттестации N 01.00225/205-23-13.

Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) для измерения массовой концентрации розувастатина кальция в воздухе рабочей зоны в диапазоне массовых концентраций 0,015 - 0,15 мг/м³.

Методические указания по измерению массовой концентрации розувастатина кальция в воздухе рабочей зоны методом ВЭЖХ предназначены для использования в санитарно-гигиенических, экологических, лечебных и научных организациях, осуществляющих деятельность в области профпатологии и экологии человека.

Методические указания носят рекомендательный характер.

Розувастатин кальция.

Структурная формула:

Эмпирическая формула: C₄₄H₅₄F₂N₆O₁₂S₂Ca.

Молекулярная масса 1001,14.

Регистрационный номер CAS: 147098-20-2.

Розувастатин кальция - аморфный порошок от белого до кремового цвета, горького вкуса, с температурой плавления 42 °C, легкорастворим в ацетонитриле, малорастворим в воде и спирте метиловом, слабо растворим в спирте этиловом, практически нерастворим в гексане, гидрофилен, высокоокисляющийся агент, хранят в тщательно закрытом контейнере в прохладном, сухом месте.

Агрегатное состояние в воздухе - аэрозоль + пары.

Розувастатин кальция относится к сердечно-сосудистым гиполипидемическим средствам группы статинов, умеренно опасен при введении в желудок, малотоксичен при введении в брюшную полость, оказывает слабое местное раздражающее действие на слизистые оболочки и кожу, обладает кумулятивной активностью, не проникает через кожные покровы. При ингаляционном поступлении оказывает влияние на обмен веществ, функцию печени и почек.

Ориентировочный безопасный уровень воздействия (ОБУВ) розувастатина кальция в воздухе рабочей зоны 0,03 мг/м³.

При соблюдении всех регламентных условий и проведении анализа в точном соответствии с прописью методика обеспечивает выполнение измерений массовых концентраций розувастатина кальция с метрологическими характеристиками, не превышающими значений, представленных в табл. 1 (при доверительной вероятности P = 0,95).

Измерение массовой концентрации розувастатина кальция выполняют методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с ультрафиолетовым спектрофотометрическим (УФ) детектированием. Метод основан на разделении розувастатина кальция и других компонентов анализируемой смеси на хроматографической колонке, заполненной сорбентом, с последующей регистрацией розувастатина кальция с помощью ультрафиолетового детектора. Сигнал детектора прямо пропорционален концентрации розувастатина кальция.

Измерение проводят при длине волны 242 нм.

Отбор проб проводят с концентрированием на фильтры аналитические аэрозольные.

Нижний предел измерения содержания розувастатина кальция в анализируемом объеме раствора пробы - 0,004 мкг.

Нижний предел измерения массовой концентрации розувастатина кальция в воздухе 0,015 мг/м³ (при отборе 66,7 дм³ воздуха).

Метод специфичен в условиях приготовления препаративных форм на основе розувастатина кальция. Измерению не мешают сопутствующие вещества - лактоза моногидрат, целлюлоза микрокристаллическая, кальция гидрофосфат, кросповидон, магния стеарат, гидроксипропилметилцеллюлоза, титана диоксид.

Примечание. Допускается использование средств измерений с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

Примечание. Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией.

Примечание. Допускается применение оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

6.1. При работе с реактивами соблюдают требования безопасности, установленные для работы с токсичными, едкими и легковоспламеняющимися веществами по ГОСТ 12.1.007-76, 12.1.005-88 с изменением 1.

6.2. При проведении анализов горючих и вредных веществ должны соблюдаться требования противопожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91. Должны быть в наличии средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-90. Необходимо провести обучение работающих правилам безопасности труда согласно ГОСТ 12.0.004-90.

6.3. При выполнении измерений с использованием спектрофотометра соблюдают правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-09 и инструкцией по эксплуатации прибора.

6.4. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией. Содержание вредных веществ в воздухе рабочей зоны не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и 2.2.5.2308-07.

К выполнению измерений и обработке их результатов допускается специалист, имеющий высшее образование, опыт работы в химической лаборатории, прошедший обучение и владеющий техникой анализа методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), освоивший метод анализа и уложившийся в нормативы оперативного контроля при проведении процедур контроля погрешности анализа.

8.1. Процессы приготовления растворов и подготовку проб к анализу проводят в следующих условиях:

- температура воздуха (20 +/- 5) °C;

- атмосферное давление (84 - 106) кПа;

- относительная влажность воздуха не более 80%.

8.2. Выполнение измерений на спектрофотометре проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Перед выполнением измерений проводят следующие работы: подготовка посуды, приготовление растворов, подготовка жидкостного хроматографа, установление градуировочной характеристики, отбор проб.

Стеклянную посуду несколько раз промывают водопроводной водой, заливают хромовой смесью и выдерживают 1 ч. После этого посуду извлекают из хромовой смеси, ополаскивают несколько раз водопроводной водой, затем дистиллированной водой и сушат в сушильном шкафу. Чистую посуду хранят в закрытом виде.

9.2.1. Основной стандартный раствор розувастатина кальция с массовой концентрацией 1 000 мкг/см³ готовят растворением (0,0500 +/- 0,0001) г розувастатина кальция в смеси вода-ацетонитрил в объемном соотношении 1:1 в мерной колбе вместимостью 50 см³, перемешивают до растворения.

Раствор используют свежеприготовленный.

9.2.2. Рабочий стандартный раствор розувастатина кальция N 1 с массовой концентрацией 100 мкг/см³ готовят разбавлением 5,0 см³ основного стандартного раствора в смеси вода-ацетонитрил в объемном соотношении 1:1 в мерной колбе вместимостью 50 см³, перемешивают до растворения.

Раствор используют свежеприготовленный.

9.2.3. Рабочий стандартный раствор розувастатина кальция N 2 с массовой концентрацией 10 мкг/см³ готовят разбавлением 5 см³ рабочего стандартного раствора розувастатина кальция N 1 в смеси вода-ацетонитрил в объемном соотношении 1:1 в мерной колбе вместимостью 50 см³, перемешивают до растворения.

Раствор используют свежеприготовленный.

Примечание. Используют колбы темного стекла или алюминиевую фольгу для защиты от воздействия света.

9.2.4. Приготовление смеси вода-ацетонитрил в объемном соотношении 1:1.

В конической колбе вместимостью 500 см³ смешивают 250 см³ воды особо чистой и 250 см³ ацетонитрила. Смесь хранят в герметичной стеклянной посуде в холодильнике в течение месяца.

9.2.5. Приготовление элюента.

В конической колбе вместимостью 500 см³ смешивают 300 см³ воды особо чистой, 200 см³ ацетонитрила и 0,5 см³ фосфорной кислоты. Элюент хранят в герметичной стеклянной посуде в холодильнике в течение месяца.

9.3.1. Подготовку жидкостного хроматографа проводят в соответствии с руководством по его эксплуатации.

9.3.2. Проверка пригодности хроматографической системы.

Хроматографическая система считается пригодной, если на хроматограмме раствора для проверки пригодности хроматографической системы выполняются следующие условия:

- фактор асимметрии пика розувастатина кальция - не более 1,2;

- относительное стандартное отклонение площади пика розувастатина кальция, рассчитанное для пяти последовательных хроматограмм, - не более 2,0%;

- время удерживания пика розувастатина кальция - (6,5 +/- 0,5) мин;

- эффективность хроматографической колонки должна быть не менее 2 000 теоретических тарелок.

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади пиков (приборные единицы) от содержания розувастатина кальция в хроматографируемом объеме градуировочных растворов, устанавливают по методу абсолютной калибровки по шести сериям измерений по шести концентрациям вещества в каждой серии растворов согласно табл. 2 следующим образом: на фильтры, помещенные в химические бюксы, наносят рабочий стандартный раствор розувастатина кальция N 1 с массовой концентрацией 100 мкг/см³ и рабочий стандартный раствор розувастатина кальция N 2 с массовой концентрацией 10 мкг/см³ в соответствии с табл. 2. После чего фильтры подсушивают при комнатной температуре, затем заливают 5,0 см³ смеси вода-ацетонитрил в объемном соотношении 1:1 и оставляют на 10 мин, периодически помешивая стеклянной палочкой для лучшего растворения вещества. Затем фильтр отжимают, раствор сливают в мерную колбу вместимостью 10 см³, затем фильтр снова заливают 5,0 см³ смеси вода-ацетонитрил в объемном соотношении 1:1 и оставляют на 10 мин, периодически помешивая стеклянной палочкой для лучшего растворения вещества. После этого фильтр тщательно отжимают, раствор сливают в ту же мерную колбу вместимостью 10 см³ и доводят объем до метки смесью вода-ацетонитрил в объемном соотношении 1:1. Далее растворы фильтруют через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм в хроматографические виалки, отбрасывая первые порции фильтрата.

Градуировочные растворы используют свежеприготовленные.

Инжектируют в хроматограф по 0,04 см³ каждого из градуировочных растворов.

По полученным данным строят градуировочную характеристику зависимости площади пика (приборные единицы) от содержания розувастатина кальция в хроматографируемом объеме (мкг).

Относительное стандартное отклонение площади пика розувастатина кальция, рассчитанное для пяти последовательных хроматограмм, - не более 2,0%.

Допускается изменять профиль градиента для достижения соответствия критериям пригодности хроматографической системы.

Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят не реже 1 раза в квартал, а также при смене реактивов и изменении условий анализа (после ремонта и поверки прибора). Один раз в год градуировочную характеристику устанавливают заново.

Для контроля стабильности готовят три градуировочных раствора по п. 9.4 (в начале, середине и конце диапазона измерений) и анализируют в точном соответствии с прописью методики.

Градуировочную характеристику считают стабильной, если для каждого контрольного образца выполняется условие:

где D_изм, D_гр - значение оптической плотности образца розувастатина кальция для контроля, измеренное и найденное по градуировочной характеристике;

К_гр - норматив контроля, , где

- границы относительной погрешности, % (табл. 1).

Если условие стабильности не выполняется только для одного образца, то выполняют повторное измерение этого образца с целью исключения результата, содержащего грубую ошибку.

Если градуировочная характеристика нестабильна, выясняют причины нестабильности и повторяют контроль стабильности с использованием других образцов для установления градуировочной характеристики, предусмотренных методикой. При повторном обнаружении нестабильности градуировочной характеристики ее устанавливают заново.

Отбор проб следует проводить с учетом требований ГОСТ 12.1.005-88 "ССБТ. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны" (с изменением 1) и Р 2.2.2006-05 (прилож. 9, обязательное) "Общие методические требования к организации и проведению контроля содержания вредных веществ в воздухе рабочей зоны", раздел 2 "Контроль соответствия максимальным ПДК".

Одновременно отбирают две параллельные пробы.

Воздух с объемным расходом 4,5 дм³/мин аспирируют в течение 15 мин через фильтр, помещенный в фильтродержатель, и последовательно соединенный поглотительный сосуд Рихтера, содержащий 5 см³ смеси вода-ацетонитрил в объемном соотношении 1:1, при охлаждении смесью воды со льдом. Для определения розувастатина кальция на уровне 0,015 мг/м³ отбирают 66,7 дм³ воздуха.

Отобранные пробы хранению не подлежат.

Фильтр с отобранной пробой помещают в бюкс и экстрагируют 5,0 см³ смеси вода-ацетонитрил в объемном соотношении 1:1 из поглотительного сосуда Рихтера, помешивая при этом стеклянной палочкой в течение 10 мин, затем фильтр тщательно отжимают, раствор сливают в мерную колбу вместимостью 10 см³, а фильтр повторно экстрагируют 5,0 см³ смеси вода-ацетонитрил в объемном соотношении 1:1, снова тщательно отжимают и удаляют. Растворы сливают вместе в мерную колбу вместимостью 10 см³ и объем доводят до метки смесью вода-ацетонитрил в объемном соотношении 1:1. Далее растворы фильтруют через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм в хроматографические виалки, отбрасывая первые порции фильтрата. Хроматографический анализ выполняют в тех же условиях, что и хроматографирование градуировочных растворов.

Регистрируют не менее двух хроматограмм для каждой пробы, соблюдая все условия, требуемые для градуировки хроматографической системы.

Количественное определение содержания розувастатина кальция (в мкг) в анализируемом объеме раствора пробы проводят по предварительно построенной градуировочной характеристике.

Примечание. Фильтрование растворов анализируемых проб проводится для удаления нерастворимых в смеси вода-ацетонитрил в объемном соотношении 1:1 вспомогательных веществ, входящих в состав препаративных форм розувастатина кальция.

Массовую концентрацию розувастатина кальция в воздухе рабочей зоны C, мг/м³, вычисляют по формуле:

где a - содержание вещества в анализируемом объеме раствора пробы, найденное по градуировочной характеристике, мкг;

B - общий объем раствора пробы, см³;

- хроматографируемый объем раствора пробы, см³;

V₂₀ - объем воздуха, отобранный для анализа (дм³) и приведенный к стандартным условиям (прилож. 1).

За результат измерений принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, если выполняется условие приемлемости:

где C₁, C₂ - результаты параллельных определений массовой концентрации розувастатина кальция в воздухе, мг/м³;

r - значение предела повторяемости, % (табл. 1).

Если условие не выполняется, выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и повторяют выполнение измерений в соответствии с требованиями МВИ.

Результат количественного химического анализа представляют в виде:

где - среднее арифметическое значение результатов n определений, признанных приемлемыми, мг/м³;

- границы относительной погрешности измерений, % (табл. 1).

Если полученный результат измерений ниже нижней (выше верхней) границы диапазона измерений, то производят следующую запись в журнале: "массовая концентрация розувастатина кальция менее 0,015 мг/м³ (более 0,15 мг/м³)".

Проверку приемлемости результатов измерений в условиях воспроизводимости проводят:

а) при возникновении спорных ситуаций между двумя лабораториями;

б) при проверке совместимости результатов измерений, полученных при сличительных испытаниях (при проведении аккредитации лабораторий и инспекционного контроля).

Для проведения проверки приемлемости результатов измерений в условиях воспроизводимости каждая лаборатория использует пробы, оставленные на хранение.

Приемлемость результатов измерений, полученных в двух лабораториях, оценивают сравнением разности этих результатов с критической разностью CD_0,95 по формуле:

где C_ср1, C_ср2 - средние значения массовой концентрации розувастатина кальция, полученные в первой и второй лабораториях, мг/м³;

CD_0,95 - значение критической разности, % (табл. 1).

Если критическая разность не превышена, то приемлемы оба результата измерений, проводимых двумя лабораториями, и в качестве окончательного результата используют их среднеарифметическое значение. Если критическая разность превышена, то выполняют процедуры, изложенные в ГОСТ Р ИСО 5725-6-02 (п. 5.3.3).

При разногласиях руководствуются ГОСТ Р ИСО 5725-6-02 (п. 5.3.4).

Контроль качества результатов измерений в лаборатории при реализации методики осуществляют по ГОСТ Р ИСО 5725-6-02, используя контроль стабильности среднеквадратического (стандартного) отклонения повторяемости по п. 6.2.2 ГОСТ Р ИСО 5725-6-02 и показателя правильности по п. 6.2.4 ГОСТ Р ИСО 5725-6-02.

Рекомендуется устанавливать контролируемый период так, чтобы количество результатов контрольных измерений было от 20 до 30.

При неудовлетворительных результатах контроля, например, при превышении предела действия или регулярном превышении предела предупреждения, выясняют причины этих отклонений, в том числе проводят смену реактивов, проверяют работу оператора.