"МУК 4.1.3456-17. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств дифеноконазола в огурцах методом капиллярной газожидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 16.03.2017)

1. Разработаны ФБУН "Федеральный научный центр гигиены" им. Ф.Ф. Эрисмана Роспотребнадзора (В.Н. Ракитский, Н.Е. Федорова, О.Е. Егорченкова).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 22 декабря 2016 г. N 2).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 16 марта 2017 г.

4. Введены впервые.

Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода капиллярной газожидкостной хроматографии для измерения концентраций дифеноконазола в огурцах в диапазоне 0,01 - 0,1 мг/кг.

Методические указания носят рекомендательный характер.

Химический класс: триазолы.

Цис,транс-3-хлор-4-[4-метил-2-(1H-1,2,4-триазол-1-ил-метил)-1,3-диоксолан-2-ил-]фенил 4-хлорфениловый эфир (IUPAC).

C₁₉H₁₇Cl₂N₃O₃

Молекулярная масса: 406,3.

Кристаллическое вещество белого или бледно-бежевого цвета. Температура плавления: 78,6 °C. Давление паров при 25 °C: 3,3 x 10^-5 МПа. Коэффициент распределения н-октанол/вода: K_OWlog P = 4,2. Растворимость в органических растворителях при 25 °C (г/дм³): ацетон - 610; этанол - 330; толуол - 490; н-октанол - 95; н-гексан - 3,4. Растворимость в воде при 25 °C (г/дм³): 0,015.

Дифеноконазол стабилен на воздухе при температуре до 150 °C, а также в водных растворах.

Краткая токсикологическая характеристика. Острая пероральная токсичность (LD₅₀) для крыс - 1 453 мг/кг, для мышей > 2 000 мг/кг; острая дермальная токсичность (LD₅₀) для кроликов > 2 010 мг/кг; острая ингаляционная токсичность (LK₅₀) для крыс > 3 300 мг/м³.

Область применения. Дифеноконазол - системный фунгицид с длительным профилактическим и выраженным лечебным действием против широкого спектра грибных патогенов на яблоне, овощных культурах открытого и защищенного грунта, ряде других культур.

При соблюдении всех регламентируемых условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерения при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций.

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для всего диапазона измерений (n = 20) приведены в табл. 2.

Метод основан на определении дифеноконазола с использованием капиллярной газожидкостной хроматографии (ГЖХ) с масс-селективным (МСД) детектором после извлечения вещества из анализируемых образцов ацетонитрилом с использованием смеси солей для экстракции (смесь сульфата магния и хлорида натрия). Очистку экстрактов проводят методом дисперсионной твердофазной экстракции с применением смеси сорбентов на основе амина, октадецилсилана и графитизированной сажи.

Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки.

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Примечание. Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией, не требующей дополнительной очистки растворителей.

Примечание. Допускается использование вспомогательных устройств и материалов с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ Р 12.1.019-09, а также требования, изложенные в технической документации на газовый хроматограф.

4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и ГН 2.2.5.2308-07. Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004-90.

4.3. При работе с газами, находящимися в баллонах под давлением до 15 МПа (150 кгс/см²), необходимо соблюдать Федеральные нормы и правила в области промышленной безопасности "Правила промышленной безопасности опасных производственных объектов, на которых используется оборудование, работающее под избыточным давлением" (утв. Приказом Ростехнадзора от 25.03.2014 N 116). Запрещается открывать вентиль баллона, не установив на нем понижающий редуктор.

Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист, имеющий опыт работы на газовом хроматографе, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений.

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C и относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на газовом хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Измерениям предшествуют следующие операции: очистка органических растворителей (при необходимости), приготовление растворов, градуировочных растворов, растворов внесения, установление градуировочной характеристики, отбор проб.

Ацетон перегоняют над небольшим количеством перманганата калия и прокаленным карбонатом калия или подвергают ректификационной перегонке на колонне с числом теоретических тарелок не менее 30.

Ацетонитрил кипятят с обратным холодильником над пентоксидом фосфора (на 1 дм³ ацетонитрила 20 г пентоксида фосфора) не менее 1 часа, после чего перегоняют, непосредственно перед употреблением ацетонитрил повторно перегоняют над прокаленным карбонатом калия (на 1 дм³ ацетонитрила 10 г карбоната калия).

7.2.1. Исходный раствор дифеноконазола для градуировки (концентрация 100 мкг/см³). В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают (0,01 +/- 0,0001) г дифеноконазола, растворяют в 50 - 60 см³ ацетона, доводят ацетоном до метки, тщательно перемешивают.

Раствор хранят в холодильнике при температуре 4 - 6 °C в течение 3 месяцев.

7.2.2. Рабочий раствор N 1 дифеноконазола для градуировки и внесения (концентрация 1,0 мкг/см³). В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 1,0 см³ исходного градуировочного раствора с концентрацией 100,0 мкг/см³ (п. 7.2.1), доводят до метки ацетоном, тщательно перемешивают, получают рабочий раствор N 1 с концентрацией дифеноконазола 1,0 мкг/см³.

Раствор хранят в холодильнике при температуре 4 - 6 °C в течение месяца.

Этот раствор используют для приготовления проб с внесением при оценке полноты извлечения действующего вещества методом "внесено-найдено" и контроля качества результатов измерений методом добавок.

7.2.3. Рабочие растворы N 2 - 6 дифеноконазола для градуировки (концентрация 0,01 - 0,1 мкг/см³). В 5 мерных колб вместимостью 100 см³ помещают 1,0; 2,0; 5,0; 8,0 и 10,0 см³ рабочего раствора N 1 с концентрацией 1,0 мкг/см³ (п. 7.2.2), доводят до метки ацетоном, тщательно перемешивают, получают рабочие растворы N 2 - 6 с концентрациями дифеноконазола 0,01; 0,02; 0,05; 0,08 и 0,1 мкг/см³.

Растворы хранят в холодильнике при температуре 4 - 6 °C в течение 7 дней.

Для приготовления одного набора смеси солей для экстракции смешивают (4 +/- 0,01) г магния сернокислого и (1 +/- 0,01) г натрия хлористого, до использования хранят в герметичной упаковке (не более 6 месяцев).

Примечание. Возможно использование других наборов солей для экстракции проб овощей массой 10 г.

Для приготовления одного набора смеси сорбентов для очистки экстрактов в центрифужную полипропиленовую пробирку вместимостью 2 см³ помещают (50 +/- 4) мг сорбента для твердофазной экстракции на основе первичного-вторичного амина, (50 +/- 4) мг графитизированной сажи, (150 +/- 4) мг магния сернокислого и (50 +/- 4) мг твердофазного сорбента на основе октадецилсилана, закрывают герметично крышкой, встряхивают для перемешивания, хранят не более 6 месяцев.

Примечание. Возможно использование дисперсионных наборов для фруктов и овощей с маслом и пигментами, помещенных в полипропиленовые пробирки вместимостью 2 см³.

Градуировочную характеристику, выражающую линейную (с угловым коэффициентом) зависимость площади пика от концентрации дифеноконазола в растворе, устанавливают методом абсолютной калибровки по 5 растворам для градуировки.

В испаритель хроматографа вводят по 1 мм³ каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.3. Осуществляют не менее 5 параллельных измерений. Устанавливают площади пика дифеноконазола, на основании которых строят градуировочную зависимость.

Отбор проб осуществлен в соответствии с ГОСТ Р 54752-11 "Огурцы свежие, реализуемые в розничной торговле. Технические условия" и "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (N 2051-79 от 21.08.79).

Пробы огурцов хранят в полиэтиленовой таре в холодильнике не более 5 дней, для длительного хранения образцы замораживают и хранят при температуре ниже -18 °C.

Образец огурцов массой 10 г помещают в центрифужную полипропиленовую пробирку вместимостью 50 см³, вносят 10 см³ ацетонитрила, помещают в пробирку керамический гомогенизатор, закрывают крышку и интенсивно встряхивают вручную 30 с. В пробирку вносят смесь солей для экстракции (приготовленную по п. 7.3), закрывают крышкой и интенсивно встряхивают (вручную) в течение 1 мин. Затем пробу центрифугируют в течение 5 мин при скорости вращения 3 500 об./мин и подвергают очистке с применением дисперсионной твердофазной экстракции по п. 9.2.

Надосадочную жидкость (верхний слой в пробирке после центрифугирования) объемом 1,5 - 1,8 см³ с помощью пипетки переносят в пропиленовую центрифужную пробирку, содержащую смесь сорбентов, приготовленную по п. 7.4. Закрывают крышку и интенсивно встряхивают вручную в течение 30 с. Центрифугируют 5 мин при скорости вращения 3 500 об./мин, отбирают с помощью медицинского шприца раствор, фильтруют через мембранный фильтр (размер пор 0,22 мкм), помещают в автосамплер хроматографа и анализируют при условиях хроматографирования, указанных в п. 9.3.

Пробу вводят в испаритель хроматографов не менее двух раз. Устанавливают площади пиков дифеноконазола, с помощью градуировочных графиков определяют концентрацию вещества в хроматографируемом растворе.

Газовый хроматограф, снабженный масс-селективным детектором, автоматическим пробоотборником, предназначенный для работы с капиллярной колонкой.

Хроматографическая капиллярная кварцевая колонка длиной 15 м, внутренним диаметром 0,25 мм, содержащая сорбент: 5% - фенил-, 95% - диметилполисилоксан (толщина пленки сорбента 0,25 мкм).

Температура детектора: квадруполя - 150 °C, источника - 230 °C, переходной камеры - 280 °C.

Температура испарителя: 275 °C.

Температура термостата колонки программированная. Начальная температура - 160 °C, выдержка 2 мин, нагрев колонки со скоростью 20 градусов в минуту до температуры 270 °C, выдержка 11 мин.

Газ 1 (гелий): поток в колонке 0,9 см³/мин.

Давление: 4,479 psi.

Средняя линейная скорость: 51,24 см/с.

Хроматографируемый объем: 1 мм³.

Режим регистрации индивидуальных ионов:

- отношение масса-заряд: 265 (количественный), 202, 323.

Линейный диапазон детектирования: 0,01 - 0,1 нг.

Образцы, дающие пики большие, чем градуировочный раствор дифеноконазола с концентрацией 0,1 мкг/см³, разбавляют ацетоном (не более чем в 50 раз).

Содержание дифеноконазола в пробе (X, мг/кг) рассчитывают по формуле:

X - содержание дифеноконазола в пробе, мг/кг;

A - концентрация вещества, найденная по градуировочной характеристике в соответствии с величиной суммы площадей хроматографических пиков, мкг/см³;

V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, см³;

m - масса анализируемого образца, г.

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости:

X₁, X₂ - результаты параллельных определений, мг/кг;

r - значение предела повторяемости (табл. 1), при этом .

При невыполнении условия выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

Результат анализа представляют в виде: () мг/кг при вероятности P = 0,95, где

- среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

- граница абсолютной погрешности, мг/кг:

- граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

Если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание дифеноконазола в пробе огурцов - менее 0,01 мг/кг" <*>.

--------------------------------

<*> 0,01 мг/кг - предел обнаружения в пробе огурцов.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-02 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

13.1. Контроль стабильности градуировочной характеристики.

Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят в начале и по окончании каждой серии анализов.

При контроле стабильности градуировочной характеристики проводят измерения не менее двух образцов концентраций для градуировки, содержание дифеноконазола в которых должно охватывать весь диапазон концентраций от 0,01 до 0,1 мкг/см³.

Градуировочная характеристика считается стабильной, если для каждого из используемого для контроля градуировочного раствора сохраняется соотношение:

X - концентрация дифеноконазола в пробе при контрольном измерении, мкг/см³;

C - известная концентрация градуировочного раствора дифеноконазола, взятая для контроля стабильности градуировочной характеристики, мкг/см³;

B - норматив контроля погрешности градуировочной характеристики, % (B = 10% при P = 0,95).

Если величина расхождения (A) превышает 10%, делают вывод о невозможности применения градуировочной характеристики для дальнейших измерений. В этом случае выясняют и устраняют причины нестабильности градуировочной характеристики и повторяют контроль ее стабильности с использованием других градуировочных растворов дифеноконазола, предусмотренных МИ. При повторном обнаружении нестабильности градуировочной характеристики устанавливают ее заново согласно п. 7.5.

Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом добавок.

Величина добавки C_д должна удовлетворять условию:

- характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой соответственно), мг/кг, при этом:

- граница абсолютной погрешности, мг/кг:

- граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

Результат контроля процедуры К_к рассчитывают по формуле:

, , C_д - среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки соответственно, мг/кг.

Норматив контроля К рассчитывают по формуле:

Проводят сопоставление результата контроля процедуры (К_к) с нормативом контроля (К).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию:

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (1) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (1) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), не должно превышать предела воспроизводимости (R):

X₁, X₂ - результаты измерений, выполненных в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), мг/кг;

R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.