"МУК 4.1.3419-17. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств ципросульфамида в зерне нута методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 14.02.2017)

1. Разработаны Российским государственным аграрным университетом - МСХА им. К.А. Тимирязева, Учебно-научный консультационный центр "Агроэкология пестицидов и агрохимикатов" Минсельхоза России (А.В. Довгилевич, Е.В. Довгилевич, Е.Н. Тестова, Ю.Н. Савушкин).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 22 декабря 2016 г. N 2).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 14 февраля 2017 г.

4. Введены впервые.

Свидетельство о метрологической аттестации МВИ N РОСС RU.0001.310430/0255.12.02.2016 от 12.02.2016.

Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения уровня остаточных количеств ципросульфамида в зерне нута в диапазоне 0,01 - 0,1 мг/кг.

Методические указания носят рекомендательный характер.

Ципросульфамид

Название действующего вещества по ИЮПАК: N-{[(4-циклопропилкарбамоил)фенил]сульфо-нил}-2-метоксибензамид.

Структурная формула:

Эмпирическая формула: C₁₈H₁₈N₂O₅S.

Молекулярная масса: 374.

Агрегатное состояние: порошок.

Цвет, запах: белый с легким характерным запахом.

Давление паров: 5,72 x 10^-9 Па (при 20 °C); 1,10 x 10^-8 Па (при 25 °C); 2,19 x 10^-7 Па (при 50 °C).

Коэффициент распределения октанол-вода: logP K_ow = 1,77 (pH 4), logP K_ow = -0,80 (pH 7), logP K_ow = -1,81 (pH 9).

Температура плавления: выше 450 °C.

Растворимость в воде (мг/дм³, при 20 °C): при pH 4 - 0,0034; pH 5,1 - 0,0125; pH 6,9 - 1,09; pH 8,1 - 26,1.

Растворимость в органических растворителях (г/дм³, при 20 °C): ацетон - 3,1; н-гексан < 0,001; диметилсульфоксид > 200; дихлорметан - 3,5; толуол - 0,0047; этанол - 0,47; этилацетат - 0,51.

Стабилен в водных растворах при pH 3 - 10 и температуре 22 °C до 20 месяцев.

Краткая токсикологическая характеристика. Ципросульфамид относится к мало опасным по острой оральной (ЛД₅₀ для крыс более 2 000 мг/кг) и дермальной токсичности (ЛД₅₀ для крыс более 2 000 мг/кг), но к умеренно опасным веществам по ингаляционной токсичности (ЛК₅₀ для крыс (4 ч) более 3 513 мг/м³).

Область применения. Ципросульфамид - антидот, обеспечивающий достаточно высокий уровень толерантности культуры к гербицидному препарату.

В России установлены следующие гигиенические нормативы: ДСД - 0,08 мг/кг массы тела человека; ОДК в почве - 0,24 мг/кг; ПДК в воде водоемов - 0,07 мг/дм³; ОБУВ в воздухе рабочей зоны - 0,8 мг/м³; ОБУВ в атмосферном воздухе - 0,01 мг/м³; МДУ в продукции (мг/кг): кукуруза (зерно, масло) - 0,1.

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций.

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительные интервалы среднего результата для полного диапазона концентраций (n = 20) приведены в табл. 2.

Метод основан на определении ципросульфамида с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием диодно-матричного детектора после его экстракции из образцов органическим растворителем, очистки экстракта перераспределением между двумя несмешивающимися фазами и на колонках с окисью алюминия.

Идентификация веществ проводится по времени удерживания, а количественное определение - методом абсолютной калибровки.

В предлагаемых условиях анализа метод специфичен. Специфичность обеспечивается подбором состава подвижной фазы и выбором колонок различной полярности.

Примечание. Допускается использование средств измерений с аналогичными или лучшими характеристиками.

Примечание. Допускается использование реактивов с аналогичными или лучшими характеристиками.

Примечание. Допускается применение оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ Р 12.1.019-09, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф.

4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 "Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны". Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004-91.

Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист, имеющий опыт работы на жидкостном хроматографе, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений.

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C, относительной влажности не более 80% и нормальном атмосферном давлении;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Выполнению измерений предшествуют следующие операции: очистка растворителей (при необходимости), приготовление растворов, кондиционирование хроматографической колонки, подготовка колонок с окисью алюминия для очистки экстракта, проверка хроматографического поведения вещества на колонках с окисью алюминия и установление градуировочной характеристики.

Ацетонитрил, содержащий воду, предварительно осушают, добавляя в него гранулированный безводный хлористый кальций из расчета не менее 100 г/дм³. Выдерживают его над осушителем в течение 5 - 6 часов. Затем ацетонитрил сливают с осушителя в круглодонную колбу со шлифом объемом 4 000 см³ аппарата для перегонки растворителей.

Ацетонитрил перегоняют при температуре 81,5 °C, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше 81,5 °C, отбрасывают.

Дистиллированную воду помещают в круглодонную колбу со шлифом объемом 4 000 см³ от аппарата для перегонки растворителей, добавляют к ней марганцовокислый калий из расчета 1 г/дм³ и кипятят в течение 6 часов.

Собирают фракции, отогнанные при температуре 100,0 °C, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше 100,0 °C, отбрасывают.

Хлористый метилен промывают равным объемом 5%-го раствора натрия углекислого (безводного), осушают, добавляя в него гранулированный безводный хлористый кальций из расчета не менее 100 г/дм³. Выдерживают его над осушителем в течение 12 - 24 часов. Затем хлористый метилен сливают с осушителя в круглодонную колбу со шлифом объемом 4 000 см³ аппарата для перегонки растворителей. Хлористый метилен перегоняют при температуре 40,0 °C, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше 40,0 °C, отбрасывают.

Гексан, содержащий воду, предварительно осушают, добавляя в него гранулированный безводный хлористый кальций из расчета не менее 100 г/дм³. Выдерживают его над осушителем в течение 5 - 6 часов. Затем гексан сливают с осушителя в круглодонную колбу со шлифом объемом 4 000 см³ аппарата для перегонки растворителей.

Гексан перегоняют при температуре 68,7 °C, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше 68,7 °C, отбрасывают.

7.2.1.1. Приготовление 0,1%-го водного раствора муравьиной кислоты. В мерную колбу объемом 1 дм³ помещают 500 см³ бидистиллированной воды, прибавляют 1,0 см³ муравьиной кислоты, перемешивают, объем доводят до метки бидистиллированной водой.

7.2.1.2. Приготовление 6 М раствора соляной кислоты. Мерным цилиндром отбирают 246 см³ концентрированной соляной кислоты и осторожно переносят в мерную колбу на 500 см³, куда предварительно наливают около 100 см³ дистиллированной воды. Затем раствор перемешивают и после охлаждения доводят водой объем в колбе до метки (при приготовлении раствора соблюдать осторожность и работать под тягой).

7.2.1.3. Приготовление 1 М раствора гидроокиси натрия. В мерную колбу на 500 см³ переносят 20 г гидроокиси натрия, добавляют 200 - 300 см³ дистиллированной воды. Затем раствор перемешивают и после охлаждения доводят водой объем в колбе до метки (при приготовлении раствора соблюдать осторожность и работать под тягой).

7.2.1.4. Приготовление 0,05 М раствора двузамещенного фосфорнокислого калия. В мерную колбу на 500 см³ переносят 5,7 г K₂HPO₄ x 3H₂O и 50 г NaCl, добавляют 200 - 300 см³ бидистиллированной воды, перемешивают до полного растворения солей, проверяют pH полученного раствора. Если pH раствора менее 9, доводят его до указанного значения с помощью 1 М раствора гидроокиси натрия, контролируя pH. После достижения нужного значения pH объем доводят водой до метки.

7.2.2.1. Стандартный раствор N 1 с концентрацией ципросульфамида 100,0 мкг/см³. Взвешивают 10 мг ципросульфамида в мерной колбе объемом 100 см³. Навеску растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки ацетонитрилом. Полученный стандартный раствор N 1 используется для приготовления стандартных растворов для хроматографического исследования и установления градуировочной характеристики. Стандартный раствор N 1 хранят в холодильнике в течение 6 месяцев.

7.2.2.2. Стандартный раствор N 2 с концентрацией ципросульфамида 10,0 мкг/см³. Из стандартного раствора N 1 отбирают пипеткой 1 см³, помещают в мерную колбу объемом 10 см³ и доводят объем до метки ацетонитрилом. Стандартный раствор N 2 используется для приготовления стандартных растворов для установления градуировочной характеристики. Стандартный раствор N 2 хранят в холодильнике не более 3 месяцев.

7.2.2.3. Стандартный раствор N 3 с концентрацией ципросульфамида 1,0 мкг/см³. Из стандартного раствора N 2 отбирают пипеткой 1 см³, помещают в мерную колбу объемом 10 см³ и доводят объем до метки смесью ацетонитрила с водой в соотношении 1:1. Стандартный раствор N 3 используется для приготовления стандартных растворов для установления градуировочной характеристики. Стандартный раствор N 3 хранят в холодильнике не более 1 месяца.

7.2.2.4. Стандартный раствор N 4 с концентрацией ципросульфамида 0,5 мкг/см³. Из стандартного раствора N 3 отбирают пипеткой 5 см³, помещают в мерную колбу объемом 10 см³ и доводят объем до метки смесью ацетонитрила с водой в соотношении 1:1. Стандартный раствор N 4 используется для приготовления стандартных растворов для установления градуировочной характеристики. Стандартный раствор N 4 хранят в холодильнике не более 1 месяца.

7.2.2.5. Стандартный раствор N 5 с концентрацией ципросульфамида 0,2 мкг/см³. Из стандартного раствора N 3 отбирают пипеткой 2 см³, помещают в мерную колбу объемом 10 см³ и доводят объем до метки смесью ацетонитрила с водой в соотношении 1:1. Стандартный раствор N 5 используется для приготовления стандартных растворов для установления градуировочной характеристики. Стандартный раствор N 5 хранят в холодильнике не более 1 месяца.

7.2.2.6. Стандартный раствор N 6 с концентрацией ципросульфамида 0,1 мкг/см³. Из стандартного раствора N 3 отбирают пипеткой 1 см³, помещают в мерную колбу объемом 10 см³ и доводят объем до метки смесью ацетонитрила с водой в соотношении 1:1. Стандартный раствор N 6 используется для приготовления стандартных растворов для установления градуировочной характеристики. Стандартный раствор N 6 хранят в холодильнике не более 1 месяца.

7.2.2.7. Стандартные растворы ципросульфамида с концентрациями 2,0; 1,0; 0,5 и 0,2 мкг/см³ для внесения в контрольные образцы. Из стандартного раствора N 2 методом последовательного разведения ацетонитрилом готовят растворы, содержащие по 2,0; 1,0; 0,5 и 0,2 мкг/см³ и используют эти растворы для внесения в контрольные образцы. Стандартные растворы для внесения хранят в холодильнике не более месяца.

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади (высоты) пика от концентрации ципросульфамида в растворе (мкг/см³), устанавливают методом абсолютной калибровки по 4 растворам для градуировки с концентрациями 1,0; 0,5; 0,2 и 0,1 мкг/см³.

В инжектор хроматографа вводят по 20 мм³ каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.2. Осуществляют не менее 5 параллельных измерений.

В пластиковую или стеклянную колонку диаметром 15 мм помещают 1 г окиси алюминия с зернением 40/250 меш и, аккуратно постукивая по стенкам колонки, формируют слой адсорбента. Непосредственно перед использованием колонку промывают 10 см³ ацетонитрила.

В концентратор объемом 100 см³ вносят 1 см³ стандартного раствора ципросульфамида в ацетонитриле с концентрацией 1,0 мкг/см³ и упаривают его досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °C. Сухой остаток растворяют в 10 см³ ацетонитрила, тщательно обмывают стенки концентратора и наносят на подготовленную колонку. Элюат собирают в концентратор объемом 100 см³ и упаривают досуха при температуре не выше 30 °C, растворяют в 2 см³ смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 и хроматографируют.

Исходную колбу обмывают четырьмя порциями смеси ацетонитрила с ледяной уксусной кислотой в соотношении 99:1 объемом 10 см³ каждая и последовательно вносят их на колонку. Каждую порцию собирают отдельно в концентратор объемом 100 см³ и упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °C.

Сухой остаток каждой фракции растворяют в 2 см³ смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 и 20 мм³ пробы вводят в хроматограф.

Определяют фракции, содержащие ципросульфамид, полноту смывания с колонки и необходимый объем элюента.

Изучение поведения ципросульфамида на колонке проводят каждый раз при отработке методики или поступлении новой партии окиси алюминия.

Хроматографическую колонку с предколонкой устанавливают в термостате хроматографа и стабилизируют при температуре 30 °C и скорости потока подвижной фазы 0,7 см³/мин 3 - 4 часа.

Отбор проб проводится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов", N 2051-79 от 21.08.79, а также в соответствии с ГОСТ 8758-76 "Нут. Требования при заготовках и поставках".

Отобранные пробы зерна нута подсушивают до стандартной влажности и хранят в бумажных или тканевых мешочках в сухом, хорошо проветриваемом шкафу, недоступном для грызунов.

Образец измельченного зерна нута массой 20 г помещают в полипропиленовую банку для экстракции объемом 250 см³, прибавляют 50 см³ ацетонитрила и помещают на 5 минут в ультразвуковую ванну. Ацетонитрильный экстракт фильтруют через фильтр низкой плотности в делительную воронку объемом 250 см³. Экстракцию повторяют еще два раза, используя по 50 см³ ацетонитрила и помещая на 5 минут в ультразвуковую ванну. Экстракты фильтруют и объединяют в делительной воронке объемом 250 см³.

Ацетонитрильный экстракт в делительной воронке промывают двумя порциями гексана объемом по 50 см³, каждый раз интенсивно встряхивая воронку по 2 мин. После полного разделения фаз верхний гексановый слой отбрасывают. Ацетонитрильный экстракт переносят в концентратор объемом 250 см³ через слой безводного сульфата натрия и упаривают досуха при температуре не выше 30 °C.

К сухому остатку в концентраторе, полученному по п. 9.1.1, прибавляют 5 см³ ацетонитрила, 50 см³ щелочного буфера pH 9, перемешивают и переносят в делительную воронку объемом 250 см³. Полученную смесь промывают двумя порциями по 30 см³ хлористого метилена, каждый раз интенсивно встряхивая делительную воронку 2 мин. После полного разделения фаз нижний слой (хлористый метилен) отбрасывают. Водную фракцию в делительной воронке подкисляют 6 М соляной кислотой до pH 2.

Ципросульфамид экстрагируют тремя порциями хлористого метилена объемом по 20 см³, каждый раз интенсивно встряхивая воронку 2 мин. После полного разделения фаз в делительной воронке нижний слой (хлористый метилен) объединяют в концентраторе объемом 250 см³, пропуская его через слой безводного сульфата натрия, и упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °C.

Сухой остаток в концентраторе, полученный по п. 9.1.2, растворяют в 10 см³ ацетонитрила, тщательно обмывают стенки концентратора, наносят на заранее подготовленную колонку, элюат отбрасывают. Исходную колбу обмывают 30 см³ смеси ацетонитрила с ледяной уксусной кислотой в соотношении 99:1 и вносят на колонку. Элюат собирают в концентратор объемом 100 см³, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °C.

Сухой остаток растворяют в 2 см³ смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 и 20 мм³ пробы вводят в хроматограф.

Хроматографическая система, включающая:

- хроматограф жидкостный с диодно-матричным детектором, снабженный термостатом для колонок с диапазоном температур от 15 до 80 °C и с возможностью использования стандартного автосамплера с дозирующим объемом от 0,1 до 100 мм³ для автоматического ввода пробы в хроматографическую систему;

- компьютерное программное обеспечение, контролирующее работу всего прибора, обеспечивающее сбор и хранение всех хроматограмм в процессе проведения хроматографического анализа, обеспечивающее обработку результатов измерений, вывод и расчет хроматограмм и количественный анализ.

Колонка хроматографическая стальная длиной 150 мм, с внутренним диаметром 4,6 мм, зернением 5 мкм, заполненная сорбентом с привитыми полярными группами C18.

Предколонка хроматографическая стальная длиной 12,5 мм, с внутренним диаметром 2,1 мм, зернением 5 мкм, заполненная сорбентом с привитыми полярными группами C18.

Температура колонки: 30 °C.

Подвижная фаза: ацетонитрил - 0,1%-я муравьиная кислота в соотношении 60:40.

Скорость потока подвижной фазы 0,7 см³/мин.

Длина волны: 250 нм.

Чувствительность не менее 8 mAU (миллиединиц абсорбции) на шкалу.

Объем вводимой пробы: 20 мм³.

Линейный диапазон детектирования сохраняется в пределах 2 - 20 нг.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор ципросульфамида с концентрацией 1,0 мкг/см³, соответственно разбавляют.

Для обработки результатов хроматографического анализа используется компьютерное программное обеспечение химического анализа, которое входит в хроматографическую систему.

Содержание ципросульфамида рассчитывают по формуле без учета полноты извлечения вещества из проб:

X - содержание ципросульфамида в пробе, мг/кг;

S_ст - высота (площадь) пика стандарта, мм;

S_пр - высота (площадь) пика образца, мм;

A - концентрация стандартного раствора, мкг/см³;

V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, см³;

m - масса анализируемого образца, г;

P - содержание ципросульфамида в аналитическом стандарте, %.

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости:

X₁, X₂ - результаты параллельных определений, мг/кг;

r - значение предела повторяемости (табл. 1), при этом .

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

Результат анализа представляют в виде:

- среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

- граница абсолютной погрешности, мг/кг:

- граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

В случае если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание вещества в пробе менее 0,01 мг/кг" <*>.

--------------------------------

<*> 0,01 мг/кг - предел обнаружения.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений, а также контроль стабильности градуировочной характеристики осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-02 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

13.1. Контроль стабильности градуировочной характеристики.

Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

Контроль стабильности градуировочной характеристики для ципросульфамида проводят при смене основного градуировочного раствора N 1 каждые шесть месяцев, при смене основного градуировочного раствора N 2 - каждые три месяца, при смене основных градуировочных растворов 3, 4, 5 и 6 - каждый месяц, а также в начале и по окончании каждой серии анализов.

При контроле стабильности градуировочной характеристики проводят измерения не менее трех образцов концентраций для градуировки, содержание ципросульфамида в которых должно охватывать весь диапазон концентраций от 0,1 до 1,0 мкг/см³.

Градуировочная характеристика считается стабильной, если для каждого из используемого для контроля градуировочного раствора сохраняется соотношение:

X - концентрация ципросульфамида контрольного измерения, мкг/см³;

C - известная концентрация градуировочного раствора ципросульфамида в смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1, взятая для контроля стабильности градуировочной характеристики, мкг/см³;

3,45 - погрешность градуировочной характеристики, %.

Если величина расхождения (A) превышает 3,45%, делают вывод о невозможности применения градуировочной характеристики для дальнейших измерений. В этом случае выясняют и устраняют причины нестабильности градуировочной характеристики и повторяют контроль ее стабильности с использованием других градуировочных растворов ципросульфамида, предусмотренных МВИ. При повторном обнаружении нестабильности градуировочной характеристики определяют ее заново согласно п. 7.3.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом добавок.

Величина добавки C_д должна удовлетворять условию:

- характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой соответственно) мг/кг, при этом:

- граница абсолютной погрешности, мг/кг:

- граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

Результат контроля процедуры К_к рассчитывают по формуле:

, , C_д - среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце и концентрация добавки соответственно, мг/кг.

Норматив контроля К рассчитывают по формуле:

Проводят сопоставление результата контроля процедуры (К_к) с нормативом контроля (К).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию:

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), не должно превышать предела воспроизводимости (R):

X₁, X₂ - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;

R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.