"МУК 4.1.3506-17. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Измерение концентраций действующих веществ пестицидов класса неоникотиноидов в моче. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 29.12.2017)

Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения в моче массовых концентраций пестицидов класса неоникотиноидов (тиаметоксам, имидаклоприд, клотианидин, ацетамиприд, тиаклоприд) в диапазонах 0,0001 - 0,002 мг/дм³.

Методические указания носят рекомендательный характер.

3-(2-хлор-1,3-тиазол-5-илметил)-5-метил-[1,3,5]оксадиазинан-4-илиден-N-нитроамин (ИЮПАК).

Структурная формула:

Эмпирическая формула: C₈H₁₀ClN₅O₃S.

Молекулярная масса: 291,7.

Белый кристаллический порошок без запаха. Температура плавления 139,1 °C. Давление паров: 6,6 x 10^-6 МПа (при 25 °C). Коэффициент распределения н-октанол/вода: K_ow log P = -0,13. Растворимость в органических растворителях при 25 °C (в г/дм³): ацетонитрил - 78; ацетон - 42,5; дихлорметан - 43; метанол - 10,2; этилацетат - 5,7; толуол - 0,6. Растворимость в воде при 20 °C: 4,1 г/дм³. Стабилен к гидролизу при температуре 20 °C при pH от 1 до 7; DT₅₀ при pH 9 - 11,5 дней.

В присутствии света в водных фотолитических условиях тиаметоксам быстро деградирует с периодом полураспада 2,3 дня.

Краткая токсикологическая характеристика. Острая пероральная токсичность (LD₅₀) для крыс - 1 560 мг/кг; острая дермальная токсичность (LD₅₀) для крыс - более 2 000 мг/кг; острая ингаляционная токсичность (LC₅₀) для крыс - более 3 720 мг/м³ воздуха.

(E)-1-(2-хлор-1,3-тиазол-5-илметил)-3-метил-2-нитрогуанидин (ИЮПАК).

Структурная формула:

Эмпирическая формула: C₆H₈ClN₅O₂S.

Молекулярная масса: 249,7.

Светло-кремовый порошок без запаха. Температура плавления 176,8 °C. Давление паров: 2,8 x 10^-8 МПа (при 25 °C). Коэффициент распределения н-октанол/вода: K_OW log P = 0,905. Растворимость в органических растворителях при 25 °C (в г/дм³): ацетон - 15,2; этилацетат - 2,03; ксилол - 0,0128. Растворимость в воде при 20 °C: 0,34 г/дм³. Стабилен к гидролизу при pH 5, 7, 9 (при 20 °C).

Краткая токсикологическая характеристика. Острая пероральная токсичность (LD₅₀) для крыс - более 5 000 мг/кг; острая дермальная токсичность (LD₅₀) для крыс - более 2 000 мг/кг; острая ингаляционная токсичность (LC₅₀) для крыс - более 6 141 мг/м³.

(E)-1-(6-хлор-3-пиридилметил)-N-нитроимидазолидин-2-илиденамин (ИЮПАК).

Структурная формула:

Эмпирическая формула: C₉H₁₀ClN₅O₂.

Молекулярная масса: 255,7.

Химически чистый имидаклоприд представляет собой бесцветные кристаллы со слабым характерным запахом. Температура плавления: 144 °C. Давление паров: 4 x 10^-7 МПа (при 25 °C). Коэффициент распределения в системе н-октанол - вода K_owlogP = 0,57 (pH 7 при 20 °C). Растворимость (г/дм³) при 20 °C: в воде - 0,61; дихлорметане - 67; изопропаноле - 2,3; толуоле - 0,69; н-гексане < 0,1. Стабилен к гидролизу при pH 5 - 11.

Краткая токсикологическая характеристика. Острая пероральная токсичность LD₅₀ для крыс - 422 мг/кг. Острая дермальная токсичность LD₅₀ (24 часа) для крыс - более 5 000 мг/кг. Острая ингаляционная токсичность LC₅₀ (4 часа) для крыс - более 5 323 мг/м³.

(E)-N¹-[(6-хлор-3-пиридил)метил]-N²-циано-N¹-метилацетамиприд (ИЮПАК).

Структурная формула:

Эмпирическая формула: C₁₀H₁₁ClN₄.

Молекулярная масса: 222,7.

Бесцветное кристаллическое вещество. Температура плавления: 98,9 °C. Давление паров: < 1,0 x 10^-3 МПа (при 25 °C). Коэффициент распределения н-октанол - вода K_ow logP = 0,80 (при 25 °C). Хорошо растворим в ацетоне, метаноле, этаноле, дихлорметане, хлороформе, ацетонитриле и тетрагидрофуране, растворимость в н-гексане - 6,5 мг/дм³. Растворимость в воде при 25 °C - 4,25 г/дм³. Ацетамиприд стабилен в буферных растворах при pH 4, 5, 7, медленно разлагается при pH 9. Устойчив к воздействию солнечного света. Является слабым основанием, рКа - 0,7.

Краткая токсикологическая характеристика. Острая пероральная токсичность (LD₅₀) для крыс - 217 мг/кг (самцы), 146 мг/кг (самки); острая дермальная токсичность (LD₅₀) для крыс > 2 000 мг/кг; острая ингаляционная токсичность (LC₅₀) для крыс > 290 мг/дм³ (4 часа).

(Z)-3-(6-хлор-3-пиридилметил)-1,3-тиазолидин-2-илиденцианамин (ИЮПАК).

Эмпирическая формула: C₁₀H₉ClN₄S.

Молекулярная масса: 252,7.

Желтоватый порошок. Температура плавления: 136 °C. Давление паров: 3 x 10^-7 МПа (при 25 °C). Коэффициент распределения н-октанол/вода: K_OW log P = 1,26. Растворимость в органических растворителях при 20 °C (в мг/дм³): ацетон - 64 000; этилацетат - 9 400; ксилол - 300; н-гексан - 100. Растворимость в воде при 20 °C: 184 мг/дм³. Стабилен к гидролизу при pH от 5 до 9 (при 20 °C).

Краткая токсикологическая характеристика. Острая оральная токсичность (LD₅₀) для крыс - 444 мг/кг; острая дермальная токсичность (LD₅₀) для крыс - более 2 000 мг/кг; острая ингаляционная токсичность (LC₅₀) для крыс - более 0,481 мг/дм³ воздуха.

Область применения. Тиаметоксам, клотианидин, имидаклоприд, ацетамиприд и тиаклоприд - инсектициды системного, контактного и кишечного действия из группы неоникотиноидов, эффективно подавляют развитие тли, белокрылки, клопов, трипсов и жесткокрылых в посевах многих культур, особенно овощных и плодовых.

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций.

Полнота извлечения веществ, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для всего диапазона измерений (n = 20) приведены в табл. 2.

Методика основана на определении веществ с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на обращенной фазе с тройным квадрупольным масс-спектрометрическим детектором.

Экстракцию веществ выполняют пропусканием анализируемых проб мочи через концентрирующие картриджи для твердофазной экстракции на основе октадецилсилана и элюированием метанолом.

Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки.

Нижний предел измерения веществ в анализируемом объеме пробы - 1 пг.

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Примечание. Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией, не требующих дополнительной очистки растворителей.

Примечание. Допускается использование вспомогательных средств измерений, устройств и материалов с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ Р 12.1.019-09, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф.

4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-15. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и ГН 2.2.5.2308-07. Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004-90.

4.3. При работе с газами, находящимися в баллонах под давлением до 15 МПа (150 кгс/см²), необходимо соблюдать Федеральные нормы и правила в области промышленной безопасности "Правила промышленной безопасности опасных производственных объектов, на которых используется оборудование, работающее под избыточным давлением" (утв. Приказом Ростехнадзора от 25.03.2014 N 116). Запрещается открывать вентиль баллона, не установив на нем понижающий редуктор.

Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист, имеющий опыт работы на жидкостном хроматографе, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений.

К проведению пробоподготовки допускают оператора с квалификацией "лаборант", имеющего опыт работы в химической лаборатории.

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C и относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Измерениям предшествуют следующие операции: очистка ацетонитрила (при необходимости), подготовка подвижной фазы для ВЭЖХ, кондиционирование хроматографической колонки, приготовление растворов, приготовление градуировочных растворов и растворов внесения, подготовка концентрирующих патронов, установление градуировочной характеристики.

Ацетонитрил кипятят с обратным холодильником над пентоксидом фосфора (на 1 дм³ ацетонитрила 20 г пентоксида фосфора) не менее 1 часа, после чего перегоняют, непосредственно перед употреблением ацетонитрил повторно перегоняют над прокаленным карбонатом калия (на 1 дм³ ацетонитрила 10 г карбоната калия).

Компонент А: раствор 0,05%-й (вес/объем) формиата аммония + 0,01%-й (по объему) раствор муравьиной кислоты в воде.

В мерную колбу вместимостью 1 000 см³ помещают 0,5 г формиата аммония, растворяют в 300 - 400 см³ бидистиллированной воды, вносят 0,1 м³ муравьиной кислоты, доводят до метки водой, перемешивают.

Компонент Б: раствор 0,01%-й (по объему) муравьиной кислоты в метаноле.

В мерную колбу вместимостью 1 000 см³ помещают 500 см³ метанола, вносят 0,1 см³ муравьиной кислоты, доводят до метки бидистиллированной водой, перемешивают.

Растворы компонентов подвижной фазы хранят в темном месте (в емкости из темного стекла) не более 14 дней.

Промывают колонку подвижной фазой (смесь компонентов А и Б, приготовленных по п. 7.2, в соотношении 1:1) при скорости подачи растворителя 0,4 см³/мин до установления стабильной базовой линии.

7.4.1. Приготовление раствора уксусной кислоты в ацетонитриле с объемной долей 1% (1%-й раствор). В мерную колбу вместимостью 1 000 см³ помещают 300 - 400 см³ ацетонитрила, вносят 10 см³ ледяной уксусной кислоты, перемешивают, доводят ацетонитрилом до метки, вновь перемешивают. Раствор хранят в темном месте (в емкости из темного стекла) не более 14 дней.

7.4.2. Приготовление раствора муравьиной кислоты в воде с объемной долей 0,1% (0,1%-й раствор). В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 30 - 40 см³ бидистиллированной воды, вносят 0,1 см³ муравьиной кислоты, перемешивают, доводят водой до метки, вновь перемешивают. Раствор хранят в темном месте (в емкости из темного стекла) не более 14 дней.

7.5.1. Исходные растворы тиаметоксама, имидаклоприда, клотианидина, ацетамиприда и тиаклоприда для градуировки (концентрация 100 мкг/см³). В 5 мерных колб вместимостью 100 см³ помещают (0,0100 +/- 0,0001) г тиаметоксама, имидаклоприда, клотианидина, ацетамиприда и тиаклоприда, добавляют 50 - 70 см³ ацетонитрила, перемешивают, доводят ацетонитрилом до метки, вновь перемешивают. Растворы хранят в холодильнике при температуре 2 - 6 °C в течение 3 месяцев.

7.5.2. Раствор N 1 тиаметоксама, имидаклоприда, клотианидина, ацетамиприда и тиаклоприда для градуировки и внесения (концентрация каждого вещества по 0,1 мкг/см³). В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают по 0,1 см³ исходного раствора каждого вещества с концентрацией 100,0 мкг/см³ (п. 7.5.1), доводят до метки ацетонитрилом, тщательно перемешивают. Раствор N 1 хранят в холодильнике при температуре 2 - 6 °C в течение месяца.

Растворы N 2 - 6 готовят объемным методом путем последовательного разбавления раствора N 1.

7.5.3. Рабочие растворы N 2 - 6 тиаметоксама, имидаклоприда, клотианидина, ацетамиприда и тиаклоприда для градуировки (концентрация каждого вещества по 0,0005 - 0,01 мкг/см³). В 5 мерных колб вместимостью 100 см³ помещают 10,0; 5,0; 2,0; 1,0 и 0,5 см³ градуировочного раствора N 1 с концентрацией тиаметоксама, имидаклоприда, клотианидина, ацетамиприда и тиаклоприда по 0,1 мкг/см³ (п. 7.5.2), доводят до метки раствором, приготовленным по п. 7.4.1, тщательно перемешивают, получают рабочие растворы N 2 - 6 с концентрацией каждого вещества 0,01; 0,005; 0,002; 0,001 и 0,0005 мкг/см³ соответственно.

Растворы хранят в холодильнике при температуре 2 - 6 °C в течение одной недели.

Концентрирующие патроны с использованием медицинского одноразового шприца промывают со скоростью прохождения растворителя 1 - 2 капли в секунду: последовательно 2 см³ метанола и 5 см³ бидистиллированной воды. Патроны готовят непосредственно перед использованием.

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади пика (I) от концентрации тиаметоксама, имидаклоприда, клотианидина, ацетамиприда и тиаклоприда в растворе (нг/см³), устанавливают методом абсолютной калибровки по 5 растворам для градуировки.

В инжектор хроматографа вводят по 2 мм³ каждого градуировочного раствора, приготовленного по п. 7.5.3, и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.2. Осуществляют не менее 5 параллельных измерений. Устанавливают площади пиков веществ, на основании которых строят градуировочные зависимости.

Отбирают суточную пробу мочи: от первого опорожнения мочевого пузыря после работы с пестицидом до первого опорожнения мочевого пузыря на следующее утро. Собранную суточную пробу мочи, перемешивают, отбирают образцы объемом 100 см³.

Пробы мочи хранят при температуре (4 +/- 2) °C не более 3 дней. Для длительного хранения образцы мочи замораживают и хранят при температуре не выше -18 °C.

Пробу мочи объемом 5 см³, разбавленную 5 см³ раствора муравьиной кислоты (приготовленного по п. 7.4.2), пропускают через концентрирующий патрон C18 (подготовленный по п. 7.6) со скоростью 2 - 3 капли в секунду. После нанесения пробы патрон дополнительно промывают 2 см³ бидистиллированной воды, высушивают пропусканием воздуха (2 мин). Вещества элюируют 1 см³ метанола, собирая элюат в виалу, и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.2.

Измерения выполняют при следующих режимных параметрах:

Жидкостный хроматограф с тандемным масс-спектрометрическим детектором (тройной квадруполь с источником ионизации, оснащенным соосной подачей горячего азота для эффективной десольвации ионов).

Источник ионизации: электростатическое распыление

Режим работы: регистрация дочерних положительных ионов после разрушения материнских ионов (регистрация "перехода").

Скорость сканирования: 200 мс.

Давление на распылителе: 35 psi.

Скорость осушающего газа 1 (азот): 10 дм³/мин.

Температура газа 1: 250 °C.

Скорость газа 2 (азот): 11 дм³/мин.

Температура газа 2: 340 °C.

Температура квадруполей (1 и 3): 100 °C.

Хроматографическая колонка стальная длиной 150 мм, внутренним диаметром 2,1 мм, заполненная обращенно-фазовым сорбентом с привитыми монофункциональными полярными группами C18, зернением 1,8 мкм.

Температура колонки: 45 °C.

Скорость потока элюента: 0,4 см³/мин.

Объем вводимой пробы: 2 мм³.

Режим элюирования (градиентный), пробег 8,5 мин, промывка колонки после анализа 1,5 мин (табл. 4).

Линейный диапазон детектирования 1 - 20 пг

Образцы, дающие пики большие, чем градуировочный раствор с концентрацией вещества 0,01 мкг/см³, разбавляют 1%-м раствором уксусной кислоты в ацетонитриле (не более чем в 50 раз).

Содержание тиаметоксама, имидаклоприда, клотианидина, ацетамиприда или тиаклоприда в моче работающих (X, мг/дм³) рассчитывают по формуле:

A - концентрация тиаметоксама, имидаклоприда, клотианидина, ацетамиприда или тиаклоприда, найденная по градуировочному графику в соответствии с величинами площадей хроматографических пиков, нг/см³;

V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, см³;

u - объем анализируемого образца, см³.

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости:

X₁, X₂ - результаты параллельных определений, мг/дм³;

r - значение предела повторяемости (табл. 1), при этом .

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

Результат анализа представляют в виде:

, мг/дм³ при вероятности P = 0,95, где

- среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/дм³;

- граница абсолютной погрешности, мг/дм³:

- граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

Если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание тиаметоксама, имидаклоприда, клотианидина, ацетамиприда или тиаклоприда в моче - менее 0,0001 мг/дм³ <*>".

--------------------------------

<*> 0,0001 мг/дм³ - предел обнаружения тиаметоксама, имидаклоприда, клотианидина, ацетамиприда или тиаклоприда в моче.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-02 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

13.1. Контроль стабильности градуировочной характеристики.

Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят в начале и по окончании каждой серии анализов.

При контроле стабильности градуировочной характеристики проводят измерения не менее двух градуировочных растворов, содержание тиаметоксама, имидаклоприда, клотианидина, ацетамиприда или тиаклоприда в которых должно входить в диапазон линейности градуировочной характеристики от 0,0005 до 0,01 мкг/см³.

Градуировочная характеристика считается стабильной, если для каждого из используемого для контроля градуировочного раствора сохраняется соотношение:

X - концентрация тиаметоксама, имидаклоприда, клотианидина, ацетамиприда или тиаклоприда в пробе при контрольном измерении, мкг/см³;

C - известная концентрация градуировочного раствора тиаметоксама, имидаклоприда, клотианидина, ацетамиприда или тиаклоприда, взятая для контроля стабильности градуировочной характеристики, мкг/см³;

B - норматив контроля погрешности градуировочной характеристики, % (равен 20% при P = 0,95).

Если величина расхождения (A) превышает 20%, делают вывод о невозможности применения градуировочной характеристики для дальнейших измерений. В этом случае выясняют и устраняют причины нестабильности градуировочной характеристики и повторяют контроль ее стабильности с использованием других градуировочных растворов тиаметоксама, имидаклоприда, клотианидина, ацетамиприда или тиаклоприда, предусмотренных МИ. При повторном обнаружении нестабильности градуировочной характеристики устанавливают ее заново согласно п. 7.7.

Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом "добавок".

Величина добавки C_д должна удовлетворять условию:

- характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой соответственно) мг/дм³, при этом:

- граница абсолютной погрешности, мг/дм³:

- граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

Результат контроля процедуры К_к рассчитывают по формуле:

, , C_д - среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки соответственно, мг/дм³.

Норматив контроля К рассчитывают по формуле:

Проводят сопоставление результата контроля процедуры (К_к) с нормативом контроля (К).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), не должно превышать предела воспроизводимости (R):

X₁, X₂ - результаты измерений, выполненных в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), мг/дм³;

R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.