"МУК 4.1.3265-15. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств пропизахлора в зернобобовых (соя и соевое масло) методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 09.06.2015)

1. Разработаны сотрудниками ФГБНУ Всероссийский НИИ защиты растений Федерального агентства научных организаций (В.И. Долженко, И.А. Цибульская, А.С. Комарова, Т.Д. Черменская).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 22 мая 2015 г. N 1).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия населения, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 9 июня 2015 г.

4. Введены впервые.

Свидетельство о метрологической аттестации N 01.5.04.187/ 01.00043/2014.

Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения остаточных количеств пропизахлора в бобах и масле сои в диапазоне 0,05 - 0,5 мг/кг.

Методические указания носят рекомендательный характер.

2-chloro-6'-ethyl-N-isopropoxymethylacet-ortho-toluidide (ИЮПАК)

Структурная формула:

Молекулярная масса: 283,8.

Брутто формула: C₁₅H₂₂ClNO₂.

Химически чистое вещество представляет собой маслянистую жидкость от пурпурного до светло-коричневого цвета.

Температура плавления: 21,6 °C.

Давление пара при 20 °C: 4,0 МПа.

Растворимость в воде: 184 мг/дм³ (при 20 °C).

Стабильность к гидролизу: стабилен, при 50 °C: DT₅₀ = 5 дней (pH от 4 до 9).

Период полураспада в почве: DT₅₀ = от 4 до 14 дней.

Краткая токсикологическая характеристика. Острая пероральная токсичность LD₅₀ для млекопитающих для крыс 2 088 - 3 433 мг/кг, острая дермальная токсичность LD₅₀ для млекопитающих превышает 2 000 мг/кг. Ингаляционная токсичность LC₅₀ для крыс более 5 000 мг/м³. Оказывает раздражающее действие на кожу и слизистую глаз, канцероген. Класс опасности по ВОЗ III. Не токсичен для пчел, не опасен для почвенных микроорганизмов.

Область применения препарата. Селективный системный гербицид для борьбы с широколиственными сорняками и однолетними травами, адсорбируется корнями.

Механизм действия. Ингибирование синтеза белка.

Гигиенические нормативы для пропизахлора в России: МДУ кукуруза, рапс (зерно, масло), подсолнечник (семена, масло) 0,1 мг/кг.

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1, для соответствующих диапазонов концентраций.

Метод основан на определении пропизахлора методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием УФ-детектора после его экстракции из образцов бобов и масла сои ацетонитрилом, очистки в системе несмешивающихся растворителей и на патронах для твердофазной экстракции.

Идентификация пропизахлора проводится по времени удерживания, количественное определение - методом абсолютной калибровки. Избирательность метода обеспечивается сочетанием условий подготовки проб и хроматографирования.

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Примечание. Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией, не требующих дополнительной очистки растворителей.

Примечание. Допускается применение оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-09, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф.

4.2. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией, соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и ГН 2.2.5.2308-07.

Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004-90.

Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист-химик, имеющий опыт работы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, ознакомленный с руководством по эксплуатации хроматографа, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 13.

При выполнении измерений выполняют следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C и относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Перед началом анализа колонку кондиционируют в потоке подвижной фазы (0,1 - 0,2 см³/мин) до стабилизации нулевой линии.

Последовательно соединенные патроны промывают 5 см³ смеси N 1, затем 5 см³ гексана.

7.3.1. 0,005 М раствор ортофосфорной кислоты: (0,5 +/- 0,01) г 98% ортофосфорной кислоты помещают в мерную колбу объемом 1 дм³, растворяют в бидистиллированной воде и доводят объем до метки.

7.3.2. Для приготовления подвижной фазы смешивают ацетонитрил с 0,005 М раствором ортофосфорной кислоты в соотношении 43:57 по объему, используя мерные цилиндры.

7.3.3. Для приготовления гексана, насыщенного ацетонитрилом, в делительной воронке интенсивно встряхивают гексан и ацетонитрил в соотношении 5:1 по объему и после разделения отбирают верхний слой.

7.4.1. Основной раствор с концентрацией 0,5 мг/см³: точную навеску пропизахлора (50 +/- 0,5 мг) помещают в мерную колбу вместимостью 100 см³, растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки ацетонитрилом.

7.4.2. Приготовление градуировочных растворов

Градуировочные растворы с концентрациями пропизахлора 0,25, 0,5, 1,0, 2,5 и 5,0 мкг/см³ готовят методом последовательного разбавления по объему, используя раствор подвижной фазы (смесь ацетонитрила и 0,005 М ортофосфорной кислоты в соотношении 43:57).

7.4.2.1. Раствор N 1 с концентрацией 5,0 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 100 см³ вносят 1,0 см³ основного раствора и доводят до метки подвижной фазой.

7.4.2.2. Раствор N 2 с концентрацией 2,5 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 0,5 см³ основного раствора и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.4.2.3. Раствор N 3 с концентрацией 1,0 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 2 см³ раствора N 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.4.2.4. Раствор N 4 с концентрацией 0,5 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 1 см³ раствора N 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.4.2.5. Раствор N 5 с концентрацией 0,25 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 0,5 см³ раствора N 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

Основной раствор можно хранить в холодильнике при температуре 0 - 4 °C в течение 7 дней, градуировочные растворы использовать в день приготовления.

При изучении полноты определения пропизахлора используют ацетонитрильные растворы вещества, приготовленные из основного раствора методом последовательного разбавления по объему ацетонитрилом.

Для установления градуировочной характеристики (площадь пика - концентрация пропизахлора в растворе) в хроматограф вводят по 10 мм³ градуировочных растворов (не менее 3 параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4 точек по диапазону измеряемых концентраций). Затем измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации пропизахлора в градуировочном растворе.

Методом наименьших квадратов рассчитывают градуировочный коэффициент (К) в уравнении линейной регрессии:

где S - площадь пика градуировочного раствора.

Градуировку признают удовлетворительной, если значение коэффициента линейной корреляции оказывается не ниже 0,99.

Градуировочную характеристику необходимо проверять при замене реактивов, хроматографической колонки или элементов хроматографической системы, а также при отрицательном результате контроля градуировочного коэффициента.

Градуировочную зависимость признают стабильной при выполнении следующего условия:

где C - аттестованное значение массовой концентрации пропизахлора в градуировочном растворе;

C_к - результат контрольного измерения массовой концентрации пропизахлора в градуировочном растворе;

- норматив контроля градуировочного коэффициента, % ( при P = 0,95).

В круглодонную колбу емкостью 10 см³ отбирают 1 см³ стандартного раствора пропизахлора с концентрацией 1 мкг/см³. Растворитель удаляют в вакууме. Остаток растворяют в 1 см³ гексана и переносят на подготовленные патроны (п. 7.2). Колбу обмывают 1 см³ гексана и смыв тоже переносят на патроны. Промывают патроны 5 см³ гексана и 5 см³ смеси N 2, элюат отбрасывают. Затем элюируют пропизахлор смесью N 1 со скоростью 1 - 2 капли в секунду. Отбирают фракции по 2 см³, упаривают досуха, растворяют в 1 см³ подвижной фазы и анализируют по п. 9.3.

Фракции, содержащие пропизахлор, объединяют и вновь анализируют.

Устанавливают уровень вещества в элюате, определяют полноту смывания с патрона и необходимый для очистки объем элюата.

Примечание. Проверку хроматографического поведения пропизахлора следует проводить обязательно, поскольку профиль вымывания может изменяться при использовании новой партии патронов и растворителей.

Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (N 2051-79 от 21.08.79), а также в соответствии с ГОСТ 10852-86 "Семена масличные. Правила приемки и методы отбора проб".

Для длительного хранения зерно сои подсушивают при комнатной температуре в отсутствие прямого солнечного света. Сухие образцы могут храниться в течение года. Перед анализом пробы зерна доводят до стандартной влажности и измельчают. Пробы масла хранят в холодильнике при 0 - 4 °C в герметично закрытой стеклянной таре не более 2 месяцев.

Навеску измельченных бобов (10 г) или масла (5 г) помещают в полипропиленовую центрифужную пробирку вместимостью 50 см³, добавляют 30 см³ ацетонитрила, пробирку плотно закрывают и помещают в перемешивающее устройство на 10 мин, затем центрифугируют. Ацетонитрил декантируют в делительную воронку. Экстракцию повторяют 20 см³ ацетонитрила. Объединенные ацетонитрильные фракции дважды, порциями по 20 см³, промывают гексаном, насыщенным ацетонитрилом, и упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 30 °C. Сухой остаток подвергают очистке на патроне по п. 9.2.

Сухой остаток, полученный по п. 9.1, растворяют в 1 см³ гексана, наносят на предварительно кондиционированные патроны (п. 7.2), колбу ополаскивают 1 см³ гексана и также наносят на патроны. Патроны промывают 5 см³ гексана и 10 см³ смеси N 2, элюат отбрасывают. Пропизахлор элюируют 6 см³ смеси N 1, элюат собирают, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 30 °C, остаток растворяют в 1 см³ подвижной фазы и 10 мм³ вводят в хроматограф.

Примечание: ввиду летучести аналита упаривание следует проводить при температуре бани не выше 30 °C.

Ультраэффективный жидкостный хроматограф с быстросканирующим УФ-детектором, снабженный дегазатором, стандартными автосамплером и термостатом колонки. Аналитическая колонка, заполненная сорбентом с привитой трифункциональной C₆фенильной фазой, (2,1 x 100) мм, 1,7 мкм. Температура колонки (30 +/- 1) °C. Подвижная фаза: ацетонитрил и 0,005 М ортофосфорная кислота в соотношении 43:57. Скорость потока элюента: 0,2 см³/мин. Рабочая длина волны УФ-детектора 220 нм. Объем вводимой пробы 10 мм³. Линейный диапазон детектирования от 0,25 мкг/см³ до 5,0 мкг/см³. Время удерживания пропизахлора (9,9 +/- 0,1) мин.

Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки. Содержание пропизахлора в пробе (X, мг/кг) вычисляют по формуле:

где S_x - площадь пика пропизахлора на хроматограмме испытуемого образца, мм² (AU);

К - градуировочный коэффициент, найденный на стадии построения соответствующей градуировочной зависимости;

V - объем пробы, подготовленной для хроматографического анализа, см³;

P - навеска анализируемого образца, г.

Содержание остаточных количеств пропизахлора в образце вычисляют как среднее из двух параллельных определений.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор пропизахлора с концентрацией 1,0 мкг/см³, разбавляют подвижной фазой для ВЭЖХ.

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости:

где X₁, X₂ - результаты параллельных определений, мг/кг;

r - значение предела повторяемости (табл. 1 раздела "Погрешность измерений"), при этом .

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

Результат анализа представляют в виде:

где X - среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

- граница абсолютной погрешности, мг/кг:

- граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1 раздела "Погрешность измерений"), %.

В случае если содержание компонента меньше нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

--------------------------------

<*> - 0,05 мг/кг - предел количественного определения пропизахлора в масле.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-02 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.

Величина добавки C_д должна удовлетворять условию:

где - характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой, соответственно), мг/кг; при этом:

где - граница абсолютной погрешности, мг/кг:

где - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1 раздела "Погрешность измерений"), %.

Контроль проводят путем сравнения результата контрольной процедуры К_к с нормативом контроля К.

Результат контрольной процедуры К_к рассчитывают по формуле:

где , , C_д - среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11 "Проверка приемлемости результатов параллельных определений") содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки, соответственно, мг/кг.

Норматив контроля К рассчитывают по формуле:

Проводят сопоставление результата контроля процедуры (К_к) с нормативом контроля (К).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (3) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (3) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры к их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), не должно превышать предела воспроизводимости (R):

где X₁, X₂ - результаты измерений в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), мг/кг;

R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1 "Погрешность измерений"), %.