"МУК 4.1.3478-17. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Измерение содержания летучих N-нитрозоаминов (N-нитрозодиметиламин, N-нитрозодиэтиламин) в молочной продукции (детские каши) хромато-масс-спектрометрическим методом. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 15.06.2017)

1. Подготовлены коллективом авторов ФГБНУ "Восточно-Сибирский институт медико-экологических исследований", Федеральным бюджетным учреждением науки ФНЦ "Федеральный научный центр медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения", ФБУН "Нижегородский НИИ гигиены и профпатологии" Роспотребнадзора, ФБУЗ "Федеральный центр гигиены и эпидемиологии" Роспотребнадзора.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 22 декабря 2016 г. N 2).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 15 июня 2017 г.

4. Введены впервые.

Методические указания разработаны Федеральным бюджетным учреждением науки ФНЦ "Федеральный научный центр медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения" (Уланова Т.С., Зайцева Н.В., Нурисламова Т.В., Попова Н.А., Мальцева О.А., Терентьев Г.И.).

Включенные в сборник 9 методических указаний по определению химических соединений в биологических средах, объектах окружающей среды и молочной продукции предназначены для использования в химико-аналитических исследованиях при проведении биомониторинга состояния здоровья населения, для практического использования в рамках социально-гигиенического мониторинга на территориях с высокой антропогенной нагрузкой, а также могут быть использованы для диагностических целей в рамках осуществления государственного санитарного надзора, контроля, экспертизы, расследований. Методические указания предназначены для специалистов химико-аналитических лабораторий системы Роспотребнадзора, научно-исследовательских институтов, работающих в области экологии человека, гигиены окружающей среды и защиты прав потребителей.

Методические указания, включенные в сборник, разработаны и подготовлены в соответствии с требованиями ГОСТ Р 8.563-96 "Государственная система обеспечения единства измерений. Методики выполнения измерений", ГОСТ Р 1.5-92 "ГСС. Общие требования к построению, изложению, оформлению и содержанию стандартов", МИ 2335-95 "Внутренний контроль качества результатов количественного химического анализа", МИ 2336-95 "Характеристики погрешности результатов количественного химического анализа. Алгоритм оценивания".

Все методики измерения прошли метрологическую аттестацию в соответствии с правилами ПР 50.2.002-94 "ГСИ. Порядок осуществления государственного метрологического надзора за выпуском, состоянием и применением средств измерений, аттестованными методиками выполнения измерений, эталонами и соблюдением метрологических правил и норм".

В методических указаниях, включенных в сборник, приведены методы определения 6 органических соединений в биологических средах (моча, кровь) и молочной продукции, 4 тяжелых металлов в молочной продукции и 20 тяжелых металлов и элементов в атмосферном воздухе. Определение токсичных веществ и элементов основано на использовании современных высокочувствительных методов физико-химического анализа - капиллярной газожидкостной хроматографии, хромато-масс-спектрометрии, масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой, высокоэффективной жидкостной хроматографии, потенциометрии с применением ионселективного электрода.

Методические указания рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

Свидетельство об аттестации методики 88-16207-046-RA.RU.310657-2016 от 25.05.2016.

1.1. Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода газохроматографического анализа с масс-селективным детектированием для измерения содержания N-нитрозоаминов (N-нитрозодиметиламин, N-нитрозодиэтиламин) в пробах молочной продукции в диапазоне концентраций от 0,0004 до 0,0032 мкг/г.

1.2. Методические указания по измерению содержания N-нитрозоаминов (N-нитрозодиметиламин, N-нитрозодиэтиламин) в пробах молочной продукции предназначены для проведения лабораторных исследований безопасности пищевой продукции предприятиями и учреждениями, осуществляющими контроль качества и исследование пищевых продуктов и продовольственного сырья.

1.3. Методические указания носят рекомендательный характер.

N-нитрозоамины - малоустойчивые вещества, стабильны только при температурах ниже 0 °C, являются жидкими или твердыми веществами желтого цвета.

N-нитрозоамины являются высокотоксичными соединениями. При попадании в организм поражают печень, вызывают кровоизлияния. Большая часть N-нитрозоаминов обладает сильным канцерогенным действием даже при однократном действии, проявляет мутагенные свойства. N-нитрозодиметиламин обладает отдаленными эффектами: эмбриотропным, гонадотропным, мутагенным.

N-нитрозодиметиламин: CAS 62-75-9, формула C₂H₆N₂O/(CH₃)₂NN=O, молекулярная масса: 148,0, T_кип: 153 °C. Растворимость в воде хорошая, давление паров, Па, при 20 °C: 360, класс опасности: 1-й, характеристичные ионы, m/z N-итрозодиметиламина 74-42.

N-нитрозодиэтиламин: CAS 55-18-5, формула C₂H₆N₂O/(C₂H₅)₂NN=O, молекулярная масса: 176,0, T_кип: 175 °C, растворимость в воде, г/100 см³, при 20 °C: 10,6, класс опасности: 1-й, характеристичные ионы, m/z N-итрозодиэтиламина 102-57.

При соблюдении всех регламентированных условий и проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) измерений не превышает значений, приведенных в табл. 1.

Значения показателя точности используют:

- при оформлении результатов измерений, выдаваемых лабораторией;

- при оценке деятельности лабораторий по вопросу качества проведения измерений;

- при оценке возможности использования результатов измерений при реализации методики измерений в конкретной лаборатории.

Измерение содержания N-нитрозоаминов (N-нитрозодиметиламин, N-нитрозодиэтиламин) в пробе молочной продукции выполняют методом газохроматографического анализа с масс-спектрометрическим детектированием. Извлечение и концентрирование N-нитрозоаминов (N-нитрозодиметиламин, N-нитрозодиэтиламин) из проб молочной продукции проводят методом дистилляции с водяным паром в кислой среде с высаливающими реагентами, концентрированием N-нитрозоаминов на картриджах с помощью системы твердофазной экстракции (ТФЭ), идентификации веществ по масс-спектрам и времени выхода с последующим количественным хромато-масс-спектрометрическим определением по градуировочному графику.

Определению не мешают углеводороды, спирты. Длительность измерений - 30 мин.

При выполнении измерений и подготовке проб применяют следующие средства измерений, реактивы, вспомогательные устройства и материалы:

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Примечание. Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией.

Примечание. Допускается использование вспомогательных устройств и материалов с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

6.1. При выполнении работ необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76.

6.2. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией и соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91, и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83.

6.3. При выполнении измерений с использованием хромато-масс-спектрометра соблюдают правила электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ Р 12.1.019-09 и инструкцию по эксплуатации прибора.

6.4. При работе с сосудами, работающими под давлением, необходимо соблюдать правила их устройства и безопасной эксплуатации в соответствии с федеральными нормами и правилами в области промышленной безопасности "Правила промышленной безопасности опасных производственных объектов, на которых используется оборудование, работающее под избыточным давлением".

6.5. Содержание вредных веществ в воздухе рабочей зоны не должно превышать допустимых значений по ГОСТ 12.1.005-88, ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и ГН 2.2.5.2308-07.

6.6. Организуют обучение работающих безопасности труда по ГОСТ 12.0.004-90.

6.7. Работу с N-нитрозоаминами, стандартами, другими химическими соединениями и растворителями проводить в вытяжном шкафу с использованием индивидуальных средств защиты (очки, перчатки и др.).

6.8. В лаборатории, где проводится работа с летучими N-нитрозоаминами, необходимо всегда иметь 2 - 3%-й раствор газообразного бромоводорода (HBr) в уксусной кислоте для разрушения N-нитрозоаминов при попадании их на рабочие места и пол.

6.9. В целях разрушения летучих N-нитрозоаминов в воздухе по окончании работы помещение необходимо обработать ультрафиолетовым светом.

6.10. N-нитрозоамины хранят в специальном холодильнике в отсутствии анализируемых проб.

Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист, имеющий опыт работы на хромато-масс-спектрометре, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений.

При выполнении измерений в лаборатории соблюдают следующие условия:

- температура окружающего воздуха: (20 +/- 5) °C;

- атмосферное давление: от 84,0 до 106,7 кПа (630 - 800 мм рт. ст.);

- относительная влажность воздуха: от 30 до 80%;

- напряжение в сети: (220 +/- 10) В;

- частота переменного тока: (50 +/- 10) Гц.

Выполнение измерений на хромато-масс-спектрометре проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

При подготовке к выполнению измерений проводят следующие работы: подготовка стеклянной посуды, подготовка хроматографической системы, приготовление растворов для градуировки, установление градуировочной характеристики, отбор проб.

В термостойкий стакан вместимостью 2 дм³ помещают 50 г калия двухромовокислого, осторожно приливают по палочке частями, тщательно перемешивая, 1 дм³ концентрированной серной кислоты.

Используемую посуду необходимо замочить в свежеприготовленном 3%-м растворе калия двухромовокислого в серной кислоте, промыть проточной водопроводной водой, ополоснуть дистиллированной водой и высушить в сушильном шкафу при температуре 105 °C.

Подготовку хроматографа к работе осуществляют в соответствии с инструкцией по эксплуатации хроматографа.

9.2.1. Кондиционирование кварцевой капиллярной колонки. Новую кварцевую капиллярную колонку предварительно кондиционируют, нагревая в термостате хроматографа ступенчато с 70 до 250 °C в течение 2 часов и выдерживают при 250 °C в течение суток. После охлаждения термостата до комнатной температуры выход колонки подсоединяют к устройству сопряжения с масс-спектрометром и проверяют стабильность нулевой линии при рабочей температуре термостата колонок.

9.2.2. Устанавливают режим работы хромато-масс-спектрометра в соответствии со следующими условиями:

Записывают нулевую линию при установленных режимных параметрах. При отсутствии флуктуации приступают к работе.

9.3.1. Приготовление раствора серной кислоты. В термостойкий химический стакан помещают 36 см³ бидистиллированной воды, при непрерывном помешивании приливают 60 см³ концентрированной серной кислоты. Раствор охлаждают. Срок хранения неограничен.

9.3.2. Приготовление раствора 2%-го сульфаминовой кислоты. Растворяют 2 г сульфаминовой кислоты в 100 см³ бидистиллированной воды. Срок хранения 1 месяц.

9.3.3. Приготовление 2 - 3%-го раствора бромоводорода (HBr) в уксусной кислоте. Растворяют 1,4 см³ бромоводорода (HBr) в 100 см³ уксусной кислоты (с учетом плотности бромоводорода). Срок хранения раствора 5 дней.

9.3.4. Приготовление исходного раствора N-нитрозоаминов. Готовят из реактивов с известной массовой долей основного вещества. В мерную пробирку объемом 10 см³ дозатором добавляют метилового спирта в объеме 10 см³, вводят микрошприцем по 2 мм³ N-нитрозоаминов (N-нитрозодиметиламин, N-нитрозодиэтиламин). Весовое содержание компонентов в исходном растворе составляет (с учетом плотности и содержания основного вещества): N-нитрозодиметиламин - 0,2 мг/см³, N-нитрозодиэтиламин - 0,2 мг/см³. Срок хранения раствора 30 дней.

9.3.5. Приготовление рабочего раствора. В мерную колбу объемом 50 см³, содержащую бидистиллированную воду в объеме 50 см³, вводят дозатором 2 мм³ исходного раствора N-нитрозоаминов. Массовая концентрация N-нитрозодиметиламина в рабочем растворе составляет 0,008 мкг/см³ и N-нитрозодиэтиламина - 0,008 мкг/см³. Срок хранения раствора 5 часов.

9.3.6. Приготовление исходного раствора N-нитрозоаминов. Готовят из реактивов с известной массовой долей основного вещества. В мерную пробирку объемом 10 см³ дозатором добавляют метилового спирта в объеме 10 см³, вводят микрошприцем по 2 мм³ N-нитрозоаминов (N-нитрозодиметиламин, N-нитрозодиэтиламин). Весовое содержание компонентов в исходном растворе составляет (с учетом плотности и содержания основного вещества): N-нитрозодиметиламин - 0,2 мг/см³, N-нитрозодиэтиламин - 0,2 мг/см³. Срок хранения раствора 30 дней.

9.3.7. Приготовление рабочего раствора. В мерную колбу объемом 50 см³, содержащую бидистиллированную воду в объеме 50 см³, вводят дозатором 2 мм³ исходного раствора N-нитрозаминов. Массовая концентрация N-нитрозодиметиламина в рабочем растворе составляет 0,008 мкг/см³ и N-нитрозодиэтиламина - 0,008 мкг/см³. Срок хранения раствора 5 часов.

9.3.8. Приготовление градуировочных растворов. Градуировочные растворы N-нитрозоаминов готовят в мерных колбах объемом 100 см³. Для этого в каждую колбу вносят по 50 см³ бидистиллированной воды и добавляют рабочий раствор для градуировки в соответствии с табл. 2, содержимое колбы доводят до метки бидистиллированной водой и тщательно перемешивают.

Градуировочные характеристики устанавливают на градуировочных растворах N-нитрозодиметиламина и N-нитрозодиэтиламина методом абсолютной градуировки. Приготовленные растворы хроматографируют на капиллярной колонке не менее 5 раз. На полученной хроматограмме определяют площади пиков молекулярных ионов компонентов и по средним результатам измерений по 5 концентрациям для градуировки строят градуировочную характеристику. Она выражает зависимость площади пика молекулярных ионов N-нитрозодиметиламина и N-нитрозодиэтиламина на хроматограмме (мВ - при автоматическом обсчете с использованием программно-аппаратного комплекса) от содержания (нг).

Градуировочный раствор (табл. 4) помещают в круглодонную колбу объемом 500 см³, подкисляют 2,5 см³ 2%-й сульфаминовой кислоты и 0,5 см³ 60%-м раствором серной кислоты до pH = 3. Затем добавляют высаливающие реагенты (5 г сульфата натрия и 5 г хлорида натрия). С помощью перегретого водяного пара (t <2> = (100 +/- 5) °C и t <3> = (80 +/- 5) °C), образуемого в парообразователе, выполняют процедуру отгонки. Дистиллят, сконденсированный в холодильнике, собирают в объеме 70 см³ в коническую колбу-приемник. Затем дистиллят пропускают через картридж на угольной основе автоматической системы ТФЭ, элюирование осуществляют хлористым метиленом.

--------------------------------

<2> Температура парообразователя.

<3> Температура колбы с градуировочным раствором.

По истечении 30 мин экстракт хлористого метилена объемом 2 мм² через испаритель вводят в хроматографическую колонку хроматографа и анализируют по п. 9.2.2.

Каждый градуировочный раствор хроматографируют два раза. Процедуру повторяют аналогично для каждого градуировочного раствора. На полученной хроматограмме определяют площади пиков (безразмерные компьютерные единицы, бке) молекулярных ионов для N-нитрозодиметиламина - 74 m/z, N-нитрозодиэтиламина - 102 m/z, рассчитывают средние значения площади пиков N-нитрозодиметиламина и N-нитрозодиэтиламина для каждого градуировочного раствора и проверяют приемлемость результатов параллельных определений площадей пиков.

Выходные сигналы считают приемлемыми при выполнении условия:

S_max - максимальная площадь пика для соответствующего градуировочного раствора, мВ;

S_min - минимальная площадь пика для соответствующего градуировочного раствора, мВ;

r_s - предел повторяемости площади пика градуировочного раствора, r_s = 16%.

Результат проверки признается положительным при выполнении условия (1). Если условие не выполняется, то градуировку прибора проводят повторно.

По средним результатам из 5 серий строят градуировочную характеристику.

Процедуру градуировки проводят 1 раз в 3 месяца, а также при внедрении методики в практику лаборатории, после ремонта хромато-масс-спектрометра, а также при отрицательных результатах контроля стабильности градуировочной характеристики, по п. 9.5.

Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят 1 раз в квартал в анализируемой серии измерений. Образцами для контроля стабильности являются градуировочные растворы, выбранные таким образом, чтобы массовая концентрация N-нитрозаминов соответствовала нижней, верхней границам и середине диапазона построения градуировочной характеристики. Градуировка признается стабильной при выполнении условия:

m_ГХ - расчетное содержание N-нитрозоаминов в градуировочном растворе, нг;

m_ГХm - результат измерения содержания N-нитрозоаминов в образце для градуировки, нг.

При невыполнении условия стабильности градуировочной характеристики эксперимент повторяют с другим градуировочным раствором. При повторном невыполнении условия стабильности градуировочной характеристики выясняют и устраняют причины нестабильности градуировочной характеристики.

Отбор проб сухих детских молочных каш проводят согласно ГОСТ 26809-86. Отбор проб сухой фасованной продукции в потребительской таре производится в количестве 3 единиц фасовки от каждой однородной партии (в начале, середине и конце фасовки). Затем от каждого образца отбирают точечные пробы продукта в одну емкость для получения усредненной пробы для анализа массой около 300 г. Допускается хранение отобранных образцов в морозильной камере при температуре -8... -18 °C от 1 до 3 суток.

Навеску 40 - 50 г продукта помещают в круглодонную колбу объемом 500 см³, соединенную с паровиком и прямым холодильником. К пищевому продукту добавляют высаливающие реагенты (5 г сульфата натрия и 5 г хлорида натрия), 50 - 100 см³ дистиллированной воды, 2,5 см³ 2%-й сульфаминовой кислоты и 0,5 см³ 60%-го раствора серной кислоты до pH = 3; N-нитрозоамины отгоняют с перегретым водяным паром (t <4> = (100 +/- 5) °C и t <5> = (80 +/- 5) °C), собирая 70 см³ дистиллята. Затем дистиллят пропускают через картридж на угольной основе автоматической системы ТФЭ. По истечении 30 мин экстракт хлористого метилена объемом 2 мм² через испаритель вводят в хроматографическую колонку хроматографа и анализируют при условиях по п. 9.2.2.

--------------------------------

<4> Температура парообразователя.

<5> Температура колбы с градуировочным раствором.

Процедуру повторяют аналогично для второго образца и проводят выполнение измерений двух параллельных проб пищевого продукта. Условия выполнения измерений аналогичны условиям при установлении градуировочной характеристики (п. 9.2.2).

11.1 На хроматограмме рассчитывают площадь пика и по градуировочной характеристике определяют содержание N-нитрозоаминов в анализируемом растворе пробы.

Концентрацию C, мкг/г N-нитрозоаминов в пробах пищевого продукта (детские молочные каши) рассчитывают по формуле:

m_ГХ - содержание N-нитрозоаминов, установленное по градуировочной характеристике, нг;

1 000 - коэффициент перевода нг в мкг.

m - навеска пробы молочного продукта, взятая для анализа, г.

11.2. За окончательный результат измерения принимают среднее арифметическое значение двух результатов измерений (C₁, C₂), полученных в условиях повторяемости (параллельных определений), для которых выполняется условие:

r - предел повторяемости. Значения предела повторяемости приведены в табл. 3.

При невыполнении условия (4) получают дополнительно еще два результата измерений. За результат измерений принимают среднее арифметическое четырех результатов измерений, полученных в условиях повторяемости, для которых выполняется условие:

CR_0,95(4) - критический диапазон. Значения критического диапазона приведены в табл. 3.

При невыполнении условия (5) в качестве окончательного результата измерений принимают медиану четырех результатов измерений, полученных в условиях повторяемости (параллельных определений). Дополнительно выявляют и устраняют причины, приводящие к невыполнению условий (4) и (5).

Результат измерений представляют в виде: , мкг/г, где

- результат измерений, полученный в соответствии с процедурами разделов 10, 11, мкг/г;

- характеристика погрешности, мкг/г, при P = 0,95, значение рассчитывают по формуле:

- относительное значение характеристики погрешности измерений концентрации N-нитрозодиметиламина и N-нитрозодиэтиламина, % (табл. 1).

13.1. Обеспечение достоверности измерений в пределах лаборатории организуют и проводят путем проведения проверки приемлемости результатов измерений, получаемых в условиях повторяемости, внутрилабораторной прецизионности, оперативного контроля процедуры измерений и контроля стабильности результатов измерений в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-6-02.

13.2. Проверка приемлемости результатов измерений, получаемых в условиях внутрилабораторной прецизионности.

Образцами для проверки приемлемости результатов измерений, получаемых в условиях внутрилабораторной прецизионности, являются образцы продукта (детские молочные каши) с внесенными в них добавками растворов N-нитрозоаминов, подготовленных в соответствии с п. 9.3.7.

Проверку приемлемости результатов измерений, получаемых в условиях внутрилабораторной прецизионности (в пределах одной лаборатории, разными операторами, в разное время), проводят по результатам измерений массовых концентраций N-нитрозоаминов в образцах продукции с одинаковым содержанием N-нитрозоаминов.

Результаты измерений признают приемлемыми при выполнении условия:

C₁ и C₂ - результаты измерений концентраций N-нитрозоаминов, полученные в условиях внутрилабораторной прецизионности, т.е. в одной лаборатории, в разное время, разными операторами, мкг/г;

R_л - предел внутрилабораторной прецизионности, значения предела внутрилабораторной прецизионности приведены в табл. 3.

Если условие (7) не выполняется, процедуру повторяют. При повторном превышении предела внутрилабораторной прецизионности выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

13.3. Оперативный контроль процедуры измерений с использованием метода добавок

Оперативный контроль процедуры измерений с использованием метода добавок проводят путем сравнения результата отдельно взятой контрольной процедуры K_к с нормативом контроля K.

Результат контрольной процедуры K_к рассчитывают по формуле:

- результат измерений концентрации N-нитрозоаминов в пробе с известной добавкой - среднее арифметическое двух результатов измерений, полученных в условиях повторяемости, расхождение между которыми удовлетворяет условию (4);

- результат измерений концентрации N-нитрозоаминов в исходной пробе - среднее арифметическое двух результатов измерений, полученных в условиях повторяемости, расхождение между которыми удовлетворяет условию (4);

C_д - величина добавки.

В качестве добавки используют растворы N-нитрозоамина, приготовленные по п. 9.3.5.

Норматив контроля K рассчитывают по формуле:

, - значения характеристики погрешности результатов измерений.

Процедуру измерений признают удовлетворительной, при выполнении условия:

При невыполнении условия (10) контрольную процедуру повторяют. При повторном невыполнении условия (10) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

13.4. Оперативный контроль процедуры измерений, а также реализуемые процедуры контроля стабильности результатов выполняемых измерений, приводят в документах лаборатории, устанавливающих порядок и содержание работ по организации методов контроля стабильности результатов измерений в пределах лаборатории.

Примечание. При использовании настоящей методики измерений целесообразно проверить действие ссылочных стандартов на территории Российской Федерации по соответствующему указателю стандартов, составленному на 1 января текущего года, и по соответствующим информационным указателям, опубликованным в текущем году. Если ссылочный документ заменен (изменен), то при пользовании настоящей методикой измерений следует руководствоваться замененным (измененным) стандартом. Если ссылочный документ отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.