"МУК 4.1.3210-14. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств тиенкарбазон-метила в зерне и соломе зерновых колосовых культур методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 30.07.2014)

1. Разработаны Российским государственным аграрным университетом - МСХА им. К.А. Тимирязева, Учебно-научный консультационный центр "Агроэкология пестицидов и агрохимикатов", Минсельхоза России (В.А. Калинин, Е.В. Довгилевич, А.В. Довгилевич, Е.Н. Тестова)

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол N 1 от 26 июня 2014 г.).

3. Утверждены руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 30 июля 2014 г.

4. Введены впервые.

Свидетельство о метрологической аттестации N 01.00282-2008/0192.19.12.13 от 19.12.2013.

Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения уровня остаточных количеств тиенкарбазон-метила в зерне зерновых колосовых культур в диапазоне 0,01 - 0,1 мг/кг и в соломе зерновых колосовых культур в диапазоне 0,05 - 0,5 мг/кг. Методические указания носят рекомендательный характер.

Название действующего вещества по ИСО: тиенкарбазон-метил.

Название действующего вещества по ИЮПАК: 3-тиофенкарбоновая кислота, 4-[[[(4,5-дигидро-3-метокси-4-метил-5-оксо-1H-1,2,4-триазол-1-ил)карбонил]амино]сульфонил]-5-метил, метиловый эфир.

Структурная формула:

Эмпирическая формула: C₁₂H₁₄N₄O₇S₂.

Молекулярная масса: 390,4.

Цвет, запах: химически чистый тиенкарбазон-метил представляет собой белый порошок с легким характерным запахом.

Температура плавления: > 401 °C.

Температура кипения и замерзания: не определена, т.к. разрушается при 140 °C.

Температура вспышки и воспламенения: более 386 °C.

Плотность: 1,51 г/см³ при 20 °C.

Давление паров в мм. рт. ст.:

Коэффициент распределения октанол-вода:

Растворимость в воде: 72 мг/л (при 20 °C, pH 3,9).

Растворимость в органических растворителях (г/дм³ при 20 °C): дихлорметан - 100 - 120, ацетон - 9,54, этилацетат - 2,19, толуен - 0,91, этанол - 0,23, n-гексан - 0,15 x 10^-3.

Краткая токсикологическая характеристика. Тиенкарбазон-метил относится к малоопасным по острой оральной (ЛД₅₀ для крыс более 2 000 мг/кг) и дермальной токсичности (ЛД₅₀ для крыс более 2 000 мг/кг), но к умеренно опасным веществам по ингаляционной токсичности (ЛК₅₀ для крыс (4 ч) более 2 018 мг/м³ воздуха). Тиенкарбазон-метил нефро- и нейротоксичен.

В организме животных тиенкарбазон-метил метаболизируется слабо, в растениях разлагается быстро и полностью. Главными метаболитами в растениях являются BYH 18636-ММТ-глюкозид и BYH 18636-N-десметил. В полевых условиях ДТ₅₀ тиенкарбазон-метила составляет от 3 до 44,6 дня, ДТ₉₀ - от 9,9 до 148 дней. Тиенкарбазон-метил фотолитически стабилен. ДТ₅₀ в воде составляет от 130 до 148 дней.

Область применения. Тиенкарбазон-метил - гербицид системного действия, быстро поглощается листьями и корневой системой сорняков, свободно перемещается по всему растению с нисходящими и восходящими токами питательных веществ. Благодаря системному действию препарат проникает во все части растения, включая "спящие" почки. На биохимическом уровне гербицид воздействует на фермент ацетолактатсинтазу (ALS), участвующий в цепи биосинтеза аминокислот, и нарушает процессы синтеза белков, что вызывает прекращение деления клеток в меристемных тканях сорных растений.

Рекомендуется как довсходовый и послевсходовый гербицид для контроля однолетних и многолетних злаковых и двудольных сорняков на посевах кукурузы. Рекомендуемая норма расхода препарата 0,4 - 0,5 л/га. Способ применения - наземное опрыскивание почвы до всходов культуры (без заделки) или в фазу 2 - 3 листьев культуры.

В России установлены следующие гигиенические нормативы:

ДСД - 0,2 мг/кг массы человека;

ОДК в почве - 0,9 мг/кг;

ПДК в воде водоемов - 0,05 мг/дм³;

ОБУВ в воздухе рабочей зоны - 1,0 мг/м³;

ОБУВ в атмосферном воздухе - 0,02 мг/м³;

МДУ в продукции (мг/кг): кукуруза (зерно, масло) - 0,5.

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций.

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительные интервалы среднего результата для полного диапазона концентраций (n = 20) приведены в табл. 2.

Метод основан на определении тиенкарбазон-метила методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием диодно-матричного детектора после его экстракции из образцов органическим растворителем, очистки экстракта перераспределением между двумя несмешивающимися фазами, на концентрирующих патронах N 1 и на колонках с окисью алюминия.

Идентификация веществ проводится по времени удерживания, а количественное определение - методом абсолютной калибровки.

В предлагаемых условиях анализа метод специфичен. Специфичность обеспечивается подбором состава подвижной фазы и выбором колонок различной полярности.

Примечание. Допускается использование средств измерений с аналогичными или лучшими характеристиками.

Примечание. Допускается использование реактивов иных производителей с аналогичными или лучшими характеристиками.

Примечание. Допускается применение оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ Р 12.1.019-09, а также требования, изложенные в технической документации на газовый хроматограф.

4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 "Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны". Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004-91.

К выполнению измерений и обработке их результатов допускаются специалисты, имеющие опыт работы в химической лаборатории, прошедшие обучение и владеющие техникой проведения анализа, освоившие метод анализа в процессе тренировки и уложившиеся в нормативы контроля при проведении процедуры контроля погрешности анализа.

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C, относительной влажности не более 80% и нормальном атмосферном давлении;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Выполнению измерений предшествуют следующие операции: очистка растворителей (при необходимости), приготовление растворов, кондиционирование хроматографической колонки, подготовка колонок с окисью алюминия, концентрирующих патронов N 1 для очистки экстракта, проверка хроматографического поведения вещества на колонках с окисью алюминия и на концентрирующих патронах N 1, установление градуировочной характеристики.

7.1.1. Очистка ацетонитрила

Ацетонитрил, содержащий воду, предварительно осушают, добавляя в него гранулированный безводный хлористый кальций из расчета не менее 100 г/дм³. Выдерживают его над осушителем в течение 5 - 6 ч. Затем ацетонитрил сливают с осушителя в круглодонную колбу со шлифом объемом 4 000 см³ аппарата для перегонки растворителей.

Ацетонитрил перегоняют при температуре 81,5 °C, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше 81,5 °C, отбрасывают.

7.1.2. Очистка ацетона

Ацетон помещают в круглодонную колбу со шлифом объемом 4 000 см³ от аппарата для перегонки растворителей, добавляют к нему марганцовокислый калий из расчета 1 г/дм³.

Ацетон перегоняют при температуре 56,2 °C, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше 56,2 °C, отбрасывают.

7.1.3. Приготовление бидистиллированной воды

Дистиллированную воду помещают в круглодонную колбу со шлифом объемом 4 000 см³ от аппарата для перегонки растворителей, добавляют к ней марганцовокислый калий из расчета 1 г/дм³ и кипятят в течение 6 ч.

Собирают фракции, отогнанные при температуре 100,0 °C, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше 100,0 °C, отбрасывают.

7.1.4. Очистка хлористого метилена

Хлористый метилен промывают равным объемом 5%-го раствора натрия углекислого (безводного), осушают, добавляя в него гранулированный безводный хлористый кальций из расчета не менее 100 г/дм³. Выдерживают его над осушителем в течение 12 - 24 ч. Затем хлористый метилен сливают с осушителя в круглодонную колбу со шлифом объемом 4 000 см³ аппарата для перегонки растворителей. Хлористый метилен перегоняют при температуре 40,0 °C, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше 40,0 °C, отбрасывают.

7.1.5. Очистка этилацетата

Этилацетат промывают равным объемом 5%-го раствора натрия углекислого (безводного), осушают, добавляя в него гранулированный безводный хлористый кальций из расчета не менее 100 г/дм³. Выдерживают его над осушителем в течение 12 - 24 ч. Затем этилацетат сливают с осушителя в круглодонную колбу со шлифом объемом 4 000 см³ аппарата для перегонки растворителей. Этилацетат перегоняют при температуре 77,1 °C, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше 77,1 °C, отбрасывают.

7.2.1. Приготовление подвижной фазы для ВЭЖХ

Для приготовления подвижной фазы используют свежеперегнанный ацетонитрил, очищенную воду и муравьиную кислоту.

В плоскодонную колбу объемом 1 000 см³ помещают 400 см³ ацетонитрила, 600 см³ очищенной воды и 1 см³ муравьиной кислоты. Смесь тщательно перемешивают, пропускают через нее газообразный гелий со скоростью 20 см³/мин в течение 5 мин, после чего помещают в ультразвуковую ванну для удаления растворенных газов на 1 мин.

7.2.2. Приготовление рабочих растворов

7.2.2.1. Приготовление 6 М раствора соляной кислоты

Мерным цилиндром отбирают 246 см³ концентрированной соляной кислоты и осторожно переносят в мерную колбу на 500 см³, куда предварительно наливают около 100 см³ дистиллированной воды. Затем раствор перемешивают и после охлаждения доводят водой объем в колбе до метки (при приготовлении раствора следует соблюдать осторожность и работать под тягой).

7.2.2.2. Приготовление 1 М раствора гидроокиси натрия

В мерную колбу на 500 см³ переносят 20 г гидроокиси натрия, добавляют 200 - 300 см³ дистиллированной воды. Затем раствор перемешивают и после охлаждения доводят водой объем в колбе до метки (при приготовлении раствора следует соблюдать осторожность и работать под тягой).

7.2.2.3. Приготовление 0,05 М раствора двузамещенного фосфорнокислого калия

В мерную колбу на 500 см³ переносят 5,7 г двузамещенного фосфорнокислого калия и 50 г хлористого натрия, добавляют 200 - 300 см³ бидистиллированной воды, перемешивают до полного растворения солей, проверяют pH полученного раствора. Если pH раствора менее 9, доводят его до указанного значения с помощью 1 М раствора гидроокиси натрия, контролируя pH. После достижения нужного значения pH объем доводят водой до метки.

7.2.3. Приготовление градуировочных растворов

7.2.3.1. Стандартный раствор N 1 с концентрацией тиенкарбазон-метила 1,0 мг/см³

Взвешивают 50 мг тиенкарбазон-метила в мерной колбе объемом 50 см³. Навеску растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки ацетонитрилом. Полученный стандартный раствор N 1 используют для приготовления стандартных растворов для хроматографического исследования и установления градуировочной характеристики. Стандартный раствор N 1 хранится в холодильнике в течение 6 месяцев.

7.2.3.2. Стандартный раствор N 2 с концентрацией тиенкарбазон-метила 10,0 мкг/см³

Из стандартного раствора N 1 отбирают пипеткой 1 см³, помещают в мерную колбу объемом 100 см³ и доводят объем до метки ацетонитрилом. Стандартный раствор N 2 используют для приготовления стандартных растворов для установления градуировочной характеристики. Стандартный раствор N 2 хранится в холодильнике не более 30 суток.

7.2.3.3. Стандартный раствор N 3 с концентрацией тиенкарбазон-метила 1,0 мкг/см³

Из стандартного раствора N 2 отбирают пипеткой 1 см³, помещают в мерную колбу объемом 10 см³ и доводят объем до метки смесью ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 при перемешивании. Стандартный раствор N 3 используют для установления градуировочной характеристики и хранят в холодильнике не более 30 суток.

7.2.3.4. Стандартный раствор N 4 с концентрацией тиенкарбазон-метила 0,5 мкг/см³

Из стандартного раствора N 3 отбирают пипеткой 5 см³, помещают в мерную колбу объемом 10 см³ и доводят объем до метки смесью ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 при перемешивании. Стандартный раствор N 4 используют для установления градуировочной характеристики и хранят в холодильнике не более 30 суток.

7.2.3.5. Стандартный раствор N 5 с концентрацией тиенкарбазон-метила 0,2 мкг/см³

Из стандартного раствора N 2 отбирают пипеткой 1 см³, помещают в мерную колбу объемом 50 см³ и доводят объем до метки смесью ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 при перемешивании. Стандартный раствор N 5 используют для установления градуировочной характеристики и хранят в холодильнике не более 30 суток.

7.2.3.6. Стандартный раствор N 6 с концентрацией тиенкарбазон-метила 0,1 мкг/см³

Из стандартного раствора N 2 отбирают пипеткой 1 см³, помещают в мерную колбу объемом 100 см³ и доводят объем до метки смесью ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 при перемешивании. Стандартный раствор N 6 используют для установления градуировочной характеристики и хранят в холодильнике не более 30 суток.

7.2.3.7. Стандартные растворы тиенкарбазон-метила с концентрацией 2,5; 2,0; 1,0; 0,5; 0,4; 0,25 и 0,2 мкг/см³ для внесения в образцы

Методом последовательного разведения ацетонитрилом стандартного раствора N 2 готовят растворы, содержащие по 2,5; 2,0; 1,0; 0,5; 0,4; 0,25 и 0,2 мкг/см³ и используют эти растворы для внесения в контрольные образцы.

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади (высоты) пика от концентрации тиенкарбазон-метила в растворе (мкг/см³), устанавливают методом абсолютной калибровки по 4 растворам для градуировки с концентрацией 1,0; 0,5; 0,2 и 0,1 мкг/см³.

В инжектор хроматографа вводят по 10 мм³ каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.3. Осуществляют не менее 5-ти параллельных измерений.

7.4.1. Подготовка колонки с окисью алюминия для очистки экстракта

В пластиковую или стеклянную колонку диаметром 15 мм помещают 3 г окиси алюминия с зернением 40/250 меш. и, аккуратно постукивая по стенкам колонки, формируют слой адсорбента. Непосредственно перед использованием колонку промывают 10 см³ ацетонитрила.

7.4.2. Проверка хроматографического поведения тиенкарбазон-метила на колонке с окисью алюминия

В концентратор объемом 100 см³ вносят 1 см³ стандартного раствора тиенкарбазон-метила в ацетонитриле с концентрацией 1,0 мкг/см³ и выпаривают его досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °C. Сухой остаток растворяют в 10 см³ ацетонитрила, тщательно обмывают стенки концентратора и наносят на подготовленную колонку. Элюат собирают в концентратор и выпаривают досуха при температуре не выше 30 °C. Исходную колбу обмывают пятью порциями смеси ацетонитрила с уксусной кислотой в соотношении 99:1 объемом 10 см³ каждая и последовательно вносят их на колонку. Каждую порцию собирают отдельно в концентратор объемом 100 см³ и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °C.

Сухой остаток каждой фракции растворяют в 2 см³ смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 и 20 мм³ пробы вводят в хроматограф.

Определяют фракции, содержащие тиенкарбазон-метил, полноту смывания с колонки и необходимый объем элюата.

Изучение поведения тиенкарбазон-метила на колонке проводят каждый раз при отработке методики или поступлении новой партии окиси алюминия.

7.5.1. Подготовка концентрирующих патронов N 1 для очистки экстракта

Все процедуры происходят с использованием вакуума, скорость потока растворов через патрон не должна превышать 5 см³/мин (1 - 2 кап./с).

Патрон N 1 устанавливают на алонж с отводом для вакуума, сверху в патрон вставляют шприц с разъемом типа Люер объемом не менее 10 см³ (используют как емкость для элюентов).

Кондиционирование: концентрирующий патрон промывают 5 см³ смеси гексана с этилацетатом в соотношении 1:1, затем 10 см³ гексана. Элюаты отбрасывают.

Нельзя допускать высыхания поверхности патрона.

7.5.2. Проверка хроматографического поведения тиенкарбазон-метила на концентрирующих патронах N 1

Из стандартного раствора тиенкарбазон-метила в ацетонитриле, содержащего 1 мкг/см³, отбирают 1 см³, помещают в концентратор объемом 100 см³ и выпаривают на ротационном вакуумном испарителе досуха при температуре не выше 30 °C. Сухой остаток растворяют в 1 см³ этилацетата, тщательно обмывая стенки концентратора, прибавляют 9 см³ гексана, перемешивают и вносят на патрон. Элюат собирают в концентратор, выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °C, сухой остаток растворяют в 2 см³ смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 и 10 мм³ хроматографируют. Исходный концентратор обмывают последовательно 10 см³ смеси гексана с этилацетатом в соотношении 8:2, затем 10 см³ и двумя порциями по 5 см³ смеси гексана с этилацетатом в соотношении 1:1 и последовательно вносят их на патрон.

Элюат после прохождения каждой порции элюентов собирают в отдельные концентраторы объемом по 100 см³, выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °C, сухой остаток растворяют в 2 см³ смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 и 10 мм³ хроматографируют.

Определяют фракции, содержащие тиенкарбазон-метил, полноту смывания с патрона и необходимый объем элюента.

Изучение поведения тиенкарбазон-метила на концентрирующих патронах N 1 проводят каждый раз при отработке методики или поступлении новой партии концентрирующих патронов.

Хроматографическую колонку с предколонкой устанавливают в термостате хроматографа и стабилизируют при температуре 30 °C и скорости потока подвижной фазы 0,5 см³/мин 3 - 4 часа.

Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" N 2051-79 от 21.08.79, а также в соответствии с ГОСТ 13586.3-83 "Зерно. Правила приемки и методы отбора проб", ГОСТ Р ИСО 6497-2011 "Корма растительного происхождения. Методы отбора проб".

Отобранные пробы зерна и соломы подсушивают до стандартной влажности и хранят в бумажных или тканевых мешочках в сухом, хорошо проветриваемом шкафу, недоступном для грызунов.

9.1.1. Экстракция

Образец измельченного зерна пшеницы массой 20 г помещают в полипропиленовую банку для экстракции объемом 250 см³, прибавляют 50 см³ ацетонитрила и помещают на 5 мин в ультразвуковую ванну, а затем на 5 мин на аппарат для встряхивания проб. Экстракт фильтруют в концентратор объемом 250 см³ через фильтр низкой плотности. Экстракцию повторяют еще два раза, используя по 50 см³ ацетонитрила и помещая на 5 мин в ультразвуковую ванну, а затем на 5 мин на аппарат для встряхивания проб. Экстракты объединяют в концентраторе объемом 250 см³ и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °C.

9.1.2. Очистка экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей

К сухому остатку в концентраторе, полученному по п. 9.1.1, прибавляют 5 см³ ацетона, обмывая стенки колбы, затем прибавляют 50 см³ щелочного буфера pH 9, перемешивают и переносят в делительную воронку объемом 250 см³. Полученную водную фракцию промывают двумя порциями хлористого метилена по 30 см³ каждая, встряхивая делительную воронку каждый раз по 2 мин. После полного разделения фаз в делительной воронке нижний слой (хлористый метилен) отбрасывают, а водную фракцию переносят в чистую делительную воронку и доводят pH раствора до значения 3,5 с помощью 6 М соляной кислоты.

Тиенкарбазон-метил экстрагируют тремя порциями хлористого метилена объемом по 20 см³, встряхивая делительную воронку каждый раз по 2 мин. После полного разделения фаз в делительной воронке нижний слой (хлористый метилен) собирают в концентратор объемом 250 см³, пропуская его через слой безводного сульфата натрия, и выпаривают досуха при температуре не выше 30 °C.

9.1.3. Очистка экстракта на концентрирующих патронах N 1

Сухой остаток, полученный по п. 9.1.2, растворяют в 1 см³ этилацетата, тщательно обмывая стенки концентратора, прибавляют 9 см³ гексана, перемешивают и вносят на подготовленный патрон. Элюат отбрасывают. Исходный концентратор обмывают 10 см³ смеси гексана с этилацетатом в соотношении 8:2, элюат также отбрасывают. Тиенкарбазон-метил элюируют 15 см³ смеси гексана с этилацетатом в соотношении 1:1. Элюат собирают в концентратор объемом 100 см³, выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °C.

Сухой остаток растворяют в 2 см³ смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 и 10 мм³ пробы вводят в хроматограф.

9.2.1. Экстракция

Образец измельченной соломы пшеницы массой 5 г помещают в полипропиленовую банку для экстракции объемом 250 см³, прибавляют 75 см³ ацетонитрила и помещают на 5 мин в ультразвуковую ванну, а затем на 5 мин на аппарат для встряхивания проб. Экстракт фильтруют в концентратор объемом 250 см³ через фильтр низкой плотности. Экстракцию повторяют еще два раза, используя по 50 см³ ацетонитрила и помещая на 5 мин в ультразвуковую ванну, а затем на 5 мин на аппарат для встряхивания проб. Экстракты объединяют в концентраторе объемом 250 см³ и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °C.

9.2.2. Очистка экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей

Сухой остаток, полученный по п. 9.2.1, растворяют в 5 см³ ацетона и проводят очистку экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей, как указано в п. 9.1.2.

9.2.3. Очистка экстракта на колонке с окисью алюминия

Сухой остаток, полученный в п. 9.2.2, растворяют в 10 см³ ацетонитрила, тщательно обмывая стенки концентратора, наносят на подготовленную колонку, элюат отбрасывают. Тиенкарбазон-метил элюируют 40 см³ смеси ацетонитрила с уксусной кислотой в соотношении 99:1. Элюат собирают в концентратор объемом 100 см³, выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °C.

Сухой остаток растворяют в 2,5 см³ смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 и 10 мм³ пробы вводят в хроматограф.

Хроматографическая система, включающая:

- хроматограф жидкостный с диодно-матричным детектором, снабженный термостатом для колонок с диапазоном температур от 15 до 80 °C и стандартным автосамплером с дозирующим объемом от 0,1 до 100 мм³ для автоматического ввода пробы в хроматографическую систему;

- компьютерное программное обеспечение, контролирующее работу всего прибора, обеспечивающее сбор и хранение всех хроматограмм в процессе проведения хроматографического анализа, обеспечивающее обработку результатов измерений, вывод и расчет хроматограмм и количественный анализ.

Колонка хроматографическая стальная, длиной 150 мм, с внутренним диаметром 3,9 мм, зернением 5 мкм, заполненная сорбентом с привитыми полярными группами C18.

Предколонка хроматографическая стальная, длиной 12,5 мм, внутренним диаметром 2,1 мм, зернением 5 мкм, заполненная сорбентом с привитыми полярными группами C8.

Температура колонки: 30 °C.

Подвижная фаза: ацетонитрил-вода-муравьиная кислота в соотношении 400:600:1.

Длина волны: 240 нм.

Чувствительность не менее 8 mAU (миллиединиц абсорбции) на шкалу.

Объем вводимой пробы: 10 мм³.

Линейный диапазон детектирования сохраняется в пределах 2 - 20 нг.

Содержание тиенкарбазон-метила в пробах рассчитывают по формуле:

X - содержание тиенкарбазон-метила в пробе, мг/кг;

S_ст - высота (площадь) пика стандарта, мм;

S_пр - высота (площадь) пика образца, мм;

A - концентрация стандартного раствора, мкг/см³;

V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, см³;

m - масса анализируемого образца, г;

P - содержание тиенкарбазон-метила в аналитическом стандарте, %.

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

X₁, X₂ - результаты параллельных определений, мг/кг или мг/дм³;

r - значение предела повторяемости (табл. 1), при этом .

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

Результат анализа представляют в виде:

- среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

- граница абсолютной погрешности, мг/кг;

- граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

В случае если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание вещества в пробе менее 0,01 мг/кг". <*>

--------------------------------

<*> - 0,01 мг/кг - предел обнаружения.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений, а также контроль стабильности градуировочной характеристики осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

13.1. Контроль стабильности градуировочной характеристики

Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

Контроль стабильности градуировочной характеристики для тиенкарбазон-метила проводят при смене основного градуировочного раствора N 1 каждые 6 месяцев, при смене основных градуировочных растворов N 2, 3, 4, 5 и 6 - каждый месяц, а также в начале и при окончании каждой серии анализов.

При контроле стабильности градуировочной характеристики проводят измерения не менее трех образцов концентраций для градуировки, содержание тиенкарбазон-метила в которых должно охватывать весь диапазон концентраций от 0,1 до 1,0 мкг/см³.

Градуировочная характеристика считается стабильной, если для каждого из используемого для контроля градуировочного раствора сохраняется соотношение:

X - концентрация тиенкарбазон-метила контрольного измерения, мкг/см³;

C - известная концентрация градуировочного раствора тиенкарбазон-метила в смеси ацетонитрила с водой, взятая для контроля стабильности градуировочной характеристики, мкг/см³;

4,25 - погрешность градуировочной характеристики, %.

Если величина расхождения (A) превышает 4,25%, делают вывод о невозможности применения градуировочной характеристики для дальнейших измерений. В этом случае выясняют и устраняют причины нестабильности градуировочной характеристики и повторяют контроль ее стабильности с использованием других градуировочных растворов тиенкарбазон-метила, предусмотренных методом выполнения измерений. При повторном обнаружении нестабильности градуировочной характеристики определяют ее заново согласно п. 7.3.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом добавок

Величина добавки C_д должна удовлетворять условию:

- характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой соответственно), мг/кг, при этом:

- граница абсолютной погрешности, мг/кг;

- граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

Результат контроля процедуры К_к рассчитывают по формуле:

, , C_д - среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11), содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце и концентрация добавки, соответственно, мг/кг.

Норматив контроля К рассчитывают по формуле:

Проводят сопоставление результата контроля процедуры (К_к) с нормативом контроля (К).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию:

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):

X₁, X₂ - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;

R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.