"МУК 4.1.3409-16. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств фипронила и его метаболита фипронил-сульфона в зеленой массе, бобах сои, зерне кукурузы, семенах подсолнечника и растительном масле методом капиллярной газожидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 29.12.2016)

1. Разработаны сотрудниками ФГБНУ "Всероссийский НИИ защиты растений" (В.И. Долженко, Ф.И. Копытова) и ООО "Инновационный центр защиты растений" (И.А. Цибульская, Д.А. Плахов), Санкт-Петербург, Пушкин.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 22 декабря 2016 г. N 2).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 29 декабря 2016 г.

4. Введены впервые.

Свидетельство о метрологической аттестации N 01.5.04.229/01.00043/2016.

Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода капиллярной газожидкостной хроматографии для определения массовой концентрации фипронила в бобах сои и семенах подсолнечника в диапазоне концентраций 0,001 - 0,01 мг/кг, в зеленой массе, зерне кукурузы и растительном масле - в диапазоне концентраций 0,005 - 0,05 мг/кг; метаболита фипронил-сульфона в зеленой массе, бобах сои, семенах подсолнечника, зерне кукурузы и растительном масле - в диапазоне концентраций 0,005 - 0,05 мг/кг.

Методические указания носят рекомендательный характер.

1. Фипронил(+/-)-5-амино-1-(2,6-дихлор--трифтор-р-толил)-4-трифторметилсульфинил-пиразол-3-карбонитрил (IUPAC), брутто формула C₁₂H₄Cl₂F₆N₄OS, молекулярная масса 437,2.

2. Фипронил-сульфон(+/-)-5-амино-1-(2,6-дихлор--трифтор-р-толил)-4-ифторметилсульфонил-пиразол-3-карбонитрил (IUPAC), брутто формула C₁₂H₄Cl₂F₆N₄O₂S, молекулярная масса 453,2.

Фипронил представляет собой бесцветные кристаллы с запахом плесени.

Температура плавления 195,5 - 203,0 °C; давление пара при 20 °C 3,7·10^-4 МПа.

Коэффициент распределения н-октанол-вода: K_ow logP = 4,00 (при 20 °C).

Растворимость в воде - 1,9 - 2,4 мг/дм³; в ацетоне - 54,59, дихлорметане - 2,23, этилацетате - 26,49, дихлорметане - 2,23, метаноле - 13,75, в н-гексане - 0,0028 (г/100 см³).

Вещество термически стабильно, не гидролизуется при pH 5 - 7, при pH 9 гидролизуется на 50% в течение 28 дней, не разрушается в присутствии металлов.

В растениях фипронил в результате окисления метаболизируется до фипронил-сульфона.

Краткая токсикологическая характеристика. Острая пероральная токсичность LD₅₀ для крыс - 97 мг/кг, для мышей - 95 мг/кг; острая дермальная токсичность LD₅₀ для крыс > 2 000 мг/кг, для кроликов 354 мг/кг; не оказывает раздражающего действия на кожу и глаза кролика.

Не мутаген, не тератоген, не отражается на репродуктивной функции.

Высокотоксичен для пчел при контактном и кишечном воздействии, безопасен при внесении в почву и обработке семян перед посевом. При обработке почвы проникает в вегетирующие растения кукурузы и подсолнечника не более 5%.

Область применения. Фипронил - инсектицид из группы арилпиразолов, контактного, кишечного и частично системного действия, обладает длительным защитным эффектом. Обладает очень хорошим остаточным последействием после обработки по вегетации, также применяется против почвообитающих вредителей при обработке семян перед посевом.

Гигиенические нормативы для фипронила в России. МДУ в семенах подсолнечника - 0,002 мг/кг, кукурузе - 0,01 мг/кг.

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 - 4.

Методика основана на определении фипронила и фипронил-сульфона методом капиллярной газожидкостной хроматографии с использованием электронно-захватного детектора после экстракции из образцов органическим растворителем, очистки экстракта в системе двух несмешивающихся растворителей и на колонке с флорисилом.

Идентификация фипронила и фипронил-сульфона проводится по времени удерживания, количественное определение - методом абсолютной калибровки.

Избирательность метода обеспечивается сочетанием условий подготовки проб и хроматографирования.

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Примечание. Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией, не требующих дополнительной очистки растворителей.

Примечание. Допускается применение оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-09, а также требования, изложенные в технической документации на газовый хроматограф.

4.2. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией, соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83 и необходимые средства для оказания первой (доврачебной) помощи. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и ГН 2.2.5.2308-07. Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004-90.

4.3. При работе с газами, находящимися в баллонах под давлением до 15 МПа (150 кгс/см²), необходимо соблюдать федеральные нормы и правила в области промышленной безопасности "Правила промышленной безопасности опасных производственных объектов, на которых используется оборудование, работающее под избыточным давлением" (утв. Приказом Ростехнадзора от 25.03.2014 N 116). Запрещается открывать вентиль баллона, не установив на нем понижающий редуктор.

К выполнению измерений допускается специалист, прошедший обучение, освоивший данную методику, владеющий техникой, имеющий опыт работы в химической лаборатории и подтвердивший соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 13.

При выполнении измерений выполняют следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C и относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на газовом хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Перед началом анализа капиллярную колонку кондиционируют в токе азота при температуре термостата колонок 25 °C до стабилизации нулевой линии.

Растворители, используемые для анализа, специальной подготовки не требуют. Рекомендуется проверить чистоту применяемых растворителей. Для этого 100 см³ растворителя испаряют при помощи вакуумного ротационного испарителя при температуре 40 °C до объема 1 см³ и хроматографируют. При обнаружении примесей, которые могут мешать определению, растворители очищают общепринятыми методами.

В нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см и диаметром 10 мм вставляют тампон из стекловаты, закрывают кран и вносят суспензию 5 г флорисила в 10 см³ гексана. Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента и помещают на него слой безводного сульфата натрия высотой 1 см. Колонку промывают 20 см³ смеси гексан-этилацетат (1:1 по объему), после чего она готова к работе.

В круглодонную колбу емкостью 10 см³ отбирают 1 см³ стандартного раствора фипронила или фипронил-сульфона с концентрацией 1 мкг/см³. Отдувают растворитель током теплого воздуха, остаток растворяют в 5 см³ элюента N 1 (смесь гексан-этилацетат = 4:1 по объему) и наносят на подготовленную колонку. Промывают колонку 10 см³ гексана и 5 см³ элюента N 1. Элюат отбрасывают. Затем колонку промывают 50 см³ элюента N 2 (смесь гексан-этилацетат = 1:1 по объему), отбирая фракции по 10 см³. Каждую фракцию упаривают досуха на ротационном испарителе при температуре до 30 °C, растворяют в 2 см³ гексана и анализируют на содержание фипронила или фипронил-сульфона.

Фракции, содержащие фипронил или фипронил-сульфон, объединяют, упаривают досуха, остаток растворяют в 1 см³ гексана и вновь анализируют на содержание искомых веществ. Рассчитывают содержание фипронила или фипронил-сульфона в элюате, определяют полноту вымывания из колонки и номера фракций, где содержится искомое вещество, и необходимый для этого объем элюента.

Примечание. Проверку хроматографического поведения фипронила или фипронил-сульфона следует проводить обязательно, поскольку профиль вымывания может изменяться при использовании новой партии сорбента и растворителей.

7.5.1. Основной раствор с концентрацией 100 мкг/см³: точную навеску фипронила или фипронил-сульфона (10 +/- 0,1) мг помещают в мерную колбу на 100 см³, растворяют в гексане и доводят объем до метки тем же растворителем.

Рабочий раствор для проверки хроматографического поведения фипронила или фипронил-сульфона на колонке с флорисилом и для приготовления градуировочных растворов готовят из основного раствора разбавлением гексаном.

7.5.2. Рабочий раствор с концентрацией фипронила или фипронил-сульфона 1 мкг/см³: в мерную колбу на 100 см³ вносят 1 см³ раствора с концентрацией 100 мкг/см³ и доводят объем до метки гексаном.

7.5.3. Градуировочные растворы с концентрациями 0,1, 0,05, 0,01, 0,005 мкг/см³.

7.5.3.1. Раствор N 1 с концентрацией фипронила или фипронил-сульфона 0,1 мкг/см³: в мерную колбу на 10 см³ помещают 1 см³ рабочего раствора с концентрацией 1 мкг/см³ и доводят объем до метки гексаном.

7.5.3.2. Раствор N 2 с концентрацией фипронила или фипронил-сульфона 0,05 мкг/см³: в мерную колбу на 10 см³ вносят 5 см³ раствора N 1 и доводят объем до метки гексаном.

7.5.3.3. Раствор N 3 с концентрацией фипронила или фипронил-сульфона 0,01 мкг/см³: в мерную колбу на 10 см³ помещают 1 см³ раствора N 1 и доводят объем до метки гексаном.

7.5.3.4. Раствор N 4 с концентрацией фипронила или фипронил-сульфона 0,005 мкг/см³: в мерную колбу на 10 см³ вносят 1 см³ раствора N 2 и доводят объем до метки гексаном.

Основной раствор можно хранить в холодильнике при температуре 0 - 4 °C в течение 6 месяцев, рабочий раствор - не более 2 месяцев, градуировочные растворы N 1 - 4 - не более 7 дней.

Для внесения в образец при определении полноты извлечения используют растворы, приготовленные из основного раствора методом последовательного разбавления по объему гексаном.

Для построения градуировочного графика (площадь пика - концентрация фипронила или фипронил-сульфона в растворе) в хроматограф вводят по 1 мм³ градуировочных растворов (не менее 3 параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4 точек по диапазону измеряемых концентраций). Затем измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации определяемого компонента в градуировочном растворе.

Методом наименьших квадратов рассчитывают градуировочный коэффициент (K) в уравнении линейной регрессии:

S - площадь пика градуировочного раствора.

Градуировку признают удовлетворительной, если значение коэффициента линейной корреляции оказывается не ниже 0,99.

Отбор проб проводится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (N 2051-79 от 21.08.79), отбор проб семян подсолнечника, бобов сои и зерна кукурузы для анализа проводят также в соответствии с ГОСТ 10852-86 "Семена масличные. Правила приемки и методы отбора проб".

Зеленую массу хранят в полиэтиленовой таре в морозильнике при температуре -18 °C до анализа. Семена, бобы и зерно хранят при комнатной температуре в полотняных мешочках, перед анализом доводят до стандартной влажности и измельчают. Растительное масло хранят в холодильнике при температуре 0 - 4 °C в герметично закрытой стеклянной таре в течение 6 месяцев.

9.1.1. Экстракция фипронила и фипронил-сульфона из зеленой массы и первичная очистка экстрактов.

Навеску измельченной зеленой массы (10 +/- 0,1) г вносят в колбу вместимостью 250 см³, добавляют 80 см³ ацетонитрила и помещают в ультразвуковую баню на 15 мин. Полученный экстракт фильтруют через бумажный фильтр средней плотности в колбу-концентратор на 250 см³. Экстракцию повторяют с 50 см³ ацетонитрила. Осадок на фильтре промывают 10 см³ ацетонитрила. Объединенный экстракт помещают в делительную воронку объемом 250 см³, куда добавляют 30 см³ насыщенного раствора хлорида натрия. Воронку встряхивают в течение 2 мин и после разделения слоев нижний водный слой отбрасывают. К ацетонитрильному раствору добавляют 40 см³ гексана и встряхивают воронку в течение 2 мин. Нижний ацетонитрильный слой отбирают, фильтруют через бумажный фильтр средней плотности с 10 г безводного сульфата натрия в концентратор объемом 250 см³, а гексановую фракцию отбрасывают. Объединенный экстракт упаривают досуха на роторном испарителе при температуре не выше 40 °C. Дальнейшую очистку проводят по п. 9.2.

9.1.2. Экстракция фипронила и фипронил-сульфона из семян подсолнечника, бобов сои и зерна кукурузы и первичная очистка экстрактов.

Навеску измельченных семян подсолнечника, бобов сои или зерна кукурузы (10 +/- 0,1) г вносят в колбу вместимостью 250 см³, добавляют 50 см³ ацетонитрила и экстрагируют в ультразвуковой ванне в течение 15 мин. Полученный экстракт фильтруют через бумажный фильтр средней плотности в колбу-концентратор на 250 см³. Экстракцию повторяют дважды. Осадок на фильтре промывают 10 см³ ацетонитрила. Объединенный экстракт упаривают досуха на ротационном испарителе при температуре бани не выше 40 °C. Сухой остаток растворяют в 5 см³ ацетонитрила и добавляют 40 см³ воды, снова фильтруют через бумажный фильтр средней плотности в делительную воронку объемом 250 см³, куда добавляют 15 см³ насыщенного раствора хлорида натрия и 20 см³ гексана. Воронку встряхивают в течение 2 мин и после разделения слоев отбирают нижнюю фракцию, фильтруют через бумажный фильтр средней плотности с 10 г безводного сульфата натрия в концентратор объемом 250 см³. Гексановую фракцию отбрасывают. Промывку ацетонитрильного слоя гексаном (по 20 см³) повторяют дважды. Объединенный ацетонитрильный экстракт упаривают досуха на роторном испарителе при температуре не выше 40 °C. Дальнейшую очистку проводят по п. 9.2.

9.1.3. Экстракция фипронила и фипронил-сульфона из растительного масла и первичная очистка экстракта.

Навеску масла (10 +/- 0,1) г в колбе на 250 см³ растворяют в 50 см³ гексана и экстрагируют определяемые вещества 50 см³ ацетонитрила в ультразвуковой ванне в течение 15 мин. Полученную смесь переносят в делительную воронку объемом 250 см³. В делительной воронке экстрагируют фипронил и фипронил-сульфон трижды порциями по 25 см³ ацетонитрила. Гексановый слой отбрасывают. Объединенный ацетонитрильный экстракт собирают в грушевидную колбу на 250 см³ и упаривают досуха на ротационном испарителе при температуре бани не выше 40 °C. Дальнейшую очистку на колонке проводят по п. 9.2.

Сухой остаток, полученный по п. 9.1.1 - 9.1.3 количественно переносят тремя порциями по 1 см³ элюента N 1 в подготовленную по п. 7.3 стеклянную хроматографическую колонку с флорисилом. Последовательно промывают колонку 20 см³ гексана и 5 см³ элюента N 1 (гексан-этилацетат = 4:1) и 5 см³ элюента N 2 (гексан-этилацетат = 1:1). Элюат отбрасывают. Фипронил и фипронил-сульфон элюируют 20 см³ элюента N 2. Элюат собирают в грушевидную колбу-концентратор и упаривают на роторном испарителе при температуре не выше 40 °C до сухого остатка. Сухой остаток растворяют в 2 см³ гексана и вводят в испаритель хроматографа 1 мм³ полученного раствора.

Газовый хроматограф с электронозахватным детектором. Капиллярная кварцевая колонка длиной 30 м, внутренним диаметром 0,25 мм с толщиной слоя неподвижной фазы (дифенилсилоксан - 35% + диметилсилоксан - 65%) 0,25 мкм. Температура колонки: программирование от 150 °C (1 мин) до 300 °C со скоростью 20 °C/мин. Температура испарителя 250 °C. Температура детектора 340 °C. Расход газа-носителя (азот) - 32 см³/мин с разделением потока 1:20. Хроматографируемый объем 1 мм³.

Время удерживания фипронила (9,1 +/- 0,1) мин, фипронил-сульфона (10,6 +/- 0,1) мин.

Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки. Содержание фипронила или фипронил-сульфона (по отдельности) в пробе (X, мг/кг) вычисляют по формуле:

S_x - площадь пика определяемого компонента на хроматограмме испытуемого образца, мм² (AU);

K - градуировочный коэффициент, найденный на стадии построения соответствующей градуировочной зависимости;

V - объем пробы, подготовленной для хроматографического анализа, см³;

P - навеска анализируемого образца, г;

f - полнота извлечения определяемого компонента, приведенная в табл. 2 и 4, %.

Содержание остаточных количеств фипронила или фипронил-сульфона в образце вычисляют как среднее из двух параллельных определений.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор фипронила или фипронил-сульфона с концентрацией 0,1 мкг/см³, разбавляют гексаном.

Содержание фипронила в пробах (X_ф) вычисляют как сумму концентраций фипронила и его метаболита в пересчете на исходное действующее вещество:

C_ф - содержание фипронила в пробе, мг/кг;

C_ф-с - содержание фипронил-сульфона в пробе, мг/кг.

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости:

X₁, X₂ - результаты параллельных определений, мг/кг;

r - значение предела повторяемости (табл. 1 и 3 раздела "Погрешность измерений"), при этом .

При невыполнении условия выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

Результат анализа представляют в виде:

- среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

- граница абсолютной погрешности, мг/кг:

- граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1 и 3 раздела "Погрешность измерений"), %.

В случае если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание вещества в пробе менее нижней границы определения" (например: менее 0,001 мг/кг, где 0,001 мг/кг - предел количественного определения фипронила в семенах подсолнечника).

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений, а также контроль стабильности градуировочной характеристики осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-02 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

13.1. Градуировочную характеристику необходимо проверять при замене реактивов, хроматографической колонки или элементов хроматографической системы, а также при отрицательном результате контроля градуировочного коэффициента.

Градуировочную зависимость признают стабильной при выполнении следующего условия:

C - аттестованное значение массовой концентрации определяемого компонента в градуировочном растворе;

C_K - результат контрольного измерения массовой концентрации определяемого компонента в градуировочном растворе;

- норматив контроля градуировочного коэффициента, % ( при P = 0,95).

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.

Величина добавки C_д должна удовлетворять условию:

- характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой соответственно), мг/кг, при этом:

- граница абсолютной погрешности, мг/кг:

- граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1 и 3), %.

Результат контроля процедуры K_к рассчитывают по формуле:

, , C_д - среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки соответственно, мг/кг.

Норматив контроля K рассчитывают по формуле:

Проводят сопоставление результата контроля процедуры (K_к) с нормативом контроля (K).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры к их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):

X₁, X₂ - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;

R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1 и 3 раздела "Погрешность измерений"), %.