"МУК 4.1.3444-17. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств тиаметоксама и его метаболита клотианидина в бананах, цитрусовых, чае и кофе-бобах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 13.03.2017)

1. Разработаны ФБУН "Федеральный научный центр гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана Роспотребнадзора (В.Н. Ракитский, Н.Е. Федорова, В.В. Баюшева, Ж.А. Чистова).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 22 декабря 2016 г. N 2).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 13 марта 2017 г.

4. Введены впервые.

Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения в бананах, цитрусовых, чае и кофе-бобах массовой концентрации тиаметоксама и его метаболита клотианидина в диапазонах 0,01 - 0,1 мг/кг, 0,01 - 0,1 мг/кг, 0,05 - 0,5 мг/кг и 0,02 - 0,2 мг/кг соответственно.

Методические указания носят рекомендательный характер.

Тиаметоксам

3-(2-хлор-1,3-тиазол-5-илметил)-5-метил-[1,3,5]оксадиазинан-4-илиден-N-нитроамин (ИЮПАК)

C₈H₁₀ClN₅O₃S

Молекулярная масса: 291,7.

Белый кристаллический порошок без запаха. Температура плавления 139,1 °C. Давление паров 6,6 x 10^-6 МПа (при 25 °C). Коэффициент распределения н-октанол/вода: K_OW log P = -0,13. Растворимость в органических растворителях при 25 °C (в г/дм³): ацетонитрил - 78; ацетон - 42,5; дихлорметан - 43; метанол - 10,2; этилацетат - 5,7; толуол - 0,6. Растворимость в воде при 20 °C: 4,1 г/дм³. Стабилен к гидролизу при температуре 20 °C при pH от 1 до 7; DT₅₀ при pH 9 - 11,5 дней.

В присутствии света в водных фотолитических условиях тиаметоксам быстро деградирует с периодом полураспада 2, 3 дня.

Краткая токсикологическая характеристика. Острая пероральная токсичность (LD₅₀) для крыс - 1 560 мг/кг; острая дермальная токсичность (LD₅₀) для крыс - более 2 000 мг/кг; острая ингаляционная токсичность (LC₅₀) для крыс - более 3 720 мг/м³ воздуха.

Основным продуктом метаболитической деградации тиаметоксама в растительной продукции является клотианидин.

Клотианидин

(Е)-1-(2-хлор-1,3-тиазол-5-илметил)-3-метил-2-нитрогуанидин (ИЮПАК)

C₆H₈ClN₅O₂S

Молекулярная масса: 249,7.

Светло-кремовый порошок без запаха. Температура плавления 176,8 °C. Давление паров 2,8 x 10^-8 МПа (при 25 °C). Коэффициент распределения н-октанол/вода: K_OW log P = 0,905. Растворимость в органических растворителях при 25 °C (в г/дм³): ацетон - 15,2; этилацетат - 2,03; ксилол - 0,0128. Растворимость в воде при 20 °C: 0,34 г/дм³. Стабилен к гидролизу при pH 5, 7, 9 (при 20 °C).

Краткая токсикологическая характеристика. Острая пероральная токсичность (LD₅₀) для крыс - более 5 000 мг/кг; острая дермальная токсичность (LD₅₀) для крыс - более 2 000 мг/кг; острая ингаляционная токсичность (LD₅₀) для крыс - более 6 141 мг/м³.

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций.

Полнота извлечения веществ, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для всего диапазона измерений (n = 20) приведены в табл. 2.

Методика основана на определении веществ с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на обращенной фазе с тройным квадрупольным масс-спектрометрическим детектором.

Экстракцию веществ из анализируемых проб выполняют ацетонитрилом с использованием смеси солей для экстракции (смесь сульфата магния и хлорида натрия), очистку экстрактов проводят методом дисперсионной твердофазной экстракции с применением смеси сорбентов на основе амина, октадецилсилана и графитизированной сажи.

Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки.

Нижний предел измерения тиаметоксама или его метаболита клотианидина в анализируемом объеме пробы - 0,02 нг.

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Примечание. Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией, не требующих дополнительной очистки растворителей.

Примечание. Допускается использование вспомогательных устройств и материалов с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ Р 12.1.019-09, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф.

4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и ГН 2.2.5.2308-07. Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004-90.

4.3. При работе с газами, находящимися в баллонах под давлением до 15 МПа (150 кгс/см²), необходимо соблюдать Федеральные нормы и правила в области промышленной безопасности "Правила промышленной безопасности опасных производственных объектов, на которых используется оборудование, работающее под избыточным давлением" (утв. Приказом Ростехнадзора от 25.03.2014 N 116). Запрещается открывать вентиль баллона, не установив на нем понижающий редуктор.

Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист, имеющий опыт работы на жидкостном хроматографе, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений.

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C и относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Измерениям предшествуют следующие операции: очистка ацетонитрила (при необходимости), приготовление растворов, градуировочных растворов, растворов внесения, смесей солей для экстракции и сорбентов для очистки экстрактов, подвижной фазы для ВЭЖХ, кондиционирование хроматографической колонки, установление градуировочных характеристик.

Ацетонитрил кипятят с обратным холодильником над пентоксидом фосфора (на 1 дм³ ацетонитрила 20 г пентоксида фосфора) не менее 1 часа, после чего перегоняют, непосредственно перед употреблением ацетонитрил повторно перегоняют над прокаленным карбонатом калия (на 1 дм³ ацетонитрила 10 г карбоната калия).

Компонент А: раствор 0,05% (по весу) формиата аммония + 0,01% (по объему) муравьиной кислоты в воде.

В мерную колбу вместимостью 1 000 см³ помещают 0,5 г формиата аммония, растворяют в 300 - 400 см³ бидистиллированной воды, вносят 0,1 см³ муравьиной кислоты, доводят до метки водой, перемешивают.

Компонент Б: раствор 0,01% (по объему) муравьиной кислоты в метаноле.

В мерную колбу вместимостью 1 000 см³ помещают 500 см³ метанола, вносят 0,1 см³ муравьиной кислоты, доводят до метки деионизированной водой, перемешивают.

Растворы компонентов подвижной фазы хранят в темном месте (в емкости из темного стекла) не более 14 дней.

Промывают колонку подвижной фазой (смесь компонентов А и Б, приготовленных по п. 7.2, в соотношении 1:1) при скорости подачи растворителя 0,4 см³/мин до установления стабильной базовой линии.

В мерную колбу вместимостью 1 000 см³ помещают 300 - 400 см³ ацетонитрила, вносят 10 см³ ледяной уксусной кислоты, перемешивают, доводят ацетонитрилом до метки, вновь перемешивают. Раствор хранят в темном месте (в емкости из темного стекла) не более 14 дней.

7.5.1. Исходный раствор тиаметоксама для градуировки (концентрация 100 мкг/см³). В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают (0,0100 +/- 0,0001) г тиаметоксама, добавляют 50 - 70 см³ ацетонитрила, перемешивают, доводят ацетонитрилом до метки, вновь перемешивают.

Раствор хранят в холодильнике при температуре (4 +/- 2) °C в течение 6 месяцев.

7.5.2. Исходный раствор клотианидина для градуировки (концентрация 100 мкг/см³). В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают (0,0100 +/- 0,0001) г клотианидина, добавляют 50 - 70 см³ ацетонитрила, перемешивают, доводят ацетонитрилом до метки, вновь перемешивают.

Раствор хранят в холодильнике при температуре (4 +/- 2) °C в течение 6 месяцев.

Растворы N 1 - 6 готовят объемным методом путем последовательного разбавления исходных растворов для градуировки.

7.5.3. Растворы N 1 тиаметоксама или клотианидина для градуировки и внесения (концентрация 10 мкг/см³). В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 10 см³ исходного раствора тиаметоксама (п. 7.5.1) или клотианидина (п. 7.5.2) с концентрацией 100 мкг/см³, разбавляют ацетонитрилом до метки, перемешивают.

Раствор N 1 хранят в холодильнике при температуре (4 +/- 2) °C в течение 6 месяцев.

7.5.4. Раствор N 2 тиаметоксама и клотианидина для градуировки и внесения (концентрация каждого вещества 1 мкг/см³). В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают по 10,0 см³ градуировочных растворов N 1 с концентрацией тиаметоксама и клотианидина 10,0 мкг/см³ (п. 7.5.3), доводят до метки ацетонитрилом, тщательно перемешивают, получают рабочий раствор N 2 с концентрацией тиаметоксама и клотианидина 1 мкг/см³.

Раствор N 2 хранят в холодильнике при температуре (4 +/- 2) °C в течение одного месяца.

7.5.5. Рабочие растворы N 3 - 6 тиаметоксама и клотианидина для градуировки (концентрация каждого вещества по 0,01 - 0,1 мкг/см³). В 4 мерные колбы вместимостью 100 см³ помещают по 10,0; 5,0; 2,0; 1,0 см³ градуировочного раствора N 2 с концентрацией тиаметоксама и клотианидина 1 мкг/см³ (п. 7.5.4), доводят до метки раствором, приготовленным по п. 7.4, тщательно перемешивают, получают рабочие растворы N 3 - 6 с концентрацией тиаметоксама и клотианидина 0,1; 0,05; 0,02; 0,01 мкг/см³ соответственно.

Растворы хранят в холодильнике при температуре (4 +/- 2) °C в течение одной недели.

Для приготовления одного набора смеси солей для экстракции смешивают (4 +/- 0,01) г магния сернокислого и (1 +/- 0,01) г натрия хлористого, до использования хранят в герметичной упаковке (не более 6 месяцев).

Примечание. Возможно использование других наборов солей для экстракции проб фруктов и овощей массой 10 г.

Для приготовления одного набора смеси сорбентов для очистки экстрактов в центрифужную полипропиленовую пробирку вместимостью 2 см³ помещают (50 +/- 4) мг сорбента для твердофазной экстракции на основе первичного-вторичного амина, (50 +/- 4) мг графитизированной сажи, (150 +/- 4) мг магния сернокислого и (50 +/- 4) мг твердофазного сорбента на основе октадецилсилана, закрывают герметично крышкой, встряхивают для перемешивания, хранят не более 6 месяцев.

Примечание. Возможно использование дисперсионных наборов для фруктов и овощей с маслом и пигментами, помещенных в полипропиленовые пробирки вместимостью 2 см³.

Градуировочные характеристики, выражающие зависимость площади пика (I) от концентрации тиаметоксама и клотианидина в растворе (мкг/см³), устанавливают методом абсолютной калибровки по 4 растворам для градуировки.

В инжектор хроматографа вводят по 2 мм³ каждого градуировочного раствора, приготовленного по п. 7.5.5, и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.3. Осуществляют не менее 5 параллельных измерений. Устанавливают площади пиков веществ, на основании которых строят градуировочные зависимости.

Отбор проб осуществляют в соответствии с ГОСТ Р 51603-2000 "Бананы свежие. Технические условия"; ГОСТ Р 53596-09 "Плоды цитрусовых культур для употребления в свежем виде. Технические условия"; ГОСТ 32573-13 "Чай черный. Технические условия"; ГОСТ ИСО 4072-15 "Кофе зеленый в мешках. Отбор проб" и "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (N 2051-79 от 21.08.79).

Пробы бананов, цитрусовых, чая и кофе-бобов хранят при температуре (4 +/- 2) °C не более недели. Для длительного хранения образцы замораживают и хранят при температуре не выше -18 °C.

Перед анализом образцы измельчают.

Образец измельченных плодов бананов, цитрусовых массой 10 г, кофе-бобов массой 5 г, чая массой 2 г помещают в центрифужную полипропиленовую пробирку, вместимостью 50 см³. В пробирки с пробой кофе-бобов и чая вносят по 10 см³ бидистиллированной воды, перемешивают, оставляют на 5 мин.

Затем в пробирки с пробами бананов, кофе-бобов и чая вносят 10 см³ 1%-го раствора уксусной кислоты в ацетонитриле, с пробой цитрусовых - 10 см³ ацетонитрила, помещают в пробирку керамический гомогенизатор, закрывают крышку и интенсивно встряхивают вручную 30 с, вносят в пробирку смесь солей для экстракции (приготовленную по п. 7.6), закрывают крышкой и интенсивно встряхивают (вручную) в течение 1 мин. Затем пробу центрифугируют в течение 5 мин при скорости вращения 4 000 об./мин и подвергают очистке с применением дисперсионной твердофазной экстракции по п. 9.2.

Аликвоту экстракта (верхний слой в пробирке после центрифугирования) объемом 1,5 - 1,8 см³ с помощью пипетки переносят в пропиленовую центрифужную пробирку, содержащую смесь сорбентов, приготовленную по п. 7.7, закрывают крышку и интенсивно встряхивают вручную в течение 30 с. Центрифугируют 15 мин при скорости вращения 4 000 об./мин. Отбирают с помощью медицинского шприца раствор, фильтруют через мембранный фильтр (размер пор 0,22 мкм) в виалу вместимостью 2 см³ с фторопластовой прокладкой и навинчивающейся крышкой. Помещают в автосамплер хроматографа для анализа в условиях хроматографирования по п. 9.3.

Измерения выполняют при следующих режимных параметрах.

Жидкостный хроматограф с тандемным масс-спектрометрическим детектором: тройной квадруполь с источником ионизации, оснащенным соосной подачей горячего азота для эффективной десольвации ионов.

Источник ионизации: электростатическое распыление.

Режим работы: регистрация дочерних положительных ионов после разрушения материнских ионов (регистрация "перехода").

Тиаметоксам

Материнский ион (масса/заряд): 292,2.

Дочерние ионы (масса/заряд): 211,0 (количественный расчет), 181,0.

Напряжение на фрагментаторе, В: 85.

Энергия разрушения (соударения), В: 4 (292,2 -> 211,0), 16 (292,2 -> 181,0).

Клотианидин

Материнский ион (масса/заряд): 250,0.

Дочерние ионы (масса/заряд): 169,1 (количественный расчет), 132,1.

Напряжение на фрагментаторе, В: 90.

Энергия разрушения (соударения), В: 7 (250,0 -> 169,1), 15 (250,0 -> 132,1).

Скорость сканирования: 200 мс.

Давление на распылителе: 35 psi.

Скорость осушающего газа 1 (азот): 10 дм³/мин.

Температура газа 1: 250 °C.

Скорость газа 2 (азот): 11 дм³/мин.

Температура газа 2: 340 °C.

Напряжение на капилляре: 4 500 В.

Температура квадруполей (1 и 3): 100 °C.

Хроматографическая колонка стальная длиной 150 мм, внутренним диаметром 2,1 мм, заполненная обращенно-фазовым сорбентом с привитыми монофункциональными полярными группами C18, зернением 1,8 мкм.

Температура колонки: 45 °C.

Скорость потока элюента: 0,4 см³/мин.

Объем вводимой пробы: 2 мм³.

Подвижная фаза: компонент А - раствор 0,05% (по весу) формиата аммония + 0,01% (по объему) муравьиной кислоты в воде; компонент Б - раствор 0,01% (по объему) муравьиной кислоты в метаноле.

Режим элюирования (градиентный), пробег 10 мин (табл. 3), промывка колонки после анализа 10 мин.

Линейный диапазон детектирования 0,02 - 0,2 нг.

Образцы, дающие пики большие, чем градуировочный раствор с концентрацией 0,1 мкг/см³, разбавляют ацетонитрилом, содержащим 1% уксусной кислоты (не более чем в 50 раз).

Содержание тиаметоксама с учетом его метаболита клотианидина (в эквиваленте действующего вещества) в пробах бананов, цитрусовых, чае и кофе-бобах (X, мг/кг) рассчитывают по формуле:

где A - концентрация тиаметоксама или клотианидина, найденная по градуировочным графикам в соответствии с величинами площадей хроматографических пиков, мкг/см³;

V - объем экстракта (10 см³);

m - масса анализируемого образца, г.

При необходимости представления содержания тиаметоксама с учетом его метаболита в эквиваленте действующего вещества рассчитанное содержание клотианидина умножается на коэффициент пересчета по соотношению молекулярных масс (равен 1,17) и суммируется с содержанием тиаметоксама.

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости:

где X₁, X₂ - результаты параллельных определений, мг/кг;

r - значение предела повторяемости (табл. 1), при этом .

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

Результат анализа представляют в виде:

где - среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

- граница абсолютной погрешности, мг/кг:

где - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

Если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание тиаметоксама или клотианидина в пробе бананов и цитрусовых - менее 0,01 мг/кг; в пробе чая - менее 0,05 мг/кг; в пробе кофе-бобов - менее 0,02 мг/кг".

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-02 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

13.1. Контроль стабильности градуировочной характеристики.

Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят в начале и по окончании каждой серии анализов.

При контроле стабильности градуировочной характеристики проводят измерения не менее двух образцов концентраций для градуировки, содержание тиаметоксама и клотианидина в которых должно охватывать весь диапазон концентраций от 0,01 до 0,1 мкг/см³.

Градуировочная характеристика считается стабильной, если для каждого из используемого для контроля градуировочного раствора сохраняется соотношение:

где X - концентрация тиаметоксама или клотианидина в пробе при контрольном измерении, мкг/см³;

C - известная концентрация градуировочного раствора тиаметоксама или клотианидина, взятая для контроля стабильности градуировочной характеристики, мкг/см³;

B - норматив контроля погрешности градуировочной характеристики, % (равен 10% при P = 0,95).

Если величина расхождения (A) превышает 10%, делают вывод о невозможности применения градуировочной характеристики для дальнейших измерений. В этом случае выясняют и устраняют причины нестабильности градуировочной характеристики и повторяют контроль ее стабильности с использованием других градуировочных растворов тиаметоксама и клотианидина, предусмотренных МИ. При повторном обнаружении нестабильности градуировочной характеристики устанавливают ее заново согласно п. 7.8.

Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом добавок.

Величина добавки C_д должна удовлетворять условию:

где - характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой соответственно), мг/кг, при этом:

где - граница абсолютной погрешности, мг/кг:

где - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

Результат контроля процедуры K_к рассчитывают по формуле:

где , , C_д - среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки соответственно, мг/кг.

Норматив контроля K рассчитывают по формуле:

Проводят сопоставление результата контроля процедуры (K_к) с нормативом контроля (K).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), не должно превышать предела воспроизводимости (R):

где X₁, X₂ - результаты измерений, выполненных в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), мг/кг;

R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.