"МУК 4.1.3235-14. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств дифлуфензопира в воде, почве, зеленой массе, зерне и масле кукурузы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 22.12.2014)

1. Разработаны сотрудниками ФГБНУ "Всероссийский научно-исследовательский институт защиты растений" (В.И. Долженко, И.А. Цибульская, Т.Д. Черменская, А.С. Комарова, В.В. Человечкова).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 6 ноября 2014 г. N 2).

3. Утверждены руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 22 декабря 2014 г.

4. Введены впервые.

Свидетельство о метрологической аттестации N 01.5.04.183/01.00043/2014.

Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения массовой концентрации дифлуфензопира в диапазоне концентраций в воде 0,001 - 0,01 мг/дм³, в почве, зерне и масле кукурузы 0,01 - 0,1 мг/кг, зеленой массе 0,05 - 0,5 мг/кг.

Методические указания носят рекомендательный характер.

Дифлуфензопир

2-{(EZ)-1-[4-(3,5-difluorophenyl)semicarbazono]ethyl}nicotinic acid (ИЮПАК).

Структурная формула:

Брутто формула: C₁₅H₁₂F₂N₄O₃.

Молекулярная масса: 334,28.

Химически чистое вещество представляет собой белое кристаллическое вещество.

Температура плавления: 135 °C.

Давление пара при 25 °C: 0,01 МПа.

Растворимость в воде: 5 850 мг/дм³ (при 20 °C).

Константа диссоциации (рКа) при 25 °C: 3,18 (слабая кислота).

Стабильность к гидролизу при 20 °C: DT₅₀ = 13 дней (pH 5), 24 дня (pH 7), 26 дней (pH 9). Период полураспада в почве: DT₅₀ = 14 дней.

Краткая токсикологическая характеристика. Острая пероральная токсичность LD₅₀ для млекопитающих более 5 000 мг/кг, острая дермальная токсичность LD₅₀ для млекопитающих превышает 5 000 мг/кг. Оказывает раздражающее действие на слизистую глаз. Умеренно токсичен для пчел.

Область применения препарата: системный гербицид для борьбы с широким спектром сорняков в послевсходовый период.

Механизм действия: ингибирование транспорта ауксина.

Гигиенические нормативы для дифлуфензопира в России не установлены.

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1, для соответствующих диапазонов концентраций.

Методика основана на определении дифлуфензопира методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием ультрафиолетового (УФ) детектора после его концентрирования из образцов воды на патроне с гидрофобным сорбентом с привитыми гексадецильными группами и извлечения из образцов почвы, зеленой массы, зерна и масла кукурузы щелочным водным ацетоном с последующей очисткой в системе несмешивающихся растворителей и на патронах для твердофазной экстракции.

Идентификация дифлуфензопира проводится по времени удерживания, количественное определение - методом абсолютной калибровки.

Избирательность метода обеспечивается сочетанием условий подготовки проб и хроматографирования.

Примечание. Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией, не требующих дополнительной очистки растворителей.

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-09, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф.

4.2. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией, соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и ГН 2.2.5.2308-07.

Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004-90.

Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист-химик, имеющий опыт работы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, ознакомленный с руководством по эксплуатации хроматографа, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 13.

При выполнении измерений выполняют следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C и относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Перед началом анализа аналитическую колонку кондиционируют в потоке подвижной фазы (0,1 - 0,2 см³/мин) до стабилизации нулевой линии.

Патрон промывают 2 см³ смеси N 2, затем 3 см³ этилацетата.

Патрон последовательно промывают 2 см³ этилацетата, 2 см³ метанола, 3 см³ смеси N 3.

7.4.1. 0,005 М раствор ортофосфорной кислоты: (0,5 +/- 0,01) г 98% ортофосфорной кислоты помещают в мерную колбу объемом 1 дм³, растворяют в бидистиллированной воде и доводят объем до метки.

7.4.2. Для приготовления подвижной фазы смешивают ацетонитрил с 0,005 М раствором ортофосфорной кислоты в соотношении 30:70 по объему, используя мерные цилиндры.

7.4.3. 0,1 N раствор соляной кислоты: 1 см³ концентрированной соляной кислоты помещают в мерную колбу объемом 100 см³, растворяют в бидистиллированной воде и доводят объем до метки.

7.4.4. 0,5% раствор натрия углекислого кислого: 0,5 г натрия углекислого кислого помещают в мерную колбу объемом 100 см³, растворяют в бидистиллированной воде и доводят объем до метки.

7.5.1. Основной раствор с концентрацией 0,5 мг/см³: точную навеску дифлуфензопира (50 +/- 0,5 мг) помещают в мерную колбу вместимостью 100 см³, растворяют в метаноле и доводят объем до метки метанолом.

Градуировочные растворы с концентрациями дифлуфензопира 0,05, 0,1, 0,2, 0,5 и 1,0 мкг/см³ готовят методом последовательного разбавления по объему, используя раствор подвижной фазы (смесь ацетонитрила и 0,005 М ортофосфорной кислоты в соотношении 30:70).

7.5.2.1. Раствор N 1 с концентрацией 1,0 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 100 см³ вносят 0,2 см³ основного раствора и доводят до метки подвижной фазой.

7.5.2.2. Раствор N 2 с концентрацией 0,5 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 5,0 см³ раствора N 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.5.2.3. Раствор N 3 с концентрацией 0,2 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 2 см³ раствора N 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.5.2.4. Раствор N 4 с концентрацией 0,1 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 1 см³ раствора N 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.5.2.5. Раствор N 5 с концентрацией 0,05 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 0,5 см³ раствора N 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

Основной раствор можно хранить в холодильнике при температуре 0 - 4 °C в течение 5 дней, градуировочные растворы использовать в день приготовления.

При изучении полноты определения дифлуфензопира используют ацетоновые растворы вещества, приготовленные из основного раствора методом последовательного разбавления по объему ацетоном.

Для установления градуировочной характеристики (площадь пика - концентрация дифлуфензопира в растворе) в хроматограф вводят по 10 мм³ градуировочных растворов (не менее 3 параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4 точек по диапазону измеряемых концентраций). Затем измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации дифлуфензопира в градуировочном растворе.

Методом наименьших квадратов рассчитывают градуировочный коэффициент (K) в уравнении линейной регрессии:

где S - площадь пика градуировочного раствора.

Градуировку признают удовлетворительной, если значение коэффициента линейной корреляции оказывается не ниже 0,99.

Градуировочную характеристику необходимо проверять при замене реактивов, хроматографической колонки или элементов хроматографической системы, а также при отрицательном результате контроля градуировочного коэффициента.

Градуировочную зависимость признают стабильной при выполнении следующего условия:

где C - аттестованное значение массовой концентрации дифлуфензопира в градуировочном растворе;

C_K - результат контрольного измерения массовой концентрации дифлуфензопира в градуировочном растворе;

- норматив контроля градуировочного коэффициента, %. ( при P = 0,95).

В круглодонную колбу емкостью 10 см³ отбирают 1 см³ стандартного раствора дифлуфензопира с концентрацией 1 мкг/см³. Отдувают растворитель током азота. Остаток растворяют в 1 см³ этилацетата и переносят на подготовленный патрон (п. 7.2). Колбу обмывают 1 см³ этилацетата и смыв тоже переносят на патрон. Промывают патрон 10 см³ смеси N 1, элюат отбрасывают. Затем элюируют дифлуфензопир смесью N 2 со скоростью 1 - 2 капли в секунду. Отбирают фракции по 2 см³, упаривают досуха, растворяют в 1 см³ подвижной фазы и анализируют по п. 9.6.

Фракции, содержащие дифлуфензопир, объединяют и вновь анализируют.

Устанавливают уровень вещества в элюате, определяют полноту вымывания с патрона и необходимый для очистки объем элюата.

В круглодонную колбу емкостью 10 см³ отбирают 1 см³ стандартного раствора дифлуфензопира с концентрацией 1 мкг/см³. Отдувают растворитель током азота. Остаток растворяют в 10 см³ смеси N 3 и переносят на подготовленный патрон (п. 7.3). Колбу обмывают 5 см³ смеси N 3 и смыв тоже переносят на патрон. Патрон просушивают в течение 2 мин, затем элюируют дифлуфензопир порциями этилацетата по 2 см³ со скоростью 1 - 2 капли в секунду. Отбирают фракции, упаривают досуха, растворяют в 1 см³ подвижной фазы и анализируют по п. 9.6.

Фракции, содержащие дифлуфензопир, объединяют и вновь анализируют.

Устанавливают уровень вещества в элюате, определяют полноту вымывания с патрона и необходимый для очистки объем элюата.

Примечание. Проверку хроматографического поведения дифлуфензопира следует проводить обязательно, поскольку профиль вымывания может изменяться при использовании новой партии патронов и растворителей.

Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (N 2051-79 от 21.08.79), а также в соответствии с ГОСТ Р 51592-2000 "Вода. Общие требования к отбору проб"; ГОСТ 28168-89 "Почвы. Отбор проб"; ГОСТ 13634-90 "Кукуруза. Требования при заготовках и поставках" и ГОСТ 8808-91 "Масло кукурузное. ТУ".

Зерно кукурузы хранят в полотняных мешочках при комнатной температуре. Для исследовательских целей допускается получение масла в лаборатории из проб измельченного зерна методом экстракции органическим растворителем при температуре не выше 40 °C. Пробы масла хранят при 4 - 6 °C в закрытой стеклянной или полиэтиленовой таре не более 30 суток.

Для длительного хранения пробы почвы подсушиваются при комнатной температуре в отсутствие прямого солнечного света. Сухие почвенные образцы могут храниться в течение года. Перед анализом сухую почву доводят до стандартной влажности, просеивают через сито с отверстиями диаметром 1 мм.

Зеленую массу для хранения помещают в герметичной полиэтиленовой упаковке в морозильную камеру с температурой -18 °C.

К 50 см³ воды добавляют 0,25 см³ трифторуксусной кислоты и наносят на подготовленный по п. 7.3 патрон N 2. Патрон просушивают 2 мин, затем элюируют дифлуфензопир тремя порциями этилацетата по 2 см³. Растворитель упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 40 °C. Сухой остаток растворяют в 1 см³ подвижной фазы и 10 мм³ вводят в хроматограф.

Навеску измельченной пробы (10 +/- 0,1) г, зеленой массы 5 г помещают в полипропиленовую центрифужную пробирку вместимостью 50 см³, добавляют 10 см³ 0,5%-го раствора натрия углекислого кислого и 30 см³ ацетона. Пробирку плотно закрывают и помещают в перемешивающее устройство на 10 мин, затем центрифугируют. Надосадочную жидкость декантируют в круглодонную колбу. Экстракцию повторяют 5 см³ 0,5%-го раствора натрия углекислого кислого и 15 см³ ацетона. Объединенные фракции упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 40 °C до водного остатка. Остаток доводят до 50 см³ 0,5%-м раствором натрия углекислого кислого, переносят в делительную воронку и очищают по п. 9.4.

К навеске масла (10 +/- 0,1) г добавляют 10 см³ гексана и переносят в делительную воронку. Дифлуфензопир дважды экстрагируют порциями 0,5%-го раствора натрия углекислого кислого по 25 см³. Объединенные щелочные экстракты очищают по п. 9.4.

Щелочной экстракт последовательно промывают двумя порциями по 10 см³ гексана и двумя порциями по 10 см³ хлористого метилена. В случае плохого разделения слоев можно перенести эмульсию в центрифужную пробирку и центрифугировать в течение 5 мин при скорости 4 000 об./мин. Водный слой подкисляют 0,1 N соляной кислотой до pH = 1 и дифлуфензопир экстрагируют двумя порциями по 30 см³ хлористого метилена. Метиленовые фракции собирают в круглодонную колбу, пропуская через слой безводного сульфата натрия, и растворитель упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 40 °C. Сухой остаток подвергают очистке на патроне N 1 по п. 9.5.

Сухой остаток, полученный по п. 9.4, растворяют в 1 см³ этилацетата, наносят на предварительно кондиционированный патрон (п. 7.2), колбу ополаскивают 1 см³ этилацетата и также наносят на патрон. Патрон промывают 10 см³ смеси N 1, элюат отбрасывают. Дифлуфензопир элюируют 5 см³ смеси N 2, элюат собирают, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе, остаток растворяют в 1 см³ подвижной фазы и 10 мм³ вводят в хроматограф.

Примечание. Ввиду нестабильности аналита хранение экстрактов подготовленных проб не допускается. Пробоподготовку и анализ следует проводить в один день.

Ультраэффективный жидкостный хроматограф с быстросканирующим УФ-детектором, снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки. Аналитическая колонка, заполненная сорбентом с привитой фазой, включающей гидрофильную карбаматную группу в цепи С18, (100 x 2,1) мм, 1,7 мкм. Температура колонки (30 +/- 1) °C. Подвижная фаза: ацетонитрил и 0,005 М ортофосфорная кислота в соотношении 30:70 (от 0 до 1 мин); далее градиент от 30:70 до 70:30 (от 1 до 8 мин). Скорость потока элюента: 0,2 см³/мин. Рабочая длина волны УФ-детектора 287 нм. Объем вводимой пробы 10 мм³. Время удерживания дифлуфензопира (5,1 +/- 0,1) мин.

Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки. Содержание дифлуфензопира в пробе (X, мг/кг) вычисляют по формуле:

где S_x - площадь пика дифлуфензопира на хроматограмме испытуемого образца, мм² (AU);

K - градуировочный коэффициент, найденный на стадии построения соответствующей градуировочной зависимости;

V - объем пробы, подготовленной для хроматографического анализа, см³;

P - навеска анализируемого образца, г;

f - полнота извлечения дифлуфензопира, приведенная в табл. 2, %.

Содержание остаточных количеств дифлуфензопира в образце вычисляют как среднее из двух параллельных определений.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор дифлуфензопира с концентрацией 1,0 мкг/см³, разбавляют подвижной фазой для ВЭЖХ.

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

где X₁, X₂ - результаты параллельных определений, мг/кг;

r - значение предела повторяемости .

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

Результат анализа представляют в виде:

где - среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

- граница абсолютной погрешности, мг/кг;

где - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

В случае если содержание компонента меньше нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание вещества в пробе "менее нижней границы определения" (например: менее 0,01 мг/кг <*>, где <*> - 0,01 мг/кг - предел обнаружения дифлуфензопира в почве).

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-02 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.

Величина добавки C_д должна удовлетворять условию:

где - характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой, соответственно), мг/кг; при этом:

где - граница абсолютной погрешности, мг/кг:

где - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

Результат контроля процедуры К_к рассчитывают по формуле:

где X', X, C_д - среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки, соответственно, мг/кг.

Норматив контроля К рассчитывают по формуле:

Проводят сопоставление результата контроля процедуры (К_к) с нормативом контроля (К).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры к их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):

где X₁, X₂ - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;

R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций), %.