"МУК 4.1.3269-15. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств мефеноксама в моркови и арбузах методом капиллярной газожидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 18.06.2015)

1. Разработаны сотрудниками "ГНУ Всероссийский НИИ фитопатологии" (Л.В. Дубовая, А.М. Макеев).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 22 мая 2015 г. N 1).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 18 июня 2015 г.

4. Введены впервые.

Свидетельство о метрологической аттестации N РОСС RU. 0001.310430/0224. 20.11.14.

Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода капиллярной газожидкостной хроматографии для определения массовых концентраций мефеноксама в моркови и арбузах в диапазоне 0,025 - 0,25 мг/кг.

Методические указания носят рекомендательный характер.

Название действующего вещества по ИСО: мефеноксам.

Название действующего вещества по ИЮПАК: Метил N-(метоксиацетил)-N-(2,6-ксилил)-D-аланинат.

Структурная формула:

Эмпирическая формула: C₁₅H₂₁NO₄.

Молекулярная масса: 279,3.

(R) - энантиомер металаксила. Вязкая жидкость от бледно-желтого до светло-коричневого цвета. Температура плавления: - 38,7 °C. Температура кипения: разлагается при 270 °C. Давление паров при 25 °C: 3,3 мПа. Коэффициент распределения н-октанол/вода: K_ow log P = 1,71. Растворимость (г/дм³) при 25 °C: вода - 26, н-гексан - 59, смешивается с ацетоном, этилацетатом, метанолом, дихлорметаном, толуолом и н-октанолом.

Вещество устойчиво к фотолизу и гидролизу в кислых и нейтральных условиях (DT₅₀ > 200 дней), в щелочных условиях (pH 9) DT₅₀ = 116 дней.

В биологически активных почвах в аэробных условиях мефеноксам разлагается со средним значением DT₅₀ = 21 день.

Острая пероральная токсичность (LD₅₀) для крыс - 667 мг/кг; острая дермальная токсичность (LD₅₀) дня крыс - > 2 000 мг/кг; острая ингаляционная токсичность (LC₅₀) для крыс - > 2 290 мг/м³ воздуха. LC₅₀ для рыб > 100 мг/дм³ (96 ч). Фунгицид нетоксичен для птиц, пчел и дождевых червей.

Мефеноксам - системный фунгицид защитного и искореняющего действия из класса фениламидов. Высокоэффективен против возбудителей фитофтороза картофеля и томатов, милдью винограда, ложной мучнистой росы и корнееда овощных культур, сахарной свеклы и подсолнечника, увядания растений кукурузы.

Применяется в России в качестве протравителя семян сахарной свеклы и подсолнечника с нормой расхода препарата 0,17 - 1,0 кг д.в./т. Помимо этого, мефеноксам в составе смесевых препаратов с фунгицидами защитного действия используется для двух-трехкратной обработки посевов овощных культур, картофеля и винограда в течение вегетационного периода с нормой расхода 0,1 - 0,2 кг д.в./га.

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций.

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительные интервалы среднего результата для всего диапазона измерений (n = 20) приведены в табл. 2.

Метод основан на определении мефеноксама с помощью капиллярной газожидкостной хроматографии с термоионным детектором после экстракции его из образцов ацетоном, очистки экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей и на колонке с оксидом алюминия.

Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки.

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Примечание. Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией.

Примечание. Допускается использование вспомогательных средств измерений, устройств и материалов с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-09, а также требования, изложенные в технической документации на газовый хроматограф.

4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 и 2.2.5.2308-07. Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004-90.

4.3. При работе с газами, находящимися в баллонах под давлением до 15 МПа (150 кгс/см²), необходимо соблюдать "Правила устройства и безопасной эксплуатации стационарных компрессорных установок, воздухопроводов и газопроводов под давлением", ПБ-03-576-03. Запрещается открывать вентиль баллона, не установив на нем понижающий редуктор.

К выполнению измерений и обработке их результатов допускаются специалисты, имеющие опыт работы в химической лаборатории, прошедшие обучение и владеющие техникой проведения анализа, освоившие метод анализа и уложившиеся в нормативы контроля.

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 + 5) °C и относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на газовом хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Выполнению измерений предшествуют следующие операции: очистка органических растворителей (при необходимости), приготовление градуировочных растворов и раствора внесения, кондиционирование хроматографической колонки, установление градуировочной характеристики, подготовка колонки с оксидом алюминия, проверка хроматографического поведения мефеноксама на колонке.

Растворитель последовательно промывают порциями концентрированной серной кислоты до прекращения окрашивания последней в желтый цвет, затем водой до нейтральной реакции промывных вод, перегоняют над калием углекислым.

Ацетон перегоняют над перманганатом калия и калием углекислым (на 1 дм³ ацетона 10 г калия перманганата и 2 г калия углекислого).

Растворитель предварительно встряхивают со свежеприготовленным раствором железа серно-кислого закисного, а затем последовательно промывают 0,5%-м раствором перманганата калия, 5%-м раствором гидроксида натрия и водой, после чего сушат над хлоридом кальция и перегоняют.

Навеску (5 +/- 0,1) г натрия углекислого растворяют в конической колбе в (40 - 60) см³ деионизованной воды. Полученный раствор количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 см³ и доводят объем раствора до метки деионизованной водой. Раствор хранят при комнатной температуре не более недели.

Хлористый метилен и этилацетат промывают последовательно раствором натрия углекислого с массовой долей 5%, насыщенным раствором хлорида кальция, сушат над безводным углекислым калием и перегоняют. Растворители хранят в темной посуде при комнатной температуре не более 14 дней.

7.2.1. Исходный градуированный раствор мефеноксама с массовой концентрацией 100 мкг/см³. В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают (0,010 +/- 0,0001) г мефеноксама, растворяют в 40 - 50 см³ этилацетата, доводят объем раствора этим же растворителем до метки, тщательно перемешивают.

Раствор хранят в морозильной камере при температуре не выше -12 °C не более 3 месяцев.

7.2.2. Градуировочный раствор мефеноксама с массовой концентрацией 10 мкг/см³ (раствор N 1). В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 10 см³ исходного градуировочного раствора мефеноксама с массовой концентрацией 100 мкг/см³ (п. 7.2.1), доводят объем раствора до метки этилацетатом, тщательно перемешивают. Этот раствор используют для приготовления рабочих градуировочных растворов N 2 - 5.

Для приготовления проб с внесением при оценке полноты извлечения мефеноксама из исследуемых образцов используют ацетоновый раствор мефеноксама с концентрацией 10 мкг/см³.

Градуировочный раствор N 1 и ацетоновый раствор мефеноксама хранят в морозильной камере при температуре не выше -12 °C не более месяца.

7.2.3. Градуировочные растворы мефеноксама с массовой концентрацией 0,2 - 2,0 мкг/см³ (растворы N 2 - 5). В 4 мерные колбы вместимостью 50 см³ помещают 1,0; 2,0; 5,0 и 10,0 см³ градуировочного раствора N 1 мефеноксама с массовой концентрацией 10 мкг/см³ (п. 7.2.2), доводят до метки смесью гексан-этилацетат с объемным соотношением компонентов 8:2, тщательно перемешивают, получают рабочие растворы N 2 - 5 с концентрацией мефеноксама 0,2; 0,4; 1,0 и 2,0 мкг/см³ соответственно.

Растворы готовят непосредственно перед использованием.

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади пика (мкВ) от концентрации мефеноксама в растворе (мкг/см³), устанавливают методом абсолютной градуировки по 4 градуировочным растворам.

В инжектор хроматографа вводят по 1 мм³ каждого градуировочного раствора (п. 7.2.3) и анализируют при условиях хроматографирования по п. 9.4. Осуществляют не менее 3 параллельных измерений. Расхождение между параллельными определениями не должно превышать предел повторяемости r.

По полученным данным строят градуировочную характеристику.

7.4.1. Смесь гексан-диэтиловый эфир (объемное соотношение 85:15). В мерную колбу вместимостью 250 см³ помещают 37,5 см³ диэтилового эфира, доводят до метки гексаном, перемешивают. Смесь готовят непосредственно перед использованием.

7.4.2. Смесь гексан-диэтиловый эфир (объемное соотношение 1:1). В мерную колбу вместимостью 250 см³ помещают 125 см³ диэтилового эфира, доводят до метки гексаном, перемешивают. Смесь готовят непосредственно перед использованием.

Нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см и внутренним диаметром 8 - 10 мм уплотняют тампоном из стекловаты, медленно выливают в колонку (при открытом кране) суспензию 10 г оксида алюминия V степени активности в 15 см³ гексана (оксид алюминия V степени активности по Брокману получают добавлением 15% воды к оксиду алюминия I степени активности). Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента и помещают на него слой безводного серно-кислого натрия высотой 1 см. Колонку промывают 15 см³ гексана со скоростью 1 - 2 капли в секунду, после чего она готова к работе.

В круглодонную колбу вместимостью 10 см³ помещают 0,2 см³ градуировочного раствора N 1 мефеноксама с концентрацией 10 мкг/см³ в этилацетате (п. 7.2.2), Отдувают растворитель током теплого воздуха, остаток растворяют в 2 см³ смеси гексан-диэтиловый эфир в объемном соотношении 85:15, помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин. Раствор наносят на колонку с оксидом алюминия, подготовленную по п. 7.5. Промывают колонку 20 см³ смеси гексан-диэтиловый эфир (85:15, по объему) со скоростью 1 - 2 капли в секунду, элюат отбрасывают. Затем через колонку пропускают 40 см³ смеси гексан-диэтиловый эфир в объемном соотношении 1:1, отбирая последовательно по 5 см³ элюата. Каждую фракцию упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °C, сухие остатки растворяют в 2 см³ смеси гексан-этилацетат (8:2, по объему), помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин, и анализируют на содержание мефеноксама по п. 9.4.

По результатам обнаружения мефеноксама в каждой из фракций определяют объем смеси гексан-диэтиловый эфир (1:1, по объему), необходимый для полного вымывания мефеноксама из колонки.

Примечание. Проверку хроматографического поведения мефеноксама следует проводить обязательно, поскольку профиль вымывания может изменяться при использовании новой партии сорбентов и растворителей.

Отбор проб производится в соответствии с требованиями ГОСТ Р 51782-01 "Морковь столовая свежая, реализуемая в розничной торговой сети. Технические условия", ГОСТ 28275-94 "Морковь столовая свежая. Руководство по хранению", ГОСТ 1721-85 "Морковь столовая свежая, заготовляемая и поставляемая. Технические условия", ГОСТ 7177-80 "Арбузы продовольственные свежие. Технические условия", "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (N 2051-79 от 21.08.79).

Отобранные пробы корнеплодов моркови и арбуза хранят в стеклянной или полиэтиленовой таре в холодильнике в темноте не более 1 месяца. Для длительного хранения образцы замораживают и хранят при температуре -18 °C.

Перед анализом образцы измельчают.

Измельченный образец моркови или арбуза массой 20 г помещают в стакан гомогенизатора вместимостью 500 см³, добавляют 100 см³ ацетона и гомогенизируют 3 минуты при 10 000 об./мин. Гомогенат фильтруют под вакуумом на воронке Бюхнера через двойной бумажный фильтр средней плотности в колбу вместимостью 250 см³. Осадок на фильтре промывают 50 см³ ацетона. Объединенный фильтрат переносят в мерный цилиндр на 250 см³, доводят общий объем раствора до 200 см³ ацетоном, перемешивают. Аликвоту раствора объемом 50 см³, эквивалентную 5 г образца, переносят в круглодонную колбу вместимостью 100 см³, добавляют 20 см³ деионизованной воды и раствор упаривают до водного остатка (около 15 см³) на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 40 °C. Далее проводят очистку экстракта по п. 9.2.

Приготовление раствора гидроксида натрия с молярной концентрацией 0,1 моль/дм³ (0,1 М раствор). Растворяют (4 +/- 0,1) г гидроксида натрия в (70 - 100) см³ деионизованной воды, затем раствор переносят в мерную колбу вместимостью 1 000 см³ и доводят объем раствора до метки деионизованной водой. Раствор хранят при комнатной температуре не более 1 месяца.

Водный остаток, полученный по п. 9.1, переносят в делительную воронку вместимостью 250 см³. Колбу ополаскивают 10 см³ деионизованной воды, которые также переносят в делительную воронку. Вносят в воронку 10 см³ насыщенного водного раствора хлорида натрия, 30 см³ хлористого метилена и содержимое интенсивно встряхивают в течение 2 мин. После разделения фаз нижний органический слой сливают в делительную воронку вместимостью 250 см³. Операцию экстракции водной фазы повторяют еще дважды, используя по 20 см³ хлористого метилена. К объединенной дихлорметановой фракции, помещенной в делительную воронку, приливают 50 см³ 0,1 М раствора гидроксида натрия и смесь интенсивно встряхивают в течение 2 минут. После разделения фаз нижний дихлорметановый слой фильтруют через слой безводного серно-кислого натрия в круглодонную колбу вместимостью 100 см³ и упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре 30 °C. Далее проводят очистку экстракта по п. 9.3.

Сухой остаток в круглодонной колбе, полученный по п. 9.2, растворяют в 3 см³ смеси гексан-диэтиловый эфир (85:15, по объему), помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин. Раствор наносят на колонку, подготовленную по п. 7.5. Колбу обмывают 2 см³ смеси гексан-диэтиловый эфир (85:15, по объему), которые также наносят на колонку. Промывают колонку 20 см³ смеси гексан-диэтиловый эфир (85:15, по объему) со скоростью 1 - 2 капли в секунду, элюат отбрасывают. Мефеноксам элюируют с колонки 30 см³ смеси гексан-диэтиловый эфир (1:1, по объему), собирая элюат непосредственно в круглодонную колбу вместимостью 100 см³. Раствор упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре 30 °C. Остаток экстрактов растворяют в 1,25 см³ смеси гексан-этилацетат с объемным соотношением компонентов 8:2, помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин, и анализируют на содержание мефеноксама по п. 9.4.

Газовый хроматограф с термоионным детектором, снабженный приспособлениями для капиллярной колонки.

Хроматографическая кварцевая капиллярная колонка длиной 30 м, внутренним диаметром 0,32 мм с нанесенной пленкой из смеси: 5% дифенилполисилоксана и 95% диметилполисилоксана толщиной 0,5 мкм.

Температура термостата колонки программированная. Начальная температура - 170 °C, выдержка 2 мин; нагрев колонки со скоростью 20 градусов в минуту до температуры 230 °C, выдержка - 0 мин.; нагрев колонки со скоростью 5 градусов в минуту до температуры 245 °C, выдержка 3 мин; нагрев со скоростью 20 градусов в минуту до температуры 280 °C, выдержка - 10 мин.

Объем вводимой пробы: 1 мм³.

Линейный диапазон детектирования: 0,20 - 2,0 нг.

Образцы, дающие пики большие, чем градуировочный раствор с концентрацией 2,0 мкг/см³, разбавляют смесью гексан-этилацетат в объемном соотношении 8:2.

Содержание мефеноксама в пробе (X, мг/кг) рассчитывают методом абсолютной калибровки по формуле:

C - концентрация мефеноксама, найденная по градуировочной характеристике в соответствии с величиной площади хроматографического пика, мкг/см³;

V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, см³;

m - масса анализируемой части образца, соответствующая доле экстракта, использованной для очистки на колонке с оксидом алюминия и последующего хроматографического определения, г.

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости:

X₁, X₂ - результаты параллельных определений, мг/кг;

r - значение предела повторяемости (табл. 1), при этом .

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

Результат анализа представляют в виде:

- среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

- граница абсолютной погрешности, мг/кг:

- граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

В случае, если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание мефеноксама в пробах моркови и арбуза - менее 0,025 мг/кг" <*>.

--------------------------------

<*> - 0,025 мг/кг - предел обнаружения.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-02 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

13.1. Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят в начале и по окончании каждой серии опытов.

При контроле стабильности градуировочной характеристики проводят измерения не менее двух образцов концентраций для градуировки, содержание мефеноксама в которых должно охватывать весь диапазон от 0,2 до 2,0 мкг/см³.

Градуировочная характеристика считается стабильной, если для каждого градуировочного раствора, используемого для контроля, сохраняется соотношение:

X - содержание мефеноксама в пробе при контрольном измерении, мкг;

C - известное содержание мефеноксама в градуировочном растворе, взятом для контроля стабильности градуировочной характеристики, мкг;

B - норматив контроля погрешности градуировочной характеристики, % (равен 10% при P = 0,95).

Если величина расхождения (A) превышает 10%, делают вывод о невозможности применения градуировочной характеристики для дальнейших измерений. В этом случае выясняют и устраняют причины нестабильности градуировочной характеристики и повторяют контроль ее стабильности с использованием других градуировочных растворов мефеноксама, предусмотренных МВИ. При повторном обнаружении нестабильности градуировочной характеристики устанавливают ее заново согласно п. 7.3.

Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.

Величина добавки C_д должна удовлетворять условию:

- характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой соответственно), мг/кг.

Допустимо характеристику погрешности результатов анализа при внедрении методики в лаборатории устанавливать на основе выражения с последующим уточнением по мере накопления информации:

- граница абсолютной погрешности, мг/кг:

- граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

Контроль проводят путем сравнения результата контрольной процедуры К_к с нормативом контроля К.

Результат контрольной процедуры К_к рассчитывают по формуле:

, , C_д - среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки соответственно, мг/кг.

Норматив контроля К рассчитывают по формуле:

Проводят сопоставление результата контрольной процедуры (К_к) с нормативом контроля (К).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (3) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (3) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), не должно превышать предел воспроизводимости (R):

X₁, X₂ - результаты измерений, выполненных в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), мг/кг;

R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.