"МУК 4.1.3135-13. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств флоникамида в воде, почве, яблоках и яблочном соке методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 12.11.2013)

1. Разработаны сотрудниками ГНУ Всероссийский НИИ защиты растений Россельхозакадемии (В.И. Долженко, И.А. Цибульская, А.С. Комарова, Т.Д. Черменская, В.В. Человечкова).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (Протокол от 29 октября 2013 г. N 3).

3. Утверждены вр.и.о. руководителя Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главного государственного санитарного врача Российской Федерации А.Ю. Поповой 12 ноября 2013 г.

4. Введены впервые.

Свидетельство о метрологической аттестации N 01.5.04.143/01.00043/2013.

Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения массовой концентрации флоникамида в воде в диапазоне концентраций 0,001 - 0,01 мг/дм3, в почве в диапазоне концентраций 0,02 - 0,2 мг/кг, яблоках и яблочном соке в диапазоне концентраций 0,05 - 0,5 мг/кг.

Методические указания носят рекомендательный характер.

Название действующего вещества по ИСО: флоникамид.

Название действующего вещества по ИЮПАК: 4-трифторметил-N-цианометилникотинамид.

Структурная формула:

Эмпирическая формула: .

Молекулярная масса: 229,2.

Химически чистое вещество представляет собой белый кристаллический порошок без запаха.

Температура плавления: 157,5 °C.

Коэффициент распределения в системе н-октанол-вода .

Растворимость в воде (г/дм3, 20 °C) - 5,2.

Растворимость в органических растворителях (г/дм3, 20 °C): ацетон - 163,5, толуол - 0,55, этилацетат - 34,2, дихлорметан - 4,5.

Краткая токсикологическая характеристика: острая пероральная ; 1768 мг/кг массы тела для самцов и самок крыс соответственно. Острая дермальная для крыс . Не ирритант для кожи и глаз кроликов. Острая токсичность: рыбы , дафнии , зеленые водоросли . Не токсичен для энтомофагов.

Область применения: селективный, системный инсектицид для сосущих насекомых, повреждающих плодовые, зерновые, овощные культуры.

В России для флоникамида гигиенические нормативы не установлены.

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1, для соответствующих диапазонов концентраций.

Методика основана на определении флоникамида методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием ультрафиолетового (УФ) детектора после его извлечения из образцов органическим растворителем и последующей очистки на патронах для твердофазной экстракции.

Идентификация флоникамида проводится по времени удерживания, количественное определение - методом абсолютной калибровки.

Избирательность метода обеспечивается сочетанием условий подготовки проб и хроматографирования.

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Примечание. Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией, не требующих дополнительной очистки растворителей.

Примечание. Допускается применение оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-2009, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф.

4.2. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией, соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и 2.2.5.2308-07.

Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004-90.

Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист-химик, имеющий опыт работы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, ознакомленный с руководством по эксплуатации хроматографа, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 13.

При выполнении измерений выполняют следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C и относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Перед началом анализа аналитическую колонку кондиционируют в потоке подвижной фазы (0,1 - 0,2 см3/мин) до стабилизации нулевой линии.

Патрон промывают 2 см3 этилацетата, затем 3 см3 смеси N 1 (гексан:этилацетат).

7.3.1. 0,005 М раствор ортофосфорной кислоты: (0,5 +/- 0,01) г 98%-й ортофосфорной кислоты помещают в мерную колбу объемом 1 дм3, растворяют в бидистиллированной воде и доводят объем до метки.

7.3.2. Для приготовления 0,1 М фосфатного буфера взвешивают 11,4 г калия фосфорнокислого двузамещенного 3-водного и 6,8 г калия дигидрофосфата, переносят в мерную колбу вместимостью 1000 см3, растворяют в воде и доводят объем до метки водой.

7.3.3. Смесь ацетонитрила с водой в соотношении 20:80 готовят по объему, используя мерные цилиндры.

7.3.4. Для приготовления подвижной фазы смешивают ацетонитрил с 0,005 М раствором ортофосфорной кислоты в соотношении 13:87 по объему, используя мерные цилиндры.

7.4.1. Основной раствор с концентрацией 0,5 мг/см3: точную навеску флоникамида (50 +/- 0,5) мг помещают в мерную колбу вместимостью 100 см3, растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки ацетонитрилом.

7.4.2. Приготовление градуировочных растворов

Градуировочные растворы с концентрациями флоникамида 0,1, 0,5, 1,0, 5,0 и 10,0 мкг/см3 готовят методом последовательного разбавления по объему, используя смесь ацетонитрила и воды в соотношении 20:80.

7.4.2.1. Раствор N 1 с концентрацией 10,0 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 100 см3 вносят 2,0 см3 основного раствора и доводят до метки подвижной фазой.

7.4.2.2. Раствор N 2 с концентрацией 5,0 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 100 см3 помещают 1,0 см3 основного раствора и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.4.2.3. Раствор N 3 с концентрацией 1,0 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 10 см3 помещают 1 см3 раствора N 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.4.2.4. Раствор N 4 с концентрацией в 0,5 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 10 см3 помещают 1 см3 раствора N 2 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.4.2.5. Раствор N 5 с концентрацией 0,1 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 10 см3 помещают 1 см3 раствора N 3 и доводят объем до метки подвижной фазой.

Основной раствор можно хранить в холодильнике при температуре 0 - 4 °C в течение 1 месяца, градуировочные растворы - 2 дней.

При изучении полноты определения флоникамида в воде, почве, яблоках и яблочном соке используют ацетоновые растворы вещества, приготовленные из основного раствора методом последовательного разбавления по объему ацетоном.

Для установления градуировочной характеристики (площадь пика - концентрация флоникамида в растворе) в хроматограф вводят по 10 мм3 градуировочных растворов (не менее 3 параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4 точек по диапазону измеряемых концентраций). Затем измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации флоникамида в градуировочном растворе.

Методом наименьших квадратов рассчитывают градуировочный коэффициент (K) в уравнении линейной регрессии:

где S - площадь пика градуировочного раствора.

Градуировку признают удовлетворительной, если значение коэффициента линейной корреляции оказывается не ниже 0,99.

Градуировочную характеристику необходимо проверять при замене реактивов, хроматографической колонки или элементов хроматографической системы, а также при отрицательном результате контроля градуировочного коэффициента.

Градуировочную зависимость признают стабильной при выполнении следующего условия:

где C - аттестованное значение массовой концентрации флоникамида в градуировочном растворе,

- результат контрольного измерения массовой концентрации флоникамида в градуировочном растворе,

- норматив контроля градуировочного коэффициента, %. ( при P = 0,95).

В круглодонную колбу емкостью 10 см3 отбирают 1 см3 стандартного раствора флоникамида с концентрацией 1 мкг/см3. Отдувают растворитель током воздуха. Остаток растворяют в 1 см3 смеси N 1 и переносят на подготовленный патрон (п. 7.2). Колбу обмывают 1 см3 смеси N 1 и смыв тоже переносят на патрон. Промывают патрон 5 см3 смеси N 1, элюат отбрасывают. Затем элюируют флоникамид этилацетатом со скоростью 1 - 2 капли в секунду. Отбирают фракции по 2 см3, упаривают досуха, растворяют в 1 см3 смеси ацетонитрил-вода 20:80 и анализируют по п. 9.4.

Фракции, содержащие флоникамид, объединяют и вновь анализируют.

Устанавливают уровень вещества в элюате, определяют полноту смывания с патрона и необходимый для очистки объем элюата.

Примечание. Проверку хроматографического поведения флоникамида следует проводить обязательно, поскольку профиль вымывания может изменяться при использовании новой партии патронов и растворителей.

Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (N 2051-79 от 21.08.1979), а также в соответствии с ГОСТ Р 51592-2000 "Вода. Общие требования к отбору проб"; ГОСТ 28168-89 "Почвы. Отбор проб". Отбор проб яблок производят в соответствии с ГОСТ 27572-87 "Яблоки свежие для промышленной переработки".

Для длительного хранения пробы почвы подсушиваются при комнатной температуре в отсутствие прямого солнечного света. Сухие почвенные образцы могут храниться в течение года. Перед анализом сухую почву доводят до стандартной влажности, просеивают через сито с отверстиями диаметром 1 мм. Пробы фруктов хранят до анализа в герметичной полиэтиленовой упаковке в морозильной камере при -18 °C. Перед анализом фрукты, не размораживая, измельчают на терке или в гомогенизаторе.

Пробу воды 100 см3 помещают в делительную воронку вместимостью 250 см3, добавляют 30 см3 этилацетата и интенсивно встряхивают 2 - 3 мин. После полного разделения фаз верхний органический слой собирают, к водному добавляют 30 см3 этилацетата и экстракцию повторяют. Объединенные органические фракции пропускают через воронку, содержащую безводный сульфат натрия, и собирают в круглодонную колбу вместимостью 100 см3. Растворитель упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 40 °C. Сухой остаток растворяют в 1 см3 смеси ацетонитрил-вода 20:80 и 10 мм3 вводят в хроматограф.

Навеску почвы 20 г помещают в полипропиленовую центрифужную пробирку вместимостью 50 см3 и добавляют 20 см3 ацетона. Пробирку плотно закрывают и помещают в аппарат для встряхивания на 10 мин, затем центрифугируют в течение 10 мин при скорости 4000 об/мин. От верхнего слоя отбирают аликвоту 10 см3, соответствующую 10 г пробы, переносят в круглодонную колбу вместимостью 50 см3. Растворитель упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 40 °C, остаток растворяют в 1 см3 смеси ацетонитрил-вода 20:80 и 10 мм3 вводят в хроматограф.

Навеску измельченных плодов яблок 20 г помещают в коническую колбу вместимостью 100 см3, добавляют 30 см3 0,1 М фосфатного буфера и колбу помещают в ультразвуковую ванну на 10 мин. Экстракт декантируют в делительную воронку вместимостью 250 см3, пропуская через бумажный фильтр, к остатку в колбе добавляют 30 см3 буфера и повторяют экстракцию. К объединенному экстракту в делительной воронке добавляют 30 см3 этилацетата и интенсивно встряхивают 2 - 3 мин. После полного разделения фаз верхний органический слой отбирают, к водному добавляют 30 см3 этилацетата и экстракцию повторяют. Объединенные органические фракции пропускают через воронку, содержащую безводный сульфат натрия, собирают в круглодонную колбу вместимостью 100 см3 и растворитель упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 40 °C. Сухой остаток подвергают очистке на патроне по п. 9.5.

Навеску сока 20 г помещают в стакан вместимостью 100 см3, доводят объем до 50 см3 0,1 М фосфатным буфером и переносят в делительную воронку вместимостью 250 см3, добавляют 30 см3 этилацетата и интенсивно встряхивают 2 - 3 мин. После полного разделения фаз верхний органический слой отбирают, к водному добавляют 30 см3 этилацетата и экстракцию повторяют. Объединенные органические фракции пропускают через воронку, содержащую безводный сульфат натрия, собирают в круглодонную колбу вместимостью 100 см3 и растворитель упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 40 °C. Сухой остаток подвергают очистке на патроне по п. 9.5.

Сухой остаток, полученный по п. 9.3 или 9.4, растворяют в 1 см3 смеси N 1, наносят на предварительно кондиционированный патрон (п. 7.2), колбу ополаскивают 1 см3 смеси N 1 и также наносят на патрон. Патрон промывают 5 см3 смеси N 1, элюат отбрасывают. Флоникамид элюируют 6 см3 этилацетата, элюат собирают, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе, остаток растворяют в 1 см3 смеси ацетонитрил-вода 20:80 и 10 мм3 вводят в хроматограф.

Ультраэффективный жидкостной хроматограф с быстросканирующим УФ-детектором, снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки. Аналитическая колонка, заполненная сорбентом с привитыми монофункциональными полярными группами С18 - (2,1 x 100) мм, 1,7 мкм. Температура колонки (30 +/- 1) °C. Подвижная фаза: смесь ацетонитрила и 0,005 М ортофосфорной кислоты в соотношении 13:87. Скорость потока элюента: 0,2 см3/мин. Рабочая длина волны ультрафиолетового детектора 265 нм. Объем вводимой пробы 10 мм3.

Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки. Содержание флоникамида в пробе (X, мг/кг) вычисляют по формуле:

где - площадь пика флоникамида на хроматограмме используемого образца, мм2 (AU);

K - градуировочный коэффициент, найденный на стадии построения соответствующей градуировочной зависимости;

V - объем пробы, подготовленной для хроматографического анализа, см3;

P - навеска анализируемого образца, г;

f - полнота извлечения флоникамида, приведенная в табл. 2, %.

Содержание остаточных количеств флоникамида в образце вычисляют как среднее из двух параллельных определений.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор флоникамида с концентрацией 10,0 мкг/см3, разбавляют смесью ацетонитрил-вода в соотношении 20:80.

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

где , - результаты параллельных определений, мг/кг;

r - значение предела повторяемости .

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

Результат анализа представляют в виде:

при вероятности P = 0,95, где

- среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

- граница абсолютной погрешности, мг/кг:

где - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

В случае если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание вещества в пробе "менее нижней границы определения" (например: менее 0,05 мг/кг*, где * - 0,05 мг/кг - предел обнаружения флоникамида в яблоках).

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.

Величина добавки должна удовлетворять условию:

где - характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой соответственно), мг/кг; при этом:

где - граница абсолютной погрешности, мг/кг:

где - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

Результат контроля процедуры рассчитывают по формуле:

где X', X, - среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки, соответственно, мг/кг.

Норматив контроля K рассчитывают по формуле:

Проводят сопоставление результата контроля процедуры с нормативом контроля (K).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (3) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (3) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры к их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):

где , - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;

R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций), %.