"МУК 4.1.3243-14. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств цифлуфенамида в винограде и виноградном соке методом капиллярной газожидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 29.12.2014)

1. Разработаны ФБУН "Федеральный научный центр гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана Роспотребнадзора (В.Н. Ракитский, Т.В. Юдина, М.В. Ларькина, С.К. Рогачева).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 6 ноября 2014 г. N 2).

3. Утверждены руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 29 декабря 2014 г.

4. Введены впервые.

Свидетельство об аттестации МВИ N РОСС RU.0001.310430/0199.14.07.14 от 14.07.14.

Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода капиллярной газожидкостной хроматографии для измерения концентрации цифлуфенамида в винограде (ягоды, сок) в диапазоне 0,01 - 0,1 мг/кг.

Методические указания носят рекомендательный характер.

Химический класс: амиды.

(Z)-N-[-(циклопропилметоксиимино)-2,3-дифтор-6-(трифторметил)бензил]-2-фенилацетамид (IUPAC).

Структурная формула:

Брутто формула: C₂₀H₁₇F₅N₂O₂.

Молекулярная масса: 412,4.

Белый порошок со слабым сладковатым запахом. Температура плавления 61,5 - 62,5 °C. Давление паров 1,2·10^-8 Па (при 20 °C). Растворимость в воде 3,3 мг/дм³ (при 25 °C). Коэффициент распределения н-октан/вода KowlogP = 4,7 (при 20 °C). Стабильность в водных растворах: при pH 3 - 5, 7, 10, при 20 °C, в том числе при низких концентрациях (менее 1 мг/дм³). Стабилен при pH 3 - 5, 7.

Растворимость в органических растворителях (г/дм³): дихлорметан -> 331, хлороформ -> 372, ацетон -> 198 (при 20 °C).

Краткая токсикологическая характеристика. Острая пероральная токсичность (LD₅₀) для крыс > 5 000 мг/кг; острая дермальная токсичность (LD₅₀) для крыс > 2 000 мг/кг, острая ингаляционная токсичность (LK₅₀) для крыс > 4,76 мг/дм³.

Область применения. Цифлуфенамид - системный фунгицид с длительным профилактическим и выраженным лечебным действием против широкого спектра патогенов грибной этиологии.

При соблюдении всех регламентируемых условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерения при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций.

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для всего диапазона измерений (n = 20) приведены в табл. 2.

Метод основан на определении цифлуфенамида с использованием капиллярной газожидкостной хроматографии с электронозахватным детектором и/или масс-селективным детекторами после извлечения вещества из анализируемых образцов ацетонитрилом, очистки экстрактов на патроне для твердофазной экстракции с привитой октадецильной фазой.

Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки.

Примечание. Допускается применение оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ Р 12.1.019-09, а также требования, изложенные в технической документации на газовый хроматограф.

4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе на должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и 2.2.5.2308-07. Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004-90.

4.3. При работе с газами, находящимися в баллонах под давлением до 15 МПа (150 кгс/см²), необходимо соблюдать "Правила устройства и безопасной эксплуатации стационарных компрессорных установок, воздухопроводов и газопроводов под давлением", ПБ-03-576-03. Запрещается открывать вентиль баллона, не установив на нем понижающий редуктор.

К выполнению измерений допускают специалистов, прошедших обучение, освоивших методику, владеющих техникой, имеющих опыт работы на газовом хроматографе и подтвердивших соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности по п. 13.

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C и относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на газовом хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Измерениям предшествуют следующие операции: очистка органических растворителей (при необходимости), приготовление градуировочных растворов и раствора внесения, установление градуировочной характеристики, приготовление смесей растворителей для экстракции и очистки экстрактов на концентрирующем патроне, подготовка концентрирующего патрона, проверка хроматографического поведения цифлуфенамида на нем.

7.1.2.1. Приготовление раствора натрия углекислого с массовой долей 5%. Навеску (25 +/- 0,1) г натрия углекислого помещают в мерную колбу вместимостью 500 см³, растворяют в бидистиллированной воде, доводят водой до метки, перемешивают. Раствор хранят в стеклянной посуде в течение 3 месяцев.

7.1.2.2. Очистка растворителя. Этилацетат промывают последовательно 5%-м водным раствором натрия углекислого, насыщенным раствором хлористого кальция, сушат над прокаленным карбонатом калия и перегоняют или подвергают ректификационной перегонке на колонне с числом теоретических тарелок не менее 30. Растворитель хранят в стеклянной посуде в течение 1 месяца.

Ацетонитрил кипятят с обратным холодильником над пентоксидом фосфора (на 1 дм³ ацетонитрила 20 г пентоксида фосфора) не менее 1 часа, после чего перегоняют, непосредственно перед употреблением ацетонитрил повторно перегоняют над прокаленным карбонатом калия (на 1 дм³ ацетонитрила 10 г карбоната калия).

7.2.1. Исходный раствор цифлуфенамида для градуировки (концентрация 100 мкг/см³). В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 0,01 г цифлуфенамида, растворяют в 50 - 60 см³ этилацетата, доводят им до метки, тщательно перемешивают.

Раствор хранят в холодильнике при температуре 4 - 6 °C в течение месяца.

7.2.2. Рабочий раствор N 1 цифлуфенамида для градуировки и внесения (концентрация 1,0 мкг/см³). В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 1,0 см³ исходного градуировочного раствора с концентрацией 100,0 мкг/см³ (п. 7.2.1), доводят до метки этилацетатом, тщательно перемешивают, получают рабочий раствор N 1 с концентрацией цифлуфенамида 1,0 мкг/см³.

Раствор хранят в холодильнике при температуре 4 - 6 °C в течение месяца.

Этот раствор используют для приготовления проб с внесением при оценке полноты извлечения действующего вещества методом "внесено-найдено" и контроля качества результатов измерений методом добавок.

7.2.3. Рабочие растворы N 2 - 5 цифлуфенамида для градуировки (концентрация 0,005 - 0,05 мкг/см³). В 4 мерные колбы вместимостью 100 см³ помещают 0,5; 1,0; 2,5 и 5,0 см³ рабочего раствора N 1 для градуировки и внесения раствора с концентрацией 1,0 мкг/см³ (п. 7.2.2), доводят до метки этилацетатом, тщательно перемешивают, получают рабочие растворы N 2 - 5 с концентрациями цифлуфенамида 0,005; 0,01, 0,025 и 0,05 мкг/см³.

Растворы хранят в холодильнике при температуре 4 - 6 °C в течение 14 дней.

Градуировочную характеристику, выражающую линейную (с угловым коэффициентом) зависимость площади пика от концентрации цифлуфенамида в растворе, устанавливают методом абсолютной калибровки по 4 растворам для градуировки.

В испаритель хроматографа вводят по 1 мм³ каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.3. Осуществляют не менее 3 параллельных измерений. Устанавливают площади пиков цифлуфенамида.

Патрон устанавливают на аллонж с прямым отводом для вакуума и промывают последовательно 10 см³ этилацетата, 10 см³ метанола и 10 см³ бидистиллированной воды. Скорость потока растворителей через патрон не должна превышать 2 см³/мин, при этом нельзя допускать высыхания поверхности патрона. Патрон готовят непосредственно перед использованием.

Отбор проб производится в соответствии с правилами, определенными: ГОСТ 25896-83 "Виноград свежий столовый. Технические условия"; "Продукты переработки плодов и овощей. Правила приемки, методы отбора проб"; "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (N 2051-79 от 21.08.79).

Отобранные пробы винограда хранят в стеклянной или полиэтиленовой таре в холодильнике в темноте не более 7 дней. Для длительного хранения образцы замораживают и хранят при температуре -18 °C. Перед анализом пробы измельчают с помощью гомогенизатора.

Пробы сока анализируют в день изготовления.

Образец измельченных ягод винограда массой 10 г помещают в коническую колбу вместимостью 250 см³, добавляют 30 см³ деионизованной воды, интенсивно встряхивают 2 - 3 минуты, затем добавляют 80 см³ ацетонитрила и выдерживают на аппарате для встряхивания 30 мин. Смесь отфильтровывают на воронке Бюхнера с помощью разряжения, создаваемого водоструйным насосом, через бумажный фильтр средней плотности. Растительный остаток промывают 40 см³ ацетонитрила. Экстракт фильтруют на воронке Бюхнера.

Объединенный отфильтрованный экстракт переносят в мерный цилиндр объемом 250 см³ и доводят до метки 150 см³ ацетонитрилом. Переносят аликвоту, равную ¹/₁₀ части экстракта (15 см³) в колбу для упаривания и упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 40 °C досуха.

К сухому остатку добавляют 1 см³ метанола, помещая его на ультразвуковую баню на 30 с, затем добавляют 9 см³ деионизованной воды. После повторного смешивания на ультразвуковой бане экстракт подвергают очистке на концентрирующем патроне по п. 9.2.

К образцу сока с мякотью массой 10 г, находящемуся в конической колбе (с пришлифованной пробкой) вместимостью 250 см³, добавляют 10 см³ деионизованной воды, интенсивно встряхивают в течение 5 мин, добавляют 70 см³ ацетонитрила, еще раз встряхивают и помещают в холодильник (4 °C) на 1 - 2 часа. Экстракт фильтруют на воронке Бюхнера через двойной бумажный фильтр средней плотности под вакуумом, промывая остаток на фильтре 10 см³ ацетонитрила.

Экстракты объединяют и помещают в мерный цилиндр объем 100 см³. Доводят объем объединенного отфильтрованного экстракта до метки, отбирают 10 см³ (¹/₁₀ часть) экстракта и переносят в колбу для упаривания, упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 40 °C досуха. К сухому остатку добавляют 1 см³ метанола, помещая его на ультразвуковую баню на 30 с, затем добавляют 9 см³ деионизованной воды. После повторного смешивания на ультразвуковой бане экстракт подвергают очистке на концентрирующем патроне по п. 9.2.

Экстракт, полученный по п. 9.1.1 или 9.1.2 (1 см³ метанола и 9 см³ воды) наносят на подготовленный по п. 7.4 концентрирующий патрон со скоростью не более 2 см³/мин, элюат отбрасывают. Действующее вещество смывают 10 см³ метанола, собирают элюат в колбу для упаривания, упаривают досуха при температуре не выше 40 °C, сухой остаток растворяют в 2 см³ этилацетата и хроматографируют в условиях, изложенных в п. 9.3.

Хроматографическая, капиллярная, кварцевая колонка, длиной 30 м, внутренним диаметром 0,32 мм, содержащая сорбент: 5% - фенилполисилоксан, 95% - диметилполисилоксан (толщина пленки сорбента 0,25 мкм).

Температура термостата колонки программированная. Начальная температура - 160 °C, выдержка 2 мин, нагрев колонки со скоростью 10 градусов в минуту до температуры 240 °C, выдержка 2 мин, затем нагрев колонки со скоростью 20 градусов в минуту до температуры 270 °C.

Газ 1 (азот): давление 85 кПа, скорость 38,123 см/с, поток 1,85 см³/мин.

Газ 2: деление потока 1:3; сброс 5,5 см³/мин, с 1 мин - 20,0 см³/мин.

Хроматографируемый объем: 1 мм³.

Линейный диапазон детектирования: 0,005 - 0,05 нг.

Хроматографическая, капиллярная, кварцевая колонка длиной 30 м, внутренним диаметром 0,25 мм, содержащая сорбент: 5% - фенилполисилоксан, 95% - диметилполисилоксан (толщина пленки сорбента 0,25 мкм).

Температура детектора: квадруполь - 150 °C, источник - 230 °C; переходной камеры - 280 °C.

Температура испарителя: 280 °C.

Температура термостата колонки программированная. Начальная температура - 190 °C, выдержка 2 мин, нагрев колонки со скоростью 5 градусов в минуту до температуры 230 °C, выдержка 3 мин, нагрев колонки со скоростью 10 градусов в минуту до температуры 270 °C.

Газ 1 (гелий): поток в колонке 1,0 см³/мин.

Давление - 106,9 кПа.

Средняя линейная скорость - 39 см/с.

Хроматографируемый объем: 1 мм³.

Режим сканирования - SIM, m/z: 91, 223, 294, 321.

Линейный диапазон детектирования: 0,005 - 0,05 нг.

Образцы, дающие пики большие, чем градуировочный раствор цифлуфенамида с концентрацией 0,05 мкг/см³, разбавляют смесью гексан-ацетон (2:8, по объему), не более чем в 50 раз.

Содержание цифлуфенамида в пробе (X, мг/кг) рассчитывают по формуле:

где X - содержание цифлуфенамида в пробе, мг/кг;

A - концентрация цифлуфенамида, найденная по градуировочной характеристике в соответствии с величиной площади хроматографического пика, мкг/см³;

V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, см³;

m - масса анализируемого образца, г;

10 - коэффициент, учитывающий долю экстракта, отобранного для пробоподготовки.

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости:

где X₁, X₂ - результаты параллельных определений, мг/кг;

r - значение предела повторяемости (табл. 1), при этом .

При невыполнении условия выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

Результат анализа представляют в виде:

где - среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

- граница абсолютной погрешности, мг/кг:

где - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

Если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание цифлуфенамида в пробе менее 0,01 мг/кг" <*>.

--------------------------------

<*> 0,01 мг/кг - предел обнаружения цифлуфенамида в винограде и виноградном соке.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-02 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

13.1. Контроль стабильности градуировочной характеристики.

Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят в начале и по окончании каждой серии анализов.

При контроле стабильности градуировочной характеристики проводят измерения не менее трех образцов концентраций для градуировки, содержание цифлуфенамида в которых должно охватывать весь диапазон концентраций от 0,005 до 0,05 мкг/см³.

Градуировочная характеристика считается стабильной, если для каждого из используемого для контроля градуировочного раствора сохраняется соотношение:

где X - концентрация цифлуфенамида в пробе при контрольном измерении, мкг/см³;

C - известная концентрация градуировочного раствора цифлуфенамида, взятая для контроля стабильности градуировочной характеристики, мкг/см³;

B - норматив контроля погрешности градуировочной характеристики, % (B = 10% при P = 0,95).

Если величина расхождения (A) превышает 10%, делают вывод о невозможности применения градуировочной характеристики для дальнейших измерений. В этом случае выясняют и устраняют причины нестабильности градуировочной характеристики и повторяют контроль ее стабильности с использованием других градуировочных растворов цифлуфенамида, предусмотренных МВИ. При повторном обнаружении нестабильности градуировочной характеристики устанавливают ее заново согласно п. 7.3.

Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом добавок.

Величина добавки C_д должна удовлетворять условию:

где - характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой соответственно) мг/кг, при этом:

где - граница абсолютной погрешности, мг/кг:

где - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

Результат контроля процедуры К_к рассчитывают по формуле:

где , , C_д - среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки соответственно, мг/кг.

Норматив контроля К рассчитывают по формуле:

Проводят сопоставление результата контроля процедуры (К_к) с нормативом контроля (К).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (3) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (3) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), не должно превышать предела воспроизводимости (R):

где X₁, X₂ - результаты измерений, выполненных в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), мг/кг;

R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.