"МУК 4.1.3330-15. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств зоксамида в воде, почве, ягодах и соке винограда методом капиллярной газожидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 28.12.2015)

1. Разработаны ФГБНУ "Всероссийский научно-исследовательский институт фитопатологии" (Л.В. Дубовая, А.М. Макеев).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 17 декабря 2015 г. N 2).

3. Утверждены руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 28 декабря 2015 г.

4. Введены впервые.

Свидетельство о метрологической аттестации от 13.11.2015 N РОСС RU.0001.310430/0240.13.11.15.

Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода капиллярной газожидкостной хроматографии для определения массовой концентрации зоксамида в воде в диапазоне 0,0002 - 0,002 мг/дм³, массовой доли в почве в диапазоне 0,01 - 0,1 мг/кг, в ягодах и соке винограда в диапазоне 0,02 - 0,2 мг/кг.

Методические указания носят рекомендательный характер.

Название действующего вещества по ИСО: зоксамид.

Название действующего вещества по ИЮПАК: (RS)-3,5-дихлор-N-(3-хлор-1-этил-1-метил-2-оксопропил)-п-толуамид.

Эмпирическая формула: C₁₄H₁₆Cl₃NO₂.

Молекулярная масса: 336,6.

Белый порошок. Температура плавления: 159,5 - 160,5 °C. Давление паров при 25 °C: 1,3 x 10^-2 мПа. Коэффициент распределения н-октанол/вода: K_ow log P = 3,76. Растворимость (г/дм³) при 20 °C: ацетон - 55,7; этилацетат - 20,0; ксилол - 1,56; гептан - 0,038; растворимость в воде - 0,681 мг/дм³.

Вещество гидролитически нестабильно в кислой (DT₅₀ = 15 дней при pH 4 и 7) и щелочной (DT₅₀ = 8 дней при pH 9) средах.

В присутствии света в водных фотолитических условиях зоксамид разрушается с периодом полураспада 7,8 дня. В почве фунгицид достаточно быстро разрушается (DT₅₀ = 2 - 10 дней).

Острая пероральная токсичность (LD₅₀) для крыс - более 5 000 мг/кг; острая дермальная токсичность (LD₅₀) для крыс - более 2 000 мг/кг; острая ингаляционная токсичность (LC₅₀) для крыс - более 5 300 мг/м³ воздуха.

Зоксамид не оказывает раздражающего действия на кожу и слизистую оболочку глаз, не обладает эмбриотоксическим или тератогенным действием. LC₅₀ для рыб - 0,75 мг/дм³ (96 ч). Фунгицид нетоксичен для птиц, пчел, дождевых червей, почвенных микроорганизмов.

Зоксамид - контактно-системный фунгицид, проявляющий активность против грибов класса Оомицеты. Применяется в составе смесевых препаратов для обработки посадок картофеля и томатов против фитофтороза и виноградников против милдью при норме расхода 120 - 200 г д.в./га.

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций.

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительные интервалы среднего результата для всего диапазона измерений (n = 20) приведены в табл. 2.

Методика основана на определении зоксамида методом капиллярной газожидкостной хроматографии с использованием электронозахватного детектора после извлечения вещества из воды гексаном, из почвы и растительных образцов - водным раствором метанола, очистки экстрактов перераспределением в системе несмешивающихся растворителей и на колонке с силикагелем.

Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки.

Избирательность метода обеспечивается подбором хроматографической колонки и условий программирования температуры колонки.

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Примечание. Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией.

Примечание. Допускается использование вспомогательных средств измерений, устройств и материалов с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-09, а также требования, изложенные в технической документации на газовый хроматограф.

4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 и 2.2.5.2308-07. Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004-90.

4.3. При работе с газами, находящимися в баллонах под давлением до 15 МПа (150 кгс/см²), необходимо соблюдать "Правила устройства и безопасной эксплуатации стационарных компрессорных установок, воздухопроводов и газопроводов под давлением", ПБ-03-576-03. Запрещается открывать вентиль баллона, не установив на нем понижающий редуктор.

К выполнению измерений и обработке их результатов допускаются специалисты, имеющие опыт работы в химической лаборатории, прошедшие обучение и владеющие техникой проведения анализа, освоившие метод анализа и уложившиеся в нормативы контроля.

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 + 5) °C и относительной влажности не более 80%;

выполнение измерений на газовом хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Выполнению измерений предшествуют следующие операции: очистка органических растворителей (при необходимости), приготовление градуировочных растворов и раствора внесения, кондиционирование хроматографической колонки, установление градуировочной характеристики, подготовка колонки с силикагелем, проверка хроматографического поведения зоксамида на колонке.

Растворитель последовательно промывают порциями концентрированной серной кислоты до прекращения окрашивания последней в желтый цвет, затем водой до нейтральной реакции промывных вод, перегоняют над поташом.

Капиллярную кварцевую колонку устанавливают в термостат хроматографа и, не подсоединяя к детектору, кондиционируют при температуре 280 °C и скорости газа-носителя 2 см³/мин в течение 8 - 10 часов.

В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают (0,010 +/- 0,0001) г зоксамида, растворяют в 40 - 50 см³ ацетона, доводят этим же растворителем объем до метки, тщательно перемешивают.

Раствор хранят в морозильной камере при температуре не выше -12 °C не более 3 месяцев.

7.3.2. Градуировочный раствор зоксамида с массовой концентрацией 1 мкг/см³ (раствор N 1).

В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 1 см³ исходного градуировочного раствора флуопиколида с массовой концентрацией 100 мкг/см³ (п. 7.3.1), разбавляют ацетоном и доводят объем до метки. Этот раствор используют для приготовления градуировочных растворов N 2 - 5, а также для внесения в образцы воды, почвы и растительного материала при оценке полноты извлечения зоксамида.

Градуировочный раствор N 1 хранят при температуре не выше -12 °C не более месяца.

7.3.3. Градуировочные растворы зоксамида с массовой концентрацией 0,01 - 0,1 мкг/см³ (растворы N 2 - 5).

В 4 мерные колбы вместимостью 100 см³ помещают 1,0; 2,0; 5,0 и 10,0 см³ градуировочного раствора зоксамида с массовой концентрацией 1 мкг/см³ (п. 7.3.2), доводят объем раствора до метки ацетоном, тщательно перемешивают, получают градуировочные растворы N 2 - 5 с массовой концентрацией зоксамида 0,01; 0,02; 0,05 и 0,1 мкг/см³ соответственно. Растворы готовят непосредственно перед использованием.

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади пика (мВ·с) от массовой концентрации зоксамида в растворе (мкг/см³), устанавливают методом абсолютной градуировки по 4 градуировочным растворам.

В инжектор хроматографа вводят по 1 мм³ каждого градуировочного раствора (п. 7.3.3) и анализируют при условиях хроматографирования по п. 9.4. Осуществляют не менее 3 параллельных измерений. Расхождение между параллельными определениями не должно превышать предел повторяемости r.

По полученным данным строят градуировочную характеристику.

7.5.1. Смесь гексан-ацетон (объемное соотношение 9:1). В мерную колбу вместимостью 250 см³ помещают 25 см³ ацетона, доводят до метки гексаном, перемешивают. Срок хранения раствора - 1 неделя.

7.5.2. Смесь гексан-ацетон (объемное соотношение 8:2). В мерную колбу вместимостью 250 см³ помещают 50 см³ ацетона, доводят до метки гексаном, перемешивают. Срок хранения раствора - 1 неделя.

Нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см и внутренним диаметром 8 - 10 мм уплотняют тампоном из стекловаты, медленно выливают в колонку (при открытом кране) суспензию 3 г силикагеля в 15 см³ гексана. Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента и помещают на него слой безводного сульфата натрия высотой 1 см. Колонку последовательно промывают 20 см³ ацетона и 10 см³ гексана со скоростью 1 - 2 капли в секунду, после чего она готова к работе.

При отработке методики или поступлении новой партии силикагеля или растворителей проводят определение объема элюента, необходимого для полного вымывания зоксамида из колонки с силикагелем.

В круглодонную колбу вместимостью 10 см³ помещают 0,1 см³ градуировочного раствора зоксамида с массовой концентрацией 1 мкг/см³ в ацетоне (п. 7.3.2) и отдувают растворитель током теплого воздуха. Остаток растворяют в 2 см³ смеси гексан-ацетон (9:1, по объему), помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин. Раствор наносят на колонку с силикагелем, подготовленную по п. 7.6. Пропускают через колонку 30 см³ гексана со скоростью 1 - 2 капли в секунду, элюат отбрасывают. Затем колонку промывают 40 см³ смеси гексан-ацетон (8:2, по объему), отбирая последовательно по 5 см³ элюата. Каждую фракцию упаривают досуха, остатки растворяют в 1 см³ ацетона, помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин, и анализируют на содержание зоксамида по п. 9.4.

По результатам обнаружения зоксамида в каждой из фракций определяют объем смеси гексан-ацетон (8:2, по объему), необходимый для полного вымывания вещества из колонки.

Примечание. Проверку хроматографического поведения зоксамида следует проводить в обязательном порядке, поскольку профиль вымывания вещества может изменяться при использовании новой партии сорбентов и растворителей.

Отбор проб производят в соответствии с ГОСТ 31861-12 "Вода. Общие требования к отбору проб", ГОСТ 17.4.3.01-83 "Охрана природы. Почвы. Общие требования к отбору проб", ГОСТ 28168-89 "Почвы. Отбор проб", ГОСТ 25896-83 "Виноград свежий столовый. Технические условия", ГОСТ 26313-84 "Продукты переработки плодов и овощей. Правила приемки, методы отбора проб" и "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (N 2051-79 от 21.08.79).

Отобранные образцы воды хранят в стеклянной или полиэтиленовой таре в холодильнике не более суток. Почву подсушивают в темноте до постоянного веса и хранят в защищенном от света месте при комнатной температуре не более недели; для длительного хранения образцы замораживают и хранят при температуре -18 °C. Пробы ягод винограда хранят в стеклянной или полиэтиленовой таре в холодильнике в темноте не более 5 дней; для длительного хранения образцы замораживают и хранят при температуре -18 °C. Отобранные пробы сока хранят в стеклянной или полиэтиленовой таре в холодильнике в темноте не более 3 дней; для длительного хранения образцы замораживают и хранят при температуре не выше -18 °C.

В мерную колбу вместимостью 500 см³ помещают 100 см³ деионизованной воды и доводят объем раствора в колбе до метки метанолом, перемешивают.

Срок хранения раствора - 1 неделя.

9.1.1. Вода. Образец отфильтрованной воды объемом 100 см³ помещают в делительную воронку вместимостью 250 см³. В воронку вносят 30 см³ гексана, интенсивно встряхивают в течение 2 мин. После разделения фаз верхний гексановый слой отделяют, фильтруют через слой безводного сульфата натрия в круглодонную колбу вместимостью 100 см³. Операцию экстракции водной фазы повторяют еще дважды, используя 30 и 20 см³ гексана. Объединенную органическую фазу, пропущенную через слой сульфата натрия, упаривают досуха на роторном вакуумном испарителе при температуре не выше 40 °C. Остаток в колбе растворяют в 2 см³ ацетона и анализируют на содержание зоксамида по п. 9.4. В случае сильного загрязнения образцов воды проводят дополнительную очистку экстракта по п. 9.3.

9.1.2. Почва. Образец воздушно-сухой почвы массой 20 г помещают в плоскодонную колбу вместимостью 250 см³, прибавляют туда 10 см³ деионизованной воды и выдерживают 10 мин при комнатной температуре. Зоксамид экстрагируют 90 см³ водного раствора метанола с объемной долей 80% в течение 30 мин на аппарате для встряхивания. Суспензию фильтруют под вакуумом на воронке Бюхнера через бумажный фильтр в колбу Бунзена вместимостью 250 см³. Осадок на фильтре возвращают в колбу, повторно экстрагируют 60 см³ указанного выше растворителя в течение 30 мин при встряхивании и суспензию фильтруют. Осадок на фильтре промывают 20 см³ водного раствора метанола. Экстракты и промывную жидкость переносят в мерный цилиндр вместимостью 250 см³ с пришлифованной пробкой, перемешивают и доводят общий объем раствора в цилиндре до 200 см³ водным раствором метанола с объемной долей 80%. Аликвоту раствора объемом 50 см³, эквивалентную 5 г образца, переносят в круглодонную колбу вместимостью 100 см³. Дальнейшую очистку экстракта проводят по п. 9.2.

9.1.3. Ягоды. Образец измельченных ягод массой 20 г помещают в стакан гомогенизатора вместимостью 500 см³, добавляют 100 см³ ацетона и гомогенизируют 3 мин при 8 000 об./мин. Гомогенат фильтруют под вакуумом на воронке Бюхнера через бумажный фильтр в колбу вместимостью 250 см³. Осадок на фильтре промывают 50 см³ ацетона. Экстракт и промывную жидкость переносят в мерный цилиндр вместимостью 250 см³, доводят общий объем раствора до 200 см³ ацетоном, перемешивают. Аликвоту раствора объемом 50 см³, эквивалентную 5 г образца, переносят в круглодонную колбу вместимостью 100 см³ и добавляют 15 см³ деионизованной воды. Дальнейшую очистку экстракта проводят по п. 9.2.

9.1.4. Сок. Образец сока массой 20 г помещают в мерный цилиндр с пришлифованной пробкой на 100 см³, приливают деионизованную воду до метки и перемешивают. Аликвоту раствора объемом 25 см³, эквивалентную 5 г образца, переносят в делительную воронку вместимостью 100 см³, приливают 10 см³ насыщенного раствора хлорида натрия и 30 см³ гексана, интенсивно встряхивают в течение 2 мин. После разделения фаз верхний органический слой фильтруют через слой безводного сульфата натрия в круглодонную колбу вместимостью 100 см³. Операцию экстракции водной фазы повторяют еще дважды, используя 30 и 20 см³ гексана. Объединенную органическую фракцию, пропущенную через слой безводного сульфата натрия, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 40 °C. Далее проводят очистку экстракта по п. 9.3.

Отобранные экстракты почвы и ягод, полученные по п. 9.1.2 и 9.1.3 и помещенные в круглодонные колбы, упаривают на ротационном вакуумном испарителе до водного остатка (4 - 8 см³) при температуре не выше 40 °C. Водный остаток переносят в делительную воронку вместимостью 100 см³. Колбу ополаскивают 20 см³ деионизованной воды, которые также помещают в делительную воронку. В воронку вносят 30 см³ гексана, интенсивно встряхивают в течение 2 мин. После разделения фаз верхний органический слой фильтруют через слой безводного сульфата натрия в круглодонную колбу вместимостью 100 см³. Операцию экстракции водной фазы проводят еще дважды, используя 30 и 20 см³ гексана. Объединенную органическую фазу, пропущенную через слой сульфата натрия, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 40 °C и подвергают дополнительной очистке на колонке с силикагелем по п. 9.3.

Остаток в круглодонной колбе, полученный по п. 9.1.4 и 9.2, растворяют в 2 см³ смеси гексан-ацетон (9:1, по объему), помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин. Раствор наносят на колонку, подготовленную по п. 7.6. Колбу обмывают 2 см³ гексана, которые также наносят на колонку. Промывают колонку 25 см³ гексана со скоростью 1 - 2 капли в секунду, элюат отбрасывают. Зоксамид элюируют с колонки 30 см³ смеси гексан-ацетон (8:2, по объему), собирая элюат непосредственно в круглодонную колбу вместимостью 100 см³. Раствор упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 40 °C. Сухие остатки экстрактов почвы растворяют в 5 см³, а ягод и сока в 10 см³ ацетона, помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин, и растворы анализируют на содержание зоксамида по п. 9.4.

Газовый хроматограф с электронозахватным детектором, снабженный приспособлениями для капиллярной колонки.

Хроматографическая кварцевая капиллярная колонка длиной 30 м, внутренним диаметром 0,32 мм с нанесенной пленкой диметилполисилоксана толщиной 0,5 мкм.

Температура термостата колонки программированная. Начальная температура - 190 °C, выдержка 1 мин; нагрев со скоростью 25 градусов в минуту до температуры 245 °C, выдержка 0 мин; нагрев со скоростью 3 градуса в минуту до 255 °C, выдержка 5 мин; нагрев со скоростью 20 градусов в минуту до 280 °C, выдержка 5 мин.

Деление потока: 1:4.

Объем вводимой пробы: 1 мм³.

Линейный диапазон детектирования: 0,01 - 0,1 нг.

Образцы, дающие пики, большие, чем градуировочный раствор с концентрацией 0,1 мкг/см³, разбавляют ацетоном.

Содержание зоксамида в пробе (X, мг/дм³, мг/кг) рассчитывают методом абсолютной калибровки по формуле:

где C - концентрация зоксамида, найденная по градуировочной характеристике в соответствии с величиной площади хроматографического пика, мкг/см³;

V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, см³;

m - масса анализируемой части образца, соответствующая доле экстракта, использованной для очистки на колонке с силикагелем и последующего хроматографического определения (см³, г).

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предел повторяемости:

где X₁, X₂ - результаты параллельных определений, мг/дм³, мг/кг;

r - значение предела повторяемости (табл. 1), при этом .

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

Результат анализа представляют в виде:

где - среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

- граница абсолютной погрешности, мг/дм³, мг/кг:

где - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

В случае, если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание зоксамида в пробах воды - менее 0,0002 мг/дм³" <*>;

"содержание зоксамида в пробах почвы - менее 0,01 мг/кг" <**>;

"содержание зоксамида в пробах ягод и сока - менее 0,02 мг/кг" <***>.

--------------------------------

<*> 0,0002 мг/дм³ - предел обнаружения;

<**> 0,01 мг/кг - предел обнаружения;

<***> 0,02 мг/кг - предел обнаружения.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1 - 6-02 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

13.1. Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят в начале и по окончании каждой серии опытов.

При контроле стабильности градуировочной характеристики проводят измерения не менее двух образцов концентраций для градуировки, содержание зоксамида в которых должно охватывать весь диапазон от 0,01 до 0,1 мкг/см³.

Градуировочная характеристика считается стабильной, если для каждого градуировочного раствора, используемого для контроля, сохраняется соотношение:

где X - содержание зоксамида в пробе при контрольном измерении, мкг;

C - известное содержание зоксамида в градуировочном растворе, взятом для контроля стабильности градуировочной характеристики, мкг;

B - норматив контроля погрешности градуировочной характеристики, % (равен 10% при P = 0,95).

Если величина расхождения (A) превышает 10%, делают вывод о невозможности применения градуировочной характеристики для дальнейших измерений. В этом случае выясняют и устраняют причины нестабильности градуировочной характеристики и повторяют контроль ее стабильности с использованием других градуировочных растворов зоксамида, предусмотренных МВИ. При повторном обнаружении нестабильности градуировочной характеристики устанавливают ее заново согласно п. 7.3.

Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.

Величина добавки C_д должна удовлетворять условию:

где - характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой соответственно), мг/кг.

Допустимо характеристику погрешности результатов анализа при внедрении методики в лаборатории устанавливать на основе выражения , с последующим уточнением по мере накопления информации,

где - граница абсолютной погрешности, мг/дм³, мг/кг:

где - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

Контроль проводят путем сравнения результата контрольной процедуры К_к с нормативом контроля К.

Результат контрольной процедуры К_к рассчитывают по формуле:

где , , C_д - среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки соответственно, мг/дм³, мг/кг.

Норматив контроля К рассчитывают по формуле:

Проводят сопоставление результата контрольной процедуры (К_к) с нормативом контроля (К).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (3) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (3) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), не должно превышать предел воспроизводимости (R):

где X₁, X₂ - результаты измерений, выполненных в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), мг/дм³, мг/кг;

R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.