"МУК 4.1.3482-17. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Измерение массовой концентрации витамина K1 в сыворотке крови методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 15.06.2017)

1. Подготовлены коллективом авторов ФГБНУ "Восточно-Сибирский институт медико-экологических исследований", Федеральным бюджетным учреждением науки ФНЦ "Федеральный научный центр медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения", ФБУН "Нижегородский НИИ гигиены и профпатологии" Роспотребнадзора, ФБУЗ "Федеральный центр гигиены и эпидемиологии" Роспотребнадзора.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 22 декабря 2016 г. N 2).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 15 июня 2017 г.

4. Введены впервые.

Методические указания разработаны ФБУН "Нижегородский НИИ гигиены и профпатологии" Роспотребнадзора (Соколова О.В., Потапова И.А.).

Включенные в сборник 9 методических указаний по определению химических соединений в биологических средах, объектах окружающей среды и молочной продукции предназначены для использования в химико-аналитических исследованиях при проведении биомониторинга состояния здоровья населения, для практического использования в рамках социально-гигиенического мониторинга на территориях с высокой антропогенной нагрузкой, а также могут быть использованы для диагностических целей в рамках осуществления государственного санитарного надзора, контроля, экспертизы, расследований. Методические указания предназначены для специалистов химико-аналитических лабораторий системы Роспотребнадзора, научно-исследовательских институтов, работающих в области экологии человека, гигиены окружающей среды и защиты прав потребителей.

Методические указания, включенные в сборник, разработаны и подготовлены в соответствии с требованиями ГОСТ Р 8.563-96 "Государственная система обеспечения единства измерений. Методики выполнения измерений", ГОСТ Р 1.5-92 "ГСС. Общие требования к построению, изложению, оформлению и содержанию стандартов", МИ 2335-95 "Внутренний контроль качества результатов количественного химического анализа", МИ 2336-95 "Характеристики погрешности результатов количественного химического анализа. Алгоритм оценивания".

Все методики измерения прошли метрологическую аттестацию в соответствии с правилами ПР 50.2.002-94 "ГСИ. Порядок осуществления государственного метрологического надзора за выпуском, состоянием и применением средств измерений, аттестованными методиками выполнения измерений, эталонами и соблюдением метрологических правил и норм".

В методических указаниях, включенных в сборник, приведены методы определения 6 органических соединений в биологических средах (моча, кровь) и молочной продукции, 4 тяжелых металлов в молочной продукции и 20 тяжелых металлов и элементов в атмосферном воздухе. Определение токсичных веществ и элементов основано на использовании современных высокочувствительных методов физико-химического анализа - капиллярной газожидкостной хроматографии, хромато-масс-спектрометрии, масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой, высокоэффективной жидкостной хроматографии, потенциометрии с применением ионселективного электрода.

Методические указания рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

Свидетельство о метрологической аттестации N РОСС RU.0001.310430/0200.10.07.14 от 10.07.2014.

Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии для измерения массовой концентрации витамина K₁ в сыворотке крови в диапазоне 2,5 - 44,0 нг/см³.

Методические указания носят рекомендательный характер.

Витамин K₁ - витамин коагуляции, антигеморрагический витамин, 2-метил-3-фитил-1,4-нафтохинон.

Структурная формула:

Эмпирическая формула: C₃₁H₄₆O₂.

Молекулярная масса: 450,7.

Регистрационный номер CAS: 84-80-0.

Физико-химические свойства. Светло-желтое маслянистое вещество, липофильно (жирорастворимо), гидрофобно, растворимо в хлороформе, диэтиловом эфире, этиловом спирте и других органических растворителях. Т_пл = -20 °C, Т_кип = 115 - 145 °C (в вакууме). Растворы поглощают УФ-лучи.

Метаболическая роль витамина K. Витамин K необходим, прежде всего, для механизмов свертывания и регуляции крови. Также витамин K играет важную роль в формировании и восстановлении костей, обеспечивает синтез белка костной ткани (остеокальцина), на котором кристаллизуется кальций. Он способствует предупреждению остеопороза, участвует в регуляции окислительно-восстановительных процессов в организме. Дефицит витамина K в организме приводит к развитию геморрагического синдрома, который проявляется внутрикожными и подкожными кровоизлияниями, кровоточивостью десен, носовыми и желудочно-кишечными кровотечениями.

Витамин K представлен в природе двумя формами: растительным филлохиноном (K₁) и менахиноном (K₂), синтезируемым бактериями и образующимся из формы K₁. Биомаркерами витамина K являются концентрация филлохинона (витамина K₁) в плазме крови и процент некарбоксилированного остеокальцина в плазме крови.

Физиологическая функция витамина K заключается в образовании дополнительных карбоксильных групп в протромбине, проконвертине и других белковых факторов, которые вместе с ионами кальция инициируют процесс образования тромбина. Ферментативное действие тромбина на первом этапе способствует превращению растворимого в плазме белка фибриногена в мономерную форму белка фибрина, на следующем этапе образованию регулярной структуры растворимого фибрин-полимера. Образованный рыхлый сгусток под воздействием фибринстабилизирующего фактора свертывания крови, тромбина и ионов кальция превращается в нерастворимый фибрин, стабилизирующий структуру сгустка, необходимого для прекращения кровотечения.

Нормальный уровень содержания витамина K₁ в сыворотке крови составляет 5,0 - 30,0 нг/см³.

Содержание в продуктах питания. Витамин K₁ содержится в большом перечне пищевых источников растительной природы, включая зеленые овощи (брокколи, шпинат, капуста белокочанная, фасоль и др.), в которых он находится в комплексе с хлорофиллом, и некоторые растительные масла (соевое, хлопковое, оливковое, рапсовое). Гидрогенизация масел приводит к снижению биодоступности и биоэффективности витамина. В молоке, яйцах, рыбе, мясе и зерновых продуктах его содержание не превышает 7 мкг в 100 г съедобной части. Кулинарные потери при тепловой обработке продуктов незначительны.

Нормы потребления. Установленный уровень потребления витамина K в разных странах варьируется от 55 до 120 мкг/сутки, а физиологическая потребность для взрослых - 120 мкг/сутки, для детей - от 30 до 75 мкг/сутки.

Нормы погрешности измерений массовой концентрации витамина K₁ в сыворотке крови в нормативной документации не регламентированы.

При соблюдении всех регламентируемых условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерения при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующего диапазона массовых концентраций витамина K₁ в сыворотке крови.

Значения показателя точности используют:

- при оформлении результатов измерений, выдаваемых лабораторией;

- при оценке деятельности лабораторий по вопросу качества проведения измерений;

- при оценке возможности использования результатов измерений при реализации методики измерений в конкретной лаборатории.

Выполнение измерений массовой концентрации витамина K₁ в сыворотке крови проводят методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с использованием спектрофотометрического детектора и предварительным проведением экстракции витамина из сыворотки гексаном, высушивания гексанового экстракта, растворения высушенного остатка в элюенте. Идентификация витамина осуществляется по времени удерживания. Количественное определение витамина K₁ проводится методом абсолютной градуировки.

Измерению не мешают другие компоненты матрицы сыворотки, в частности, витамины A и E.

При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства, материалы и реактивы.

Примечание. Допускается использование средств измерений с аналогичными или лучшими характеристиками.

Примечание. Допускается использование других реактивов с аналогичной или более высокой квалификацией, не требующих дополнительной очистки растворителей.

Примечание. Допускается применение оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4.1. При выполнении измерений соблюдают требования безопасности, установленные для работы с токсичными, едкими и легковоспламеняющимися веществами по ГОСТ 12.1.005-88 и по ГОСТ 12.1.007-76.

4.2. При работе с легковоспламеняющимися веществами необходимо соблюдать меры противопожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91. Должны быть в наличии средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83.

4.3. При выполнении измерений на жидкостном хроматографе необходимо соблюдать правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ Р 12.1.019-09 и инструкцией по эксплуатации прибора.

4.4. При работе со сжатыми газами необходимо соблюдать Федеральные нормы и правила в области промышленной безопасности "Правила промышленной безопасности опасных производственных объектов, на которых используется оборудование, работающее под избыточным давлением" (утв. Ростехнадзором приказом от 25.03.2014 N 116) и ГОСТ 12.2.085-02. Запрещается открывать вентиль баллона, не установив на нем понижающий редуктор.

4.5. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией. Содержание вредных веществ в воздухе рабочей зоны не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 (ГН 2.2.5.2308-07).

4.6. Необходимо провести обучение работающих безопасности труда согласно ГОСТ 12.0.004-90.

Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист, имеющий опыт работы на жидкостном хроматографе, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений.

6.1. При выполнении измерений в лаборатории должны быть выполнены следующие условия:

- температура воздуха: (20 +/- 5) °C;

- атмосферное давление: 84 - 106 кПа (630 - 800 мм рт. ст.);

- относительная влажность воздуха: не более 80%.

6.2. Выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят при следующих условиях:

- напряжение питания: (220 +/- 10) В;

- частота переменного тока: (50 +/- 10) Гц.

6.3. Выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в соответствии с руководством по эксплуатации используемого оборудования.

6.4. Для предотвращения разрушения витамина K₁ анализ сыворотки и стандартов проводят, предохраняя пробы от попадания прямого солнечного света и воздействия повышенных температур. Анализ сыворотки крови необходимо проводить в течение 2 - 6 часов после забора крови.

При подготовке к выполнению измерений проводят следующие работы: подготовка хроматографических колонок, приготовление растворов, установление градуировочной характеристики, отбор и подготовку крови для анализа.

На хроматограф последовательно устанавливают предколонку, колонку.

Перед проведением измерения необходимо установить скорость подачи элюента 1 см³/мин до установления равновесия в колонке, которое определяется по стабильности нулевой линии детектора.

Элюент для хроматографии - метанол:ацетонитрил:хлористый:метилен (45:50:5). В мерную колбу вместимостью 500 см³ помещают 250 см³ ацетонитрила, 25 см³ хлористого метилена и доводят объем смеси до метки метанолом. Раствор тщательно перемешивают, дегазируют фильтрованием через воронку Шотта в колбу Бунзена, присоединенную к вакуумному насосу (или дегазируют с помощью блока автоматической дегазации и фильтрации растворителя). Срок хранения полученного раствора в холодильнике при температуре 2 - 8 °C в темной посуде 1 год.

Раствор А - основной раствор с массовой концентрацией витамина K₁ 220 мкг/см³. В мерную колбу вместимостью 25 см³ вносят около 1/3 объема этилового спирта, закрывают пробкой и взвешивают, затем иглой вносят каплю (0,0038 г) витамина K₁ и снова взвешивают. Тщательно перемешивают до полного растворения витамина, доводят до метки этиловым спиртом, затем содержимое вновь перемешивают. Полученный раствор хранят в холодильнике при температуре 2 - 8 °C в темной посуде не более 6 месяцев.

Раствор Б с массовой концентрацией витамина K₁ 0,22 мкг/см³. В мерную колбу вместимостью 25 см³ с помощью дозатора вносят 0,025 см³ раствора А, доводят этиловым спиртом до метки и содержимое тщательно перемешивают. Полученный раствор хранят в холодильнике при температуре 2 - 8 °C не более 2 месяцев.

Рабочие градуировочные растворы. В мерные колбы вместимостью 10 см³ сначала вносят 2 - 3 см³ этилового спирта, затем с помощью дозатора вносят определенный объем раствора Б, в соответствии с табл. 2, и добавляют этиловый спирт до метки, содержимое тщательно перемешивают. Срок хранения в холодильнике при температуре 2 - 8 °C не более 2 недель.

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость величины аналитического сигнала от массовой концентрации витамина K₁ (нг/см³), устанавливают путем измерения высот пиков витамина K₁ в градуировочных растворах, приготовленных по п. 7.2.

Каждый из градуировочных растворов в количестве 0,5 см³ шприцем вводят в хроматографическую систему, с помощью петлевого дозатора отсекается по 0,1 см³, которые анализируются без термостатирования колонки в следующих условиях:

Для каждого анализируемого раствора проводят 5 параллельных измерений. По средним арифметическим значениям из пяти результатов измерения высот пиков в программе сбора и обработки хроматографических данных строится градуировочный график в координатах: "концентрация витамина (C_пр), нг/см³" - "высота пика витамина (H), мВ". Различие между измеренными значениями аналитических сигналов и времен удерживания не должно превышать 5% от средних значений. Линейная зависимость должна соблюдаться во всем диапазоне определяемых концентраций.

Венозную кровь отбирают в количестве 5 см³ утром натощак. Для получения сыворотки кровь термостатируют в течение 30 мин при 37 °C, затем аккуратно обводят по всему радиусу пробирки стеклянной палочкой и центрифугируют в течение 15 мин со скоростью 3 000 об./мин. Далее сыворотку (верхний слой) отделяют в пробирки типа Эппендорф и используют для анализа.

В центрифужные стеклянные пробирки с притертой пробкой помещают по 0,8 см³ сыворотки, добавляют равное количество этилового спирта (для осаждения белка), встряхивают в течение 2 - 3 с на встряхивателе со скоростью вращения гнезда 2 000 об./мин. Затем к смеси добавляют 0,8 см³ гексана, пробирки плотно закрывают пробкой и перемешивают в течение 15 мин на перемешивающем устройстве, при этом пробирки закрывают черной бумагой для предотвращения прямого воздействия света. Далее пробы центрифугируют в течение 10 мин со скоростью 3 000 об./мин. Аликвоты гексановых экстрактов в количестве 0,5 см³ переносят в пробирки типа Эппендорф и упаривают в токе азота досуха. Остатки растворяют в 0,5 см³ элюента. Для каждой пробы выполняют два параллельных измерения.

Примечание. Процедуры перемешивания и центрифугирования необходимо проводить в темноте, при охлаждении.

После выхода хроматографа на режим в дозирующее устройство прибора микрошприцем вводят 0,5 см³ одного из градуировочных растворов (обычно с концентрацией, лежащей в середине рабочего диапазона) и анализируют в условиях, указанных в п. 7.3. По окончании хроматографического анализа определяют время удерживания витамина K₁ и высоту пика. Далее величина высоты полученного пика наносится на градуировочный график (с целью корректировки градуировочной характеристики).

Затем в дозирующее устройство вводят 0,5 см³ анализируемого раствора и так же анализируют в условиях, указанных в п. 7.3. По окончании хроматографического анализа проводят ручную разметку пиков и идентификацию обнаруженных пиков. Витамин K₁ идентифицируют по времени удерживания: совпадение времени удерживания витамина K₁ в пробе с временем удерживания витамина K₁ в градуировочном растворе (с ошибкой не более 5%) свидетельствует о правильной идентификации.

Количественный расчет массовой концентрации витамина K₁ осуществляют с помощью программы сбора и обработки хроматографических данных. Используют метод абсолютной градуировки. При этом концентрация витамина K₁ в пробе (C_пр, нг/см³) считается автоматически.

Вычисляют среднее арифметическое двух параллельных измерений C_пр1, C_пр2, расхождение между которыми не должно превышать 5% от среднего значения:

C_пр - массовая концентрация витамина K₁, в сыворотке крови, нг/см³.

Результат считают удовлетворительным, если выполняется следующее неравенство:

C_max и C_min - максимальный и минимальный результат единичных измерений;

r - предел повторяемости (допускаемое расхождение между результатами единичных измерений), %.

Значения предела повторяемости r представлены в табл. 1.

При превышении предела повторяемости определение повторяют. При повторном превышении норматива повторяемости выясняют причины, приводящие к получению неудовлетворительных результатов, и устраняют их.

Результат количественного анализа "C", нг/см³ представляют в виде:

C - среднее арифметическое результатов параллельных определений, признанных приемлемыми, нг/см³;

- относительная погрешность определения массовой концентрации витамина K₁, %, приведенная в табл. 1.

Примечание. Числовые значения результата измерений оканчиваются цифрой того же разряда, что и значение показателя точности методики измерений (абсолютной погрешности измерений массовой доли определяемого компонента).

Контроль стабильности градуировочной характеристики проводится каждый раз перед началом анализа и через каждые пять проб по раствору стандартного образца. Рекомендуется, чтобы концентрация уточняющего стандарта находилась примерно в середине диапазона концентраций, в котором предполагается проводить измерения, в случае же если он заранее неизвестен, то в середине диапазона градуировочного графика.

Контроль стабильности градуировочной характеристики осуществляется путем сравнения данных о содержании витамина K₁, полученных с помощью градуировочной характеристики, с реальным содержанием витамина K₁ в контрольном растворе.

Стабильность градуировочной характеристики считают удовлетворительной, если для контрольной точки выполняется следующее условие:

C_о - C_г - расхождение между аттестованным значением массовой концентрации раствора стандартного образца и концентрацией, определенной с помощью градуировочной характеристики, нг/см³;

C_о - концентрация раствора, приготовленного из ГСО, нг/см³;

C_г - массовая концентрация витамина K₁, определенная по градуировочной характеристике, нг/см³;

К_г - норматив контроля стабильности градуировочной характеристики: , где

- показатель воспроизводимости, приведен в табл. 1.

Градуировочная характеристика считается стабильной, если отклонение не превышает +/- К_г. Если условие не выполняется, эксперимент повторяют. Если результат повторного сравнения неудовлетворителен, то выясняют причины, приводящие к получению неудовлетворительных результатов контроля, и устраняют их. В случае невозможности устранения причин, приводящих к превышению норматива контроля стабильности градуировочной характеристики, градуировку проводят заново.

Для контроля внутрилабораторной прецизионности используют рабочие пробы. Две параллельные пробы анализируют в соответствии с прописью методики, максимально варьируя условия проведения анализа, т.е. в разное время, разными исполнителями, с использованием разных наборов посуды.

Внутрилабораторную прецизионность результатов измерений считают удовлетворительной, если расхождение между результатами анализа, полученными в одной лаборатории (в разное время, разными исполнителями, с использованием разных партий средств измерений) не превышает предела внутрилабораторной прецизионности R_л = 0,84 R:

C_max, C_min - максимальный и минимальный результаты анализа при контроле внутрилабораторной прецизионности, нг/см³;

C_max - C_min - фактическое расхождение между результатами анализа, нг/см³;

R - предел прецизионности, приведенный в табл. 1.

При удовлетворительных результатах контроля внутрилабораторной прецизионности приемлемы оба результата анализа, а в качестве окончательного может быть использовано их среднее арифметическое значение.

При превышении предела внутрилабораторной прецизионности R_л могут быть использованы методы оценки приемлемости результатов анализа согласно раздела 5 ГОСТ Р ИСО 5725-6.

Контроль точности результатов измерений проводят методом добавок в рабочие сыворотки крови.

Отобранную сыворотку крови делят на две части, первую из которых анализируют в точном соответствии с прописью методики и получают результат определения витамина K₁ в пробе (C), нг/см³. Во вторую часть вносят добавку (C_д) определяемого элемента, используя стандартные растворы. Содержание добавки должно составлять 50 - 150% от содержания витамина K₁ в пробе.

Результат контроля считается удовлетворительным при выполнении условия:

C' - результат определения массовой концентрации витамина K₁ в пробе с добавкой, нг/см³;

C - результат определения массовой концентрации витамина K₁ в рабочей пробе без добавки, нг/см³;

C_д - действительное содержание элемента в добавке к пробе, рассчитанное исходя из значения его содержания в стандартном образце, нг/см³.

К_д - норматив оперативного контроля точности.

Норматив оперативного контроля точности рассчитывают по формуле:

и - абсолютные погрешности определения массовой концентрации витамина K₁ в пробе (C) и в пробе с добавкой (C') соответственно. Значения и рассчитывают по формулам:

- относительная погрешность определения массовой концентрации витамина K₁, приведенная в табл. 1.