"МУК 4.1.3479-17. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Измерение массовых концентраций N-нитрозоаминов (N-нитрозодиметиламин, N-нитрозодиэтиламин) в крови методом капиллярной газовой хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 15.06.2017)

1. Подготовлены коллективом авторов ФГБНУ "Восточно-Сибирский институт медико-экологических исследований", Федеральным бюджетным учреждением науки ФНЦ "Федеральный научный центр медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения", ФБУН "Нижегородский НИИ гигиены и профпатологии" Роспотребнадзора, ФБУЗ "Федеральный центр гигиены и эпидемиологии" Роспотребнадзора.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 22 декабря 2016 г. N 2).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 15 июня 2017 г.

4. Введены впервые.

Методические указания разработаны Федеральным бюджетным учреждением науки ФНЦ "Федеральный научный центр медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения" (Уланова Т.С., Зайцева Н.В., Нурисламова Т.В., Попова Н.А., Мальцева О.А., Терентьев Г.И.).

Включенные в сборник 9 методических указаний по определению химических соединений в биологических средах, объектах окружающей среды и молочной продукции предназначены для использования в химико-аналитических исследованиях при проведении биомониторинга состояния здоровья населения, для практического использования в рамках социально-гигиенического мониторинга на территориях с высокой антропогенной нагрузкой, а также могут быть использованы для диагностических целей в рамках осуществления государственного санитарного надзора, контроля, экспертизы, расследований. Методические указания предназначены для специалистов химико-аналитических лабораторий системы Роспотребнадзора, научно-исследовательских институтов, работающих в области экологии человека, гигиены окружающей среды и защиты прав потребителей.

Методические указания, включенные в сборник, разработаны и подготовлены в соответствии с требованиями ГОСТ Р 8.563-96 "Государственная система обеспечения единства измерений. Методики выполнения измерений", ГОСТ Р 1.5-92 "ГСС. Общие требования к построению, изложению, оформлению и содержанию стандартов", МИ 2335-95 "Внутренний контроль качества результатов количественного химического анализа", МИ 2336-95 "Характеристики погрешности результатов количественного химического анализа. Алгоритм оценивания".

Все методики измерения прошли метрологическую аттестацию в соответствии с правилами ПР 50.2.002-94 "ГСИ. Порядок осуществления государственного метрологического надзора за выпуском, состоянием и применением средств измерений, аттестованными методиками выполнения измерений, эталонами и соблюдением метрологических правил и норм".

В методических указаниях, включенных в сборник, приведены методы определения 6 органических соединений в биологических средах (моча, кровь) и молочной продукции, 4 тяжелых металлов в молочной продукции и 20 тяжелых металлов и элементов в атмосферном воздухе. Определение токсичных веществ и элементов основано на использовании современных высокочувствительных методов физико-химического анализа - капиллярной газожидкостной хроматографии, хромато-масс-спектрометрии, масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой, высокоэффективной жидкостной хроматографии, потенциометрии с применением ионселективного электрода.

Методические указания рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

Свидетельство о метрологической аттестации N 88-16207-005-RA.RU.310657-2015 от 30.06.2015.

1.1. Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода капиллярной газовой хроматографии для измерения массовых концентраций N-нитрозоаминов (N-нитрозодиметиламин, N-нитрозодиэтиламин) в пробах крови в диапазоне концентраций от 0,002 до 0,1 мг/дм³.

1.2. Методические указания по измерению массовых концентраций N-нитрозоаминов (N-нитрозодиметиламин, N-нитрозодиэтиламин) в пробах крови предназначены для использования в санитарно-гигиенических, экологических, лечебных и научных организациях, осуществляющих деятельность в области профпатологии и экологии человека.

1.3. Методические указания носят рекомендательный характер.

N-нитрозоамины малоустойчивые вещества, стабильны только при температурах ниже 0 °C, являются жидкими или твердыми веществами желтого цвета.

N-нитрозоамины являются высокотоксичными соединениями и при попадании в организм поражают печень, вызывают кровоизлияния.

Большая часть N-нитрозоаминов обладает сильным канцерогенным действием даже при однократном действии, проявляет мутагенные свойства. N-нитрозодиметиламин обладает отдаленными эффектами: эмбриотропным, гонадотропным, мутагенным.

N-нитрозодиметиламин: CAS 62-75-9, формула C₂H₆N₂O/(CH₃)₂NN=O, молекулярная масса: 148,0, T_кип: 153 °C. Растворимость в воде хорошая, давление паров, Па, при 20 °C: 360, класс опасности: 1-й.

N-нитрозодиэтиламин: CAS 55-18-5, формула C₂H₆N₂O/(C₂H₅)₂NN=O, молекулярная масса: 176,0, T_кип: 175 °C, растворимость в воде, г/100 см³, при 20 °C: 10,6, класс опасности 1-й.

При соблюдении всех регламентированных условий и проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений не превышает значений, приведенных в табл. 1.

Значения показателя точности используют:

- при оформлении результатов измерений, выдаваемых лабораторией;

- при оценке деятельности лабораторий по вопросу качества проведения измерений;

- при оценке возможности использования результатов измерений при реализации методики измерений в конкретной лаборатории.

Измерение массовых концентраций N-нитрозоаминов (N-нитрозодиметиламин, N-нитрозодиэтиламин) в пробе крови выполняют газохроматографическим методом анализа с термоионным детектированием. Извлечение и концентрирование N-нитрозоаминов (N-нитрозодиметиламин, N-нитрозодиэтиламин) из проб крови проводят методом дистилляции с водяным паром в щелочной среде, концентрированием N-нитрозоаминов на картриджах с помощью системы твердофазной экстракции (ТФЭ) и последующим газохроматографическим анализом экстракта.

Определению не мешают углеводороды, спирты. Длительность измерений - 30 мин.

При выполнении измерений и подготовке проб применяют следующие средства измерений, реактивы, вспомогательные устройства и материалы:

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Примечание. Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией.

Примечание. Допускается использование вспомогательных устройств и материалов с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

6.1. При выполнении работ необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76.

6.2. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией и соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83.

6.3. При выполнении измерений с использованием газового хроматографа соблюдают правила электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ Р 12.1.019-09 и инструкцию по эксплуатации прибора.

6.4. При работе с сосудами, работающими под давлением необходимо соблюдать правила их устройства и безопасной эксплуатации в соответствии с Федеральными нормами и правилами в области промышленной безопасности "Правила промышленной безопасности опасных производственных объектов, на которых используется оборудование, работающее под избыточным давлением", утверждены Приказом Федеральной службы по экологическому, технологическому и атомному надзору от 25 марта 2014 г. N 116.

6.5. Содержание вредных веществ в воздухе рабочей зоны не должно превышать допустимых значений по ГОСТ 12.1.005-88, ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и ГН 2.2.5.2308-07.

6.6. Организуют обучение работающих безопасности труда по ГОСТ 12.0.004-90.

6.7. При работе с биологическими средами соблюдают санитарно-эпидемиологические правила СП 1.3.2322-08.

Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист, имеющий опыт работы на газовом хроматографе, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений.

При приготовлении градуировочных растворов и подготовке проб к анализу соблюдают следующие условия:

- температура окружающего воздуха: (20 +/- 5) °C;

- атмосферное давление: от 84,0 до 106,7 кПа (630 - 800 мм рт. ст.);

- относительная влажность воздуха: от 30 до 80%;

- напряжение в сети: (220 +/- 10) В;

- частота переменного тока: (50 +/- 10) Гц.

Выполнение измерений на газовом хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

При подготовке к выполнению измерений проводят следующие работы: подготовка стеклянной посуды, подготовка хроматографической системы, приготовление растворов, приготовление градуировочных растворов, построение градуировочной характеристики, отбор проб.

В термостойкий стакан вместимостью 2 дм³ помещают 50 г калия двухромовокислого, осторожно приливают по палочке частями, тщательно перемешивая, 1 дм³ концентрированной серной кислоты.

Используемую посуду необходимо замочить в свежеприготовленном 3%-м растворе калия двухромовокислого в серной кислоте, промыть проточной водопроводной водой, ополоснуть дистиллированной водой и высушить в сушильном шкафу при температуре 105 °C.

Подготовку хроматографа к работе осуществляют в соответствии с инструкцией по эксплуатации хроматографа.

Новую кварцевую капиллярную колонку предварительно кондиционируют в токе газа-носителя (азота) с расходом 4 см³/мин, нагревая в термостате хроматографа ступенчато с 70 до 240 °C в течение 2 часов и выдерживают при 250 °C в течение суток.

После охлаждения до комнатной температуры колонку подключают к детектору и проверяют стабильность нулевой линии при рабочей температуре термостата колонок. При отсутствии мешающих влияний колонка готова к работе.

Устанавливают режим работы газового хроматографа в соответствии со следующими условиями:

Записывают нулевую линию при установленных режимных параметрах. При отсутствии флуктуации приступают к работе.

9.3.1. Приготовление исходного раствора. В мерную пробирку объемом 10 см³, дозатором добавляют бидистиллированную воду в объеме 2 см³, микрошприцем вводят по 2 мм³ N-нитрозоаминов (N-нитрозодиметиламин, N-нитрозодиэтиламин). Весовое содержание компонентов в исходном растворе составляет (с учетом плотности и содержания основного вещества): N-нитрозодиметиламин - 1,005 мг/см³, N-нитрозодиэтиламин - 0,942 мг/см³. Срок хранения раствора 12 часов.

9.3.2. Приготовление рабочего стандартного раствора. В мерную пробирку объемом 2 см³, содержащую бидистиллированную воду в объеме 1,0 см³, вводят дозатором 20 мм³ исходного раствора N-нитрозоаминов.

Массовая концентрация N-нитрозодиметиламина в рабочем растворе для градуировки составляет 0,02 мг/см³, N-нитрозодиэтиламина 0,0188 мг/см³. Срок хранения раствора 5 часов.

9.4.1. Приготовление градуировочных растворов. Градуировочные растворы N-нитрозоаминов готовят в мерных пробирках объемом 5 см³. Для этого в каждую пробирку дозатором вносят по 5 см³ крови и добавляют рабочий раствор для градуировки в соответствии с табл. 2 и тщательно перемешивают.

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади хроматографического пика (Гц·с) от массовой концентрации N-нитрозоаминов (мг/дм³) в дистиллированной воде, устанавливают по 5 сериям измерений, по 5 концентрациям каждого вещества в каждой серии для каждого диапазона в соответствии с табл. 2.

К дистиллированной воде объемом 45 см³ добавляют градуировочный раствор N-нитрозоаминов (табл. 3) объемом 5 см³. Пробу помещают в круглодонную колбу объемом 500 см³, добавляют гидрооксид калия (8 г) и с помощью водяного пара, образуемого в парообразователе, N-нитрозоамины отгоняют. Дистиллят, сконденсированный в холодильнике, собирают в объеме 70 см³ в коническую колбу-приемник. Затем дистиллят пропускают через картридж на угольной основе автоматической системы ТФЭ. По истечении 30 мин экстракт хлористого метилена объемом 2 мм³ через испаритель вводят в хроматографическую колонку. Процедуру повторяют аналогично для каждого градуировочного раствора. На полученной хроматограмме определяют площади пиков компонентов и по средним результатам из 5 серий строят градуировочную характеристику.

Процедуру градуировки проводят 1 раз в 3 месяца, а также при внедрении методики в практику лаборатории, после ремонта хроматографа, отрицательных результатах контроля стабильности градуировочной характеристики.

Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят 1 раз в квартал в анализируемой серии измерений. Образцами для контроля стабильности являются градуировочные растворы, выбранные таким образом, чтобы массовая концентрация N-нитрозоаминов соответствовала нижней, верхней границам и середине диапазона построения градуировочной характеристики. Градуировка признается стабильной при выполнении условия:

C - заданная массовая концентрация N-нитрозоаминов в градуировочном растворе, мг/дм³;

C_m - результат измерения массовой концентрации N-нитрозоаминов в образце для градуировки, мг/дм³.

Значения норматива контроля стабильности градуировочной характеристики К_гр приведены в табл. 3.

При невыполнении условия стабильности градуировочной характеристики эксперимент повторяют с другим градуировочным раствором. При повторном невыполнении условия стабильности градуировочной характеристики выясняют и устраняют причины нестабильности градуировочной характеристики.

Отбор проб крови в объеме не менее 5 см³ производится в вакуумные пробирки с гепарином (из расчета на 5 см³ крови - 0,05 см³ гепарина с концентрацией 5 000 ЕД/см³) для забора крови. Анализ проб крови проводят непосредственно после отбора проб. Допускается хранение проб в морозильной камере не более 5 дней.

К исследуемому образцу крови объемом 5 см³ добавляют дистиллированную воду объемом 45 см³. Пробу помещают в круглодонную колбу объемом 500 см³, добавляют гидрооксид калия (8 г) и с помощью водяного пара, образуемого в парообразователе, N-нитрозоамины отгоняют. Дистиллят, сконденсированный в холодильнике, собирают в объеме 70 см³ в коническую колбу-приемник. Затем дистиллят пропускают через картридж на угольной основе автоматической системы ТФЭ. По истечении 30 мин экстракт хлористого метилена объемом 2 мм³ через испаритель вводят в хроматографическую колонку и анализируют при условиях по п. 9.5.

Процедуру повторяют аналогично для второго образца и проводят выполнение измерений двух параллельных проб крови. Условия выполнения измерений аналогичны условиям при установлении градуировочной характеристики (п. 9.5).

11.1. На хроматограмме рассчитывают площадь пика и по градуировочной характеристике определяют массовую концентрацию N-нитрозоаминов в крови.

11.2. За окончательный результат измерения принимают среднее арифметическое значение двух результатов измерений (C₁, C₂), полученных в условиях повторяемости (параллельных определений), для которых выполняется условие:

r - предел повторяемости, %. Значения предела повторяемости приведены в табл. 4.

При невыполнении условия (2) получают дополнительно еще два результата измерений. За результат измерений принимают среднее арифметическое четырех результатов измерений, полученных в условиях повторяемости, для которых выполняется условие:

CR0,95(4) - критический диапазон, %. Значения критического диапазона приведены в табл. 4.

При невыполнении условия (3) в качестве окончательного результата измерений принимают медиану четырех результатов измерений, полученных в условиях повторяемости (параллельных определений). Дополнительно выявляют и устраняют причины, приводящие к невыполнению условий (2) и (3).

Результат измерений представляют в виде , где

- результат измерений, полученный в соответствии с процедурами разделов 9 - 11, мг/дм³;

- границы абсолютной лабораторной погрешности измерений массовой концентрации N-нитрозодиметиламина или N-нитрозодиэтиламина, мг/дм³, при P = 0,95.

Значение рассчитывают по формуле:

значение приведено в табл. 1.

13.1. Обеспечение достоверности измерений в пределах лаборатории организуют и проводят путем проведения проверки приемлемости результатов измерений, получаемых в условиях повторяемости, внутрилабораторной прецизионности, оперативного контроля процедуры измерений и контроля стабильности результатов измерений в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-6.

13.2. Проверка приемлемости результатов измерений, получаемых в условиях внутрилабораторной прецизионности.

Образцами для проверки приемлемости результатов измерений, получаемых в условиях внутрилабораторной прецизионности, являются образцы крови с внесенными в них добавками растворов N-нитрозоаминов, подготовленных в соответствии с п. 9.4.1.

Проверку приемлемости результатов измерений, получаемых в условиях внутрилабораторной прецизионности (в пределах одной лаборатории, разными операторами, в разное время), проводят по результатам измерений массовых концентраций N-нитрозоаминов в образцах крови с одинаковым содержанием N-нитрозоаминов.

Результаты измерений признают приемлемыми при выполнении условия:

C₁ и C₂ - результаты измерений массовых концентраций N-нитрозоаминов, полученные в условиях внутрилабораторной прецизионности, т.е. в одной лаборатории в разное время, разными операторами, мг/дм³;

R_л - предел внутрилабораторной прецизионности, %. Значения предела внутрилабораторной прецизионности приведены в табл. 4.

Если условие (5) не выполняется, процедуру повторяют. При повторном превышении предела повторяемости выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

13.3. Оперативный контроль процедуры измерений с использованием метода добавок.

Оперативный контроль процедуры измерений с использованием метода добавок проводят путем сравнения результата отдельно взятой контрольной процедуры К_к с нормативом контроля К.

Результат контрольной процедуры К_к рассчитывают по формуле:

- результат измерений массовой концентрации N-нитрозоамина в пробе с известной добавкой - среднее арифметическое двух результатов измерений полученных в условиях повторяемости, расхождение между которыми удовлетворяет условию (2), мг/дм³;

- результат измерений массовой концентрации N-нитрозоамина в исходной пробе - среднее арифметическое двух результатов измерений полученных в условиях повторяемости, расхождение между которыми удовлетворяет условию (2), мг/дм³;

C_д - величина добавки, мг/дм³.

В качестве добавки используют растворы N-нитрозоаминов, приготовленные по п. 9.4.1.

Норматив контроля К рассчитывают по формуле:

, - значения характеристики погрешности результатов измерений, установленные в лаборатории при реализации методики, соответствующие массовой концентрации N-нитрозоаминов в пробе с известной добавкой и в исходной пробе соответственно, мг/дм³.

Примечание. Допустимо характеристику погрешности результатов измерений при внедрении методики в лаборатории устанавливать на основе выражения: с последующим уточнением по мере накопления информации в процессе контроля стабильности результатов измерений.

Процедуру измерений признают удовлетворительной, при выполнении условия:

При невыполнении условия (8) контрольную процедуру повторяют. При повторном невыполнении условия (8) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

13.4. Оперативный контроль процедуры измерений, а также реализуемые процедуры контроля стабильности результатов выполняемых измерений, приводят в документах лаборатории, устанавливающих порядок и содержание работ по организации методов контроля стабильности результатов измерений в пределах лаборатории.

Примечание. При использовании настоящей методики измерений целесообразно проверить действие ссылочных стандартов на территории Российской Федерации по соответствующему указателю стандартов, составленному на 1 января текущего года, и по соответствующим информационным указателям, опубликованным в текущем году. Если ссылочный документ заменен (изменен), то при пользовании настоящей методикой измерений, следует руководствоваться замененным (измененным) стандартом. Если ссылочный документ отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.