"МУК 4.1.3505-17. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств фенгексамида в воде и почве методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 29.12.2017)

1. Разработаны ФБУН "Федеральный научный центр гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана" Роспотребнадзора (В.Н. Ракитский, Н.Е. Федорова, Л.Г. Бондарева).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 24 ноября 2017 г. N 1).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 29 декабря 2017 г.

4. Введены впервые.

Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения в воде и почве массовой концентрации фенгексамида в диапазоне 0,0005 - 0,0125 мг/дм³, 0,05 - 1,25 мг/кг соответственно.

Методические указания носят рекомендательный характер.

N-(4-Гидрокси-2,3-дихлорфенил)-1-метилциклогексанкарбоксамид (IUPAC).

Структурная формула:

Эмпирическая формула: C₁₄H₁₇Cl₂NO₂.

Молекулярная масса: 302,2.

Белый порошок. Давление пара (20 °C) - 4 x 10^-7 Па (3 x 10^-9 мм рт. ст.). Растворимость в воде (20 °C, pH 5 - 7) 20 мг/дм³. Растворимость в органических растворителях (при 20 °C, г/дм³): ацетон - 160; дихлорметан - 31; гексан - 0,1; толуол - 0,0057.

Область применения. Фенгексамид - фунгицид профилактического действия (химический класс - гидроксианилиды) для борьбы с серой гнилью, белой гнилью и плодовой гнилью на виноградной лозе, ягодниках, косточковых, цитрусовых, овощных и декоративных культурах.

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций.

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для всего диапазона измерений (n = 20) приведены в табл. 2.

Определение остаточных количеств фенгексамида выполняют методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на обращенной фазе с ультрафиолетовым детектором.

Нижний предел измерения в анализируемом объеме пробы - 1 нг. Средняя полнота извлечения: 99,0% - вода; 93,8% - почва.

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Примечание. Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией, не требующих дополнительной очистки растворителей.

Примечание. Допускается использование вспомогательных устройств и материалов с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ Р 12.1.019-09, а также требования, изложенные в технической документации на газовый хроматограф.

4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и ГН 2.2.5.2308-07. Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004-15.

Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист, имеющий опыт работы на жидкостном хроматографе, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений.

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C и относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Выполнению измерений предшествуют следующие операции: очистка растворителей, подготовка подвижной фазы для ВЭЖХ, кондиционирование хроматографической колонки для ВЭЖХ, подготовка колонки с силикагелем, приготовление градуировочных растворов и растворов внесения, установление градуировочной характеристики, отбор и хранение проб.

Ацетонитрил кипятят с обратным холодильником над пентоксидом фосфора (на 1 дм³ ацетонитрила 20 г пентоксида фосфора) не менее 1 часа, после чего перегоняют, непосредственно перед употреблением ацетонитрил повторно перегоняют над прокаленным карбонатом калия (на 1 дм³ ацетонитрила 10 г карбоната калия).

7.1.2.1. Приготовление раствора натрия углекислого с массовой долей 5%. Навеску (25 +/- 0,1) г натрия углекислого помещают в мерную колбу вместимостью 500 см³, растворяют в бидистиллированной воде, доводят водой до метки, перемешивают. Раствор хранят в стеклянной посуде в течение 3 месяцев.

7.1.2.2. Очистка растворителя. Этилацетат промывают последовательно 5%-м водным раствором натрия углекислого, насыщенным раствором хлористого кальция, сушат над прокаленным карбонатом калия и перегоняют или подвергают ректификационной перегонке на колонне с числом теоретических тарелок не менее 30. Растворитель хранят в стеклянной посуде в течение 1 месяца.

Растворитель последовательно промывают порциями концентрированной серной кислоты до тех пор, пока она не перестанет окрашиваться в желтый цвет, затем водой до нейтральной реакции промывных вод, перегоняют над прокаленным карбонатом калия.

7.2.1. Приготовление раствора ортофосфорной кислоты с массовой долей 0,2% (0,2%-й раствор). В мерную колбу вместимостью 500 см³ помещают 250 - 300 см³ бидистиллированной воды, 1 см³ ортофосфорной кислоты, перемешивают, доводят до метки водой и еще раз тщательно перемешивают.

7.2.2. Приготовление подвижной фазы. В мерную колбу вместимостью 1 000 см³ помещают 600 см³ ацетонитрила и 400 см³ 0,2%-го раствора ортофосфорной кислоты, перемешивают, фильтруют и дегазируют.

Подвижную фазу хранят в темном месте (в емкости из темного стекла) не более 14 дней.

Промывают колонку подвижной фазой (п. 7.2) при скорости подачи растворителя 0,8 см³/мин до установления стабильной базовой линии.

7.4.1. Приготовление раствора соляной кислоты, 1 моль/дм³. В мерную колбу вместимостью 500 см³ помещают 250 - 300 см³ бидистиллированной воды и 45,5 см³ соляной кислоты, перемешивают доводят до метки водой и еще раз тщательно перемешивают.

7.4.2. Смесь гексан-этилацетат (8:2 по объему). В мерную колбу вместимостью 500 см³ помещают 400 см³ гексана, 100 см³ этилацетата, перемешивают.

7.4.3. Смесь гексан-этилацетат (7:3 по объему). В мерную колбу вместимостью 500 см³ помещают 350 см³ гексана, 150 см³ этилацетата, перемешивают.

7.4.4. Смесь гексан-этилацетат (1:1 по объему). В мерную колбу вместимостью 500 см³ помещают 250 см³ гексана, 250 см³ этилацетата, перемешивают.

7.4.5. Смесь ацетонитрил-бидистиллированная вода (7:3 по объему). В мерную колбу вместимостью 500 см³ помещают 350 см³ ацетонитрила, 150 см³ бидистиллированной воды, перемешивают.

Растворы хранят в темном месте (в емкости из темного стекла) не более 14 дней.

Нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см, внутренним диаметром 10 - 12 мм уплотняют тампоном из стекловаты, выливают в колонку (при открытом кране) суспензию 5 г силикагеля в 30 см³ гексана. Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента, на который помещают слой безводного сульфата натрия высотой 1 см. Колонку последовательно промывают смесью гексан-этилацетат в объемном соотношении 7:3, затем 8:2 порциями по 30 см³. Скорость прохождения растворителя 1 - 2 капли в секунду. Колонка готова к работе.

В круглодонную колбу вместимостью 10 см³ помещают 0,5 см³ раствора N 1 фенгексамида с концентрацией 25 мкг/см³ (п. 7.7.2), упаривают досуха на ротационном испарителе при температуре не выше 35 °C. Сухой остаток растворяют в 5 см³ смеси гексан-этилацетат (8:2 по объему), помещают на ультразвуковую баню на 40 - 60 с и наносят на колонку, подготовленную по п. 7.5. Колбу обмывают дважды этой же смесью растворителей порциями по 3 см³, которые также наносят на колонку. Скорость прохождения растворителя через колонку - 1 - 2 капли в секунду. Промывают колонку 25 см³ смеси гексан-этилацетат в объемном соотношении 8:2, элюат отбрасывают.

Затем колонку промывают 30 см³ смеси гексан-этилацетат (1:1, по объему) со скоростью 1 - 2 капли в секунду. Фракционно (по 10 см³) отбирают элюат, упаривают, остатки растворяют в 2 см³ подвижной фазы для ВЭЖХ, анализируют содержание фенгексамида по п. 9.3.

Фракции, содержащие фенгексамид, объединяют и вновь анализируют.

Устанавливают уровень вещества в элюате, определяют полноту смывания с колонки и необходимый для очистки объем элюента.

Примечание. Проверку хроматографического поведения фенгексамида следует проводить обязательно, поскольку профиль вымывания может изменяться при использовании партии сорбентов и растворителей.

7.7.1. Исходный раствор фенгексамида для градуировки (концентрация 250 мкг/см³). В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают (0,0250 +/- 0,0001) г фенгексамида, растворяют в 50 - 60 см³ ацетонитрила, доводят ацетонитрилом до метки, тщательно перемешивают.

Раствор хранят в холодильнике при температуре 4 - 6 °C в течение трех месяцев.

7.7.2. Рабочий раствор N 1 фенгексамида для градуировки и внесения (концентрация 25,0 мкг/см³). В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 10,0 см³ исходного градуировочного раствора с концентрацией 250,0 мкг/см³ (п. 7.7.1), доводят до метки ацетонитрилом 25,0 мкг/см³.

Раствор хранят в холодильнике при температуре 4 - 6 °C в течение трех месяцев.

Этот раствор используют для приготовления проб с внесением при оценке полноты извлечения действующего вещества методом "внесено-найдено" и контроля качества результатов измерений методом "добавок".

7.7.3. Рабочие растворы N 2 - 6 фенгексамида для градуировки (концентрация 0,1 - 2,5 мкг/см³). В 5 мерных колб вместимостью 100 см³ помещают 0,4; 1,0; 2,0; 4,0; 10,0 см³ рабочего раствора N 1 с концентрацией 25,0 мкг/см³ (п. 7.7.2), доводят до метки подвижной фазой, приготовленной по п. 7.2, тщательно перемешивают, получают рабочие растворы N 2 - 6 с концентрациями фенгексамида 0,1; 0,25; 0,5; 1,0 и 2,5 мкг/см³.

Растворы хранят в холодильнике при температуре 4 - 6 °C не более месяца.

Градуировочную характеристику, выражающую линейную (с угловым коэффициентом) зависимость площади пика от концентрации фенгексамида в растворе, устанавливают методом абсолютной калибровки по 5 растворам для градуировки.

В инжектор хроматографа вводят по 20 мм³ каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования, указанных ниже. Осуществляют не менее 3 параллельных измерений. Устанавливают площади пиков фенгексамида, на основании которых строят градуировочную зависимость.

Отбор проб осуществлен в соответствии с ГОСТ 31861-12 "Вода. Общие требования к отбору проб"; ГОСТ 17.4.3.01-83 "Охрана природы. Почвы. Общие требования к отбору проб", ГОСТ 28168-89 "Почвы. Отбор проб"; "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов (N 2051-79 от 21.08.79).

Пробы воды отбирают и хранят в бутылях из полиэтилена (полипропилена) при температуре (4 +/- 2) °C 1 неделю. Пробы почвы подсушивают и хранят при комнатной температуре не более 2 недель. Для длительного хранения образцы замораживают и хранят при температуре не выше -18 °C.

Образец воды объемом 400 см³ отмеряют с помощью мерного цилиндра. Помещают в делительную воронку вместимостью 500 см³, добавляют 4 см³ 1 М раствора соляной кислоты (приготовленной по п. 7.4.1) и 20 см³ насыщенного раствора хлорида натрия. Перемешивают. В делительную воронку вносят 50 см³ гексана, интенсивно встряхивают в течение двух минут. После полного разделения фаз верхний органический слой отделяют, фильтруют через слой безводного сульфата натрия толщиной 1,5 см, помещенный на бумажном фильтре в конусной воронке в колбу для упаривания.

Процедуру экстракции водной фазы повторяют с 30 см³ гексана. Объединенный органический экстракт в круглодонной колбе упаривают при температуре не выше 35 °C на роторном вакуумном испарителе досуха. Остаток, полученный в круглодонной колбе, растворяют в 1 см³ этилацетата, вносят 4 см³ гексана, помещают в ультразвуковую ванну на 30 с. Раствор наносят на колонку, подготовленную по п. 7.5. Колбу промывают дважды смесью гексан-этилацетат (8:2, по объему) порциями по 3 см³, которые также наносят на колонку. Скорость прохождения растворителя через колонку - 1 - 2 капли в секунду. Промывают колонку смесью гексан-этилацетат последовательно в объемных соотношениях 8:2 - порция 25 см³, затем 7:3 - порция 50 см³. Элюат отбрасывают. Фенгексамид элюируют с колонки 30 см³ смеси гексан-этилацетат в объемном отношении 1:1 со скоростью 1 - 2 капли в секунду, собирая элюат в круглодонную колбу вместимостью 100 см³. Раствор упаривают досуха при температуре не выше 35 °C. Остаток растворяют в 2 см³ подвижной фазы и анализируют содержание фенгексамида в воде в условиях хроматографирования по п. 9.3.

Образец воздушно-сухой почвы массой 20 г помещают в плоскодонную колбу вместимостью 250 - 300 см³, добавляют 50 см³ смеси ацетонитрил-вода (п. 7.4.5), интенсивно встряхивают в течение 1 мин, затем помещают на 15 мин в ультразвуковую ванну.

Пробам дают отстояться. Затем смесь фильтруют на воронке Бюхнера с помощью разрежения, создаваемого водоструйным насосом, через двойной бумажный фильтр низкой плотности. Почвенный остаток повторно экстрагируют 50 см³ смеси ацетонитрил-вода (п. 7.4.5) на ультразвуковой ванне в течение 15 мин, раствор фильтруют на воронке Бюхнера. Переносят аликвоту фильтрата объемом 10 см³ (соответствующую 4 г пробы почвы) в колбу на 50 см³ и доводят водой до метки, перемешивают.

Полученный раствор помещают в делительную воронку вместимостью 250 см³, добавляют 2 см³ 1 М раствора соляной кислоты и 5 см³ насыщенного раствора хлорида натрия. Перемешивают. В эту же делительную воронку вносят 50 см³ гексана, интенсивно встряхивают в течение двух минут. После полного разделения фаз верхний органический слой отделяют, фильтруют через слой безводного сульфата натрия толщиной 1,5 см, помещенный на бумажном фильтре в конусной воронке, в колбу для отгонки. Процедуру экстракции водной фазы повторяют с использованием 30 см³ гексана. Объединенный органический экстракт в круглодонной колбе упаривают при температуре не выше 35 °C на роторном вакуумном испарителе досуха. Остаток, полученный в круглодонной колбе, растворяют в 1 см³ этилацетата, вносят 4 см³ гексана, помещают в ультразвуковую ванну на 30 с. Раствор наносят на колонку, подготовленную по п. 7.5. Колбу промывают дважды смесью гексан-этилацетат (8:2, по объему) порциями по 3 см³, которые также наносят на колонку. Скорость прохождения растворителя через колонку - 1 - 2 капли в секунду. Промывают колонку смесью гексан-этилацетат последовательно в объемных соотношениях 8:2 - порция 25 см³, затем 7:3 - порция 50 см³. Элюат отбрасывают. Фенгексамид элюируют с колонки 30 см³ смеси гексан-этилацетат в объемном отношении 1:1 со скоростью 1 - 2 капли в секунду, собирая элюат в круглодонную колбу вместимостью 100 см³. Раствор упаривают досуха при температуре не выше 35 °C. Остаток растворяют в 2 см³ подвижной фазы и анализируют содержание фенгексамида в почве в условиях хроматографирования по п. 9.3.

Измерения выполняют при следующих режимных параметрах:

Жидкостный хроматограф с быстросканирующим ультрафиолетовым детектором, снабженный дегазатором и термостатом колонки.

Хроматографическая колонка стальная длиной 250 мм, внутренним диаметром 4,6 мм, заполненная обращенно-фазовым сорбентом с привитыми алкильными группами (C-18 или C-8) для удерживания гидрофильных соединений, зернением 5 мкм.

Рабочие длины волн: 289 и 246 нм.

Температура колонки: 25 °C.

Подвижная фаза: ацетонитрил-0,2%-я ортофосфорная кислота (60:40, по объему).

Скорость потока элюента: 0,8 см³/мин.

Объем вводимой пробы: 20 мм³.

Линейный диапазон детектирования: 2 - 50 нг.

Содержание фенгексамида в пробах воды и почвы (X, мг/дм³, мг/кг) рассчитывают по формуле:

где A - концентрация фенгексамида, мг/дм³, мг/кг;

V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, см³;

m - масса (объем) анализируемого образца, г, см³;

К - коэффициент, учитывающий объем экстракта, взятого для анализа, К = 1 (вода), К = 5 (почва).

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости:

где X₁, X₂ - результаты параллельных определений, мг/дм³, мг/кг;

r - значение предела повторяемости (табл. 1), при этом .

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

Результат анализа представляют в виде:

где - среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг, мг/дм³;

- граница абсолютной погрешности, мг/дм³, мг/кг:

где - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

Если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание фенгексамида в пробе воды - менее 0,0005 мг/дм³; в пробе почвы - менее 0,05 мг/кг <*>".

--------------------------------

<*> 0,0005 мг/дм³; 0,05 мг/кг - пределы обнаружения фенгексамида в воде и почве соответственно.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1 - 6-02 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

13.1. Контроль стабильности градуировочной характеристики.

Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят в начале и по окончании каждой серии анализов.

При контроле стабильности градуировочной характеристики проводят измерения не менее двух образцов концентраций для градуировки, содержание фенгексамида в которых должно охватывать весь диапазон концентраций от 0,1 до 2,5 мкг/см³.

Градуировочная характеристика считается стабильной, если для каждого из используемого для контроля градуировочного раствора сохраняется соотношение:

где X - концентрация фенгексамида в пробе при контрольном измерении, мкг/см³;

C - известная концентрация градуировочного раствора фенгексамида, взятая для контроля стабильности градуировочной характеристики, мкг/см³;

B - норматив контроля погрешности градуировочной характеристики, % (равен 10% при P = 0,95).

Если величина расхождения (A) превышает 10%, делают вывод о невозможности применения градуировочной характеристики для дальнейших измерений. В этом случае выясняют и устраняют причины нестабильности градуировочной характеристики и повторяют контроль ее стабильности с использованием других градуировочных растворов фенгексамида, предусмотренных методикой измерения. При повторном обнаружении нестабильности градуировочной характеристики устанавливают ее заново согласно п. 7.8.

Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом "добавок".

Величина добавки должна удовлетворять условию:

где - характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой соответственно), мг/кг, мг/дм³, при этом:

где - граница абсолютной погрешности, мг/кг, мг/дм³:

где - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

Результат контроля процедуры К_к рассчитывают по формуле:

где , , - среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки соответственно, мг/кг, мг/дм³.

Норматив контроля К рассчитывают по формуле:

Проводят сопоставление результата контроля процедуры (К_к) с нормативом контроля (К).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), не должно превышать предела воспроизводимости (R):

где X₁, X₂ - результаты измерений, выполненных в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), мг/кг, мг/дм³.

R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.