"МУК 4.1.3187-14. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств эпоксиконазола в зеленой массе, зерне и масле кукурузы методом капиллярной газожидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 24.07.2014)

Разработаны сотрудниками "Всероссийского НИИ защиты растений", С.-Петербург (Долженко В.И., Цибульская И.А., Карпова Л.М.).

Свидетельство о метрологической аттестации N 01.5.04.176/01.00043/2014.

Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода капиллярной газожидкостной хроматографии для определения массовой концентрации эпоксиконазола в зеленой массе, зерне и масле кукурузы в диапазоне концентраций 0,05 - 0,5 мг/кг.

Методические указания носят рекомендательный характер.

Название действующего вещества по ИСО: эпоксиконазол.

Название действующего вещества по ИЮПАК: 1-{2-(4-фторфенил)-[3-(2-хлорфенил)оксиран-2-ил]метил}-1Н-1,2,4-триазол.

Структурная формула:

Эмпирическая формула: C₁₇H₁₃ClFN₃O.

Молекулярная масса: 329,8.

Эпоксиконазол представляет собой 2R,3S - 2S,3R энантиомерную пару.

Бесцветные кристаллы без запаха.

Температура плавления: 136,2 °C. Давление пара при 20 °C: < 0,01 мПа.

Коэффициент распределения н-октанол-вода: K_ow log P = 3,44 (pH 7).

Растворимость: в воде - 6,63 x 10^-4 г/100 см³ (20 °C); гептане - 0,04; ацетоне - 14,4; дихлорметане - 29,1 (г/100 см³).

Вещество не гидролизуется при pH 5 - 7 в течение 12 дней.

В биологически активных почвах эпоксиконазол разлагается почвенными микроорганизмами - DT₅₀ около 2 - 3 месяцев, в растениях экстенсивно деградирует.

Краткая токсикологическая характеристика. Острая пероральная токсичность LD₅₀ для крыс > 5 000 мг/кг, острая дермальная токсичность LD₅₀ для крыс > 2 000 мг/кг; не оказывает раздражающего действия на кожу и глаза кролика.

Область применения. Системный фунгицид широкого спектра действия, обладает профилактическим и лечебным свойствами, эффективен против возбудителей ржавчины, мучнистой росы и пятнистости на зерновых и сое.

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1.

Метрологическая характеристика метода представлена в табл. 1 и 2.

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для полного диапазона концентраций (n = 20, P = 0,95) приведены в табл. 2.

Методика основана на определении эпоксиконазола методом капиллярной газожидкостной хроматографии с использованием электронозахватного детектора после его извлечения из образцов зеленой массы кукурузы, зерна и масла органическим растворителем, очистке экстракта в системе двух несмешивающихся растворителей и на колонке с силикагелем.

Идентификация эпоксиконазола проводится по времени удерживания, количественное определение - методом абсолютной калибровки.

Избирательность метода обеспечивается сочетанием условий подготовки проб и хроматографирования.

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Примечание. Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией, не требующих дополнительной очистки растворителей.

Примечание. Допускается применение оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-09, а также требования, изложенные в технической документации на газовый хроматограф.

4.2. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией, соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и 2.2.5.2308-07. Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004-90.

4.3. При работе с газами, находящимися в баллонах под давлением до 15 мПа (150 кгс/см²) необходимо соблюдать "Правила устройства и безопасной эксплуатации стационарных компрессорных установок, воздуховодов и газопроводов под давлением" ПБ-03-576-03. Запрещается открывать вентиль баллона, не установив на нем понижающий редуктор.

Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист-химик, имеющий опыт работы методом капиллярной газожидкостной хроматографии, ознакомленный с руководством по эксплуатации хроматографа, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 13.

При выполнении измерений выполняют следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C и относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на газовом хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Перед началом анализа капиллярную колонку кондиционируют в токе азота при температуре термостата колонок 250 °C до стабилизации нулевой линии.

Растворители, используемые для анализа, специальной подготовки не требуют. Рекомендуется проверить чистоту применяемых растворителей. Для этого 100 см³ растворителя испаряют при помощи вакуумного ротационного растворителя при температуре 40 °C до объема 1 см³ и хроматографируют. При обнаружении примесей, которые могут мешать определению, растворители очищают общепринятыми методами.

В нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см и диаметром 10 мм вставляют тампон из стекловаты, закрывают кран и вносят суспензию 5 г силикагеля в 10 см³ гексана. Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента и помещают на него слой безводного сульфата натрия высотой 1 см. Колонку промывают 20 см³ смеси гексан-ацетон (8:2 по объему), после чего она готова к работе.

В круглодонную колбу емкостью 10 см³ отбирают 1 см³ стандартного раствора эпоксиконазола с концентрацией 5 мкг/см³. Отдувают растворитель током азота, остаток растворяют в 3 см³ смеси гексан-ацетон (8:2 по объему) и наносят на подготовленную колонку. Промывают колонку 50 см³ смеси гексан-ацетон (8:2). Элюат отбрасывают. Затем промывают 40 см³ смеси гексан-ацетон (6:4), отбирая фракции по 10 см³. Каждую фракцию упаривают досуха на ротационном испарителе при температуре до 40 °C, растворяют в 1 см³ н-гексана и анализируют на содержание эпоксиконазола.

Фракции, содержащие эпоксиконазол, объединяют, упаривают досуха, остаток растворяют в 1 см³ н-гексана и вновь анализируют на содержание эпоксиконазола. Рассчитывают содержание эпоксиконазола в элюате, определяют полноту вымывания из колонки и необходимый для этого объем элюента.

Примечание. Проверку хроматографического поведения эпоксиконазола следует проводить обязательно, поскольку профиль вымывания может изменяться при использовании новой партии сорбента и растворителей.

7.5.1. Основной раствор с концентрацией 0,1 мг/см³. Точную навеску эпоксиконазола (100 +/- 0,1) мкг помещают в мерную колбу на 100 см³, растворяют в ацетоне и доводят объем до метки тем же растворителем.

Градуировочные растворы эпоксиконазола с концентрациями 0,5; 1,0; 2,5 и 5,0 мкг/см³ готовят методом последовательного разбавления основного раствора по объему, используя гексан.

7.5.2. Раствор N 1 с концентрацией эпоксиконазола 5 мкг/см³. В мерную колбу на 100 см³ вносят 5 см³ основного раствора и доводят объем до метки гексаном.

7.5.3. Раствор N 2 с концентрацией эпоксиконазола 2,5 мкг/см³. В мерную пробирку вместимостью 10 см³ вносят 5 см³ раствора N 1 и доводят объем до метки гексаном.

7.5.4. Раствор N 3 с концентрацией эпоксиконазола 1,0 мкг/см³. В мерную пробирку вместимостью 10 см³ помещают 2 см³ раствора N 1 и доводят объем до метки гексаном.

7.5.5. Раствор N 4 с концентрацией эпоксиконазола 0,5 мкг/см³. В мерную пробирку вместимостью 10 см³ вносят 1 см³ раствора N 1 и доводят объем до метки гексаном.

Основной раствор можно хранить в холодильнике при температуре 0 - 4 °C в течение 6 месяцев, градуировочные растворы - в течение 2 недель.

Для внесения в образец при определении полноты извлечения используют соответствующие градуировочные растворы эпоксиконазола.

Для построения градуировочного графика (площадь пика - концентрация эпоксиконазола в растворе) в хроматограф вводят по 1 мм³ градуировочных растворов (не менее 3 параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4 точек по диапазону измеряемых концентраций). Затем измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации определяемого компонента в градуировочном растворе.

Методом наименьших квадратов рассчитывают градуировочный коэффициент (К) в уравнении линейной регрессии:

где S - площадь пика градуировочного раствора.

Градуировку признают удовлетворительной, если значение коэффициента линейной корреляции оказывается не ниже 0,99.

Градуировочную характеристику необходимо проверять при замене реактивов, хроматографической колонки или элементов хроматографической системы, а также при отрицательном результате контроля градуировочного коэффициента.

Градуировочную зависимость признают стабильной при выполнении следующего условия:

где C - аттестованное значение массовой концентрации определяемого компонента в градуировочном растворе;

C_К - результат контрольного измерения массовой концентрации определяемого компонента в градуировочном растворе;

- норматив контроля градуировочного коэффициента, % ( при P = 0,95).

Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (от 21.08.79 N 2051-79), а также в соответствии с ГОСТ 13634-90 "Кукуруза. Требования при заготовках и поставках" и с ГОСТ 8808-91 "Масло кукурузное. ТУ". Зерно кукурузы хранят в полотняных мешочках при комнатной температуре. Для исследовательских целей допускается получение масла в лаборатории из проб измельченного зерна методом экстракции органическим растворителем при температуре не выше 40 °C. Пробы масла хранят при 4 - 6 °C в закрытой стеклянной или полиэтиленовой таре не более 30 суток.

Навеску зеленой массы (50 +/- 0,1) г вносят в колбу вместимостью 500 см³, добавляют 200 см³ ацетонитрила и встряхивают на механическом встряхивателе в течение 30 мин. Полученный экстракт фильтруют через бумажный фильтр быстрой фильтрации под вакуумом на воронке Бюхнера в коническую колбу на 500 см³. Осадок на фильтре промывают 100 см³ ацетонитрила. Из объединенного экстракта отбирают аликвоту раствора, эквивалентную 10 г пробы, т.е. ¹/₅ часть суммарного объема фильтрата в грушевидную колбу для упаривания. Раствор упаривают досуха на ротационном испарителе при температуре бани не выше 30 °C.

Сухой остаток растворяют в 2 см³ ацетонитрила и 50 см³ воды, снова фильтруют через бумажный фильтр в делительную воронку объемом 250 см³, куда добавляют 15 см³ насыщенного раствора хлорида натрия и 30 см³ гексана. Воронку встряхивают в течение 2 мин и после разделения слоев отбирают гексановую фракцию через бумажный фильтр с безводным сульфатом натрия в концентратор объемом 250 см³, а водную фракцию возвращают в делительную воронку. Экстракцию эпоксиконазола из водной фазы гексаном повторяют еще дважды. Объединенный гексановый экстракт упаривают досуха на роторном испарителе при температуре 30 °C. Дальнейшую очистку проводят по п. 9.2.

Навеску размолотого до состояния "крупки" зерна кукурузы (10 +/- 0,1) г вносят в колбу вместимостью 250 см³, добавляют 5 см³ воды и 50 см³ ацетонитрила и встряхивают на механическом аппарате для встряхивания в течение 30 мин. Полученный экстракт фильтруют через бумажный фильтр быстрой фильтрации в колбу-концентратор на 250 см³. Экстракцию повторяют дважды. Осадок на фильтре промывают 10 см³ той же смеси. Объединенный экстракт упаривают досуха на ротационном испарителе при температуре бани не выше 30 °C. Далее поступают по п. 9.1.1.

Навеску масла кукурузы (10 +/- 0,1) г растворяют в гексане (конечный объем 90 см³). В делительной воронке экстрагируют эпоксиконазол трижды по 50 см³ ацетонитрила. Объединенный ацетонитрильный экстракт упаривают досуха на ротационном испарителе при температуре бани не выше 30 °C. Далее поступают по п. 9.1.1.

Сухой остаток, полученный по пп. 9.1.1 - 9.1.3 количественно переносят тремя порциями по 1 см³ элюента N 1 в подготовленную по п. 7.3 стеклянную хроматографическую колонку. Промывают колонку 50 см³ элюента N 1. Элюат отбрасывают. Далее элюируют эпоксиконазол 25 см³ элюента N 2. Элюат собирают в грушевидную колбу-концентратор и упаривают на роторном испарителе при температуре 30 °C до сухого остатка. Сухой остаток растворяют в 1 см³ гексана и вводят в испаритель хроматографа 1 мм³ полученного раствора.

Газовый хроматограф с электронозахватным детектором. Капиллярная кварцевая колонка длиной 30 м, внутренним диаметром 0,32 мм с толщиной слоя неполярной неподвижной фазы 0,25 мкм. Температура колонки: программирование от 130 °C (30 с) до 230 °C со скоростью 25 °C/мин. Температура испарителя: 270 °C. Температура детектора: 300 °C. Расход газа-носителя (азот) через колонку: 2,0 см³/мин (деление потока 1:20). Поддув газа-носителя к детектору: 18 см³/мин. Объем конечного экстракта: 1 см³, хроматографируемый объем: 1 мм³. Абсолютное время удерживания эпоксиконазола: 10 мин 30 с +/- 5 с.

Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки. Содержание эпоксиконазола в пробе (X, мг/кг) вычисляют по формуле:

где S_x - площадь пика определяемого компонента на хроматограмме испытуемого образца, мм² (AU);

К - градуировочный коэффициент, найденный на стадии построения соответствующей градуировочной зависимости;

V - объем пробы, подготовленной для хроматографического анализа, см³;

P - навеска анализируемого образца, г;

f - полнота извлечения определяемого компонента, приведенная в табл. 2, %.

Содержание остаточных количеств эпоксиконазола в образце вычисляют как среднее из двух параллельных определений.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор эпоксиконазола с концентрацией 5 мкг/см³, разбавляют гексаном.

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости:

где X₁, X₂ - результаты параллельных определений, мг/кг;

r - значение предела повторяемости .

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

Результат анализа представляют в виде:

где - среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

- граница абсолютной погрешности, мг/кг:

где - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

В случае, если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание вещества в пробе менее нижней границы определения" (например: менее 0,05 мг/кг <*>, где <*> - 0,05 мг/кг - предел обнаружения эпоксиконазола в зерне кукурузы).

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1 - 6-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.

Величина добавки C_д должна удовлетворять условию:

где - характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой соответственно), мг/кг;

при этом:

где - граница абсолютной погрешности, мг/кг:

где - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

Результат контроля процедуры К_к рассчитывают по формуле:

где X', X, C_д - среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки соответственно, мг/кг.

Норматив контроля К рассчитывают по формуле:

Проводят сопоставление результата контроля процедуры (К_к) с нормативом контроля (К).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):

где X₁, X₂ - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;

R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций), %.