"МУК 4.1.3158-14. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Измерение массовой концентрации акролеина в крови методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 24.02.2014)

1. Разработаны: ФБУН "Федеральный научный центр медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения" (Т.С.Уланова, Н.В.Зайцева, Т.Д.Карнажицкая, Е.О.Пшеничникова).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 26 декабря 2013 г. N 4).

3. Утверждены вр.и.о. руководителя Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главного государственного санитарного врача Российской Федерации А.Ю.Поповой 24 февраля 2014 г.

4. Введены впервые.

Свидетельство о метрологической аттестации N 88-16374-008-01/00076-2013 от 08.02.2013.

1.1. Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии для измерения массовой концентрации акролеина в крови в диапазоне концентраций от 0,1 до 5,0 мг/куб. дм.

1.2. Методические указания по измерению массовой концентрации акролеина в крови методом высокоэффективной жидкостной хроматографии предназначены для использования территориальными органами и службами Роспотребнадзора, лечебными и научными учреждениями, осуществляющими деятельность в области профпатологии и экологии человека, научно-исследовательскими институтами, занимающимися вопросами гигиены окружающей среды.

1.3. Методические указания носят рекомендательный характер.

Акролеин (акриловый альдегид, этиленальдегид, 2-пропеналь) - бесцветная, легко воспламеняющаяся слезоточивая жидкость с резким запахом. Выделяется в атмосферный воздух с отработавшими газами автотранспорта, в процессе горения органического топлива, при приготовлении пищи (жарение, копчение). Относится к опасным веществам. Гигиенический норматив в Российской Федерации не установлен.

Краткая токсикологическая характеристика. Обладает выраженным раздражающим, общетоксическим, аллергенным, мутагенным действием. Угнетает синтез ДНК и клеточное деление, ингибирует ДНК-полимеразу. Оказывает цитотоксическое действие.

При соблюдении всех регламентированных условий и проведении анализа в точном соответствии с данной методикой значения погрешности (и ее составляющих) результатов измерений не превышают значений, приведенных в табл. 1.

Значения показателя точности используют при:

- оформлении результатов измерений, выдаваемых лабораторией;

- оценке деятельности лабораторий на качество проведения измерений;

- оценке возможности использования результатов измерений при реализации методики измерений в конкретной лаборатории.

Измерение массовой концентрации акролеина в крови основано на взаимодействии акролеина с 3-аминофенолом с образованием производного 7-гидроксихинолина и его анализе методом высокоэффективной жидкостной хроматографии на обращенной фазе и флуориметрическом детектировании.

Нижний предел измерения в анализируемом объеме пробы - 2 нг. Средняя полнота извлечения свободного акролеина из крови - 84%.

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Примечание. Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией.

Примечание. Допускается использование других вспомогательных устройств и материалов аналогичного назначения, технические характеристики которых не уступают указанным.

6.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-2009, а также требования, изложенные в технической документации на эксплуатацию жидкостного хроматографа.

6.2. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией и соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83.

6.3. Содержание вредных веществ в воздухе рабочей зоны не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и 2.2.5.2308-07.

К выполнению измерений и обработке их результатов допускают лиц, имеющих квалификацию не ниже инженера-химика с опытом работы на жидкостном хроматографе, освоивших метод измерений и получивших удовлетворительные результаты оперативного контроля процедуры измерений.

При приготовлении градуировочных растворов и подготовке проб к анализу соблюдают следующие условия:

Выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Перед выполнением измерений проводят следующие работы: подготовка посуды, приготовление растворов, подготовка хроматографической колонки, установление градуировочной характеристики.

Используемую посуду вымыть мыльным раствором, промыть проточной водопроводной водой, многократно ополоснуть дистиллированной водой и высушить при температуре 50 °С.

9.2.1. Раствор для элюирования А. В стакан вместимостью 600 куб. см вносят 500 куб. см дистиллированной воды, устанавливают на магнитную мешалку, помещают в раствор электроды рН-метра, небольшими порциями с помощью стеклянной пипетки вносят концентрированную фосфорную кислоту при перемешивании до установления рН 2,5. Срок хранения раствора 5 дней.

9.2.2. Раствор для элюирования В. В мерный цилиндр 2-100-1 помещают 25 куб. см метанола, доводят до 100 куб. см ацетонитрилом, закрывают пришлифованной стеклянной пробкой, тщательно перемешивают. Срок хранения раствора 5 дней.

9.2.3. Элюент для хроматографии. Состав элюента задают на двух каналах насоса: смешивают раствор для элюирования А и раствор для элюирования В в соотношении 94: 6% (объемная доля).

9.2.4. Раствор 3-аминофенола, молярная концентрация 0,023 моль/куб. дм. В мерную колбу вместимостью 50 куб. см помещают навеску 0,1255 г 3-аминофенола, растворяют в 40-45 куб. см дистиллированной воды при температуре 40-50 °С, остужают до комнатной температуры, доводят дистиллированной водой до метки. Срок хранения раствора 30 дней в холодильнике при температуре 4-6 °С.

9.2.5. Раствор гидроксиламина соляно-кислого, молярная концентрация 0,043 моль/куб. дм. В мерную колбу вместимостью 50 куб. см помещают навеску 0,1494 г гидроксиламина соляно-кислого, растворяют в 40-45 куб. см дистиллированной воды, доводят дистиллированной водой до метки. Срок хранения раствора 30 дней в холодильнике при температуре 4-6 °С.

9.2.6. Раствор железа (III) сульфата, массовая концентрация 2,8 мг/куб. см. В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают навеску 0,28 г железа (III) сульфата, девятиводного, растворяют в 50-60 куб. см дистиллированной воды, добавляют 1 куб. см серной кислоты концентрированной, доводят до метки дистиллированной водой. Срок хранения раствора не ограничен.

9.2.7. Раствор серной кислоты в дистиллированной воде, 16% (объемная доля). В термостойкий стакан вместимостью 50 куб. см помещают 10 куб. см дистиллированной воды и 2 куб. см серной кислоты концентрированной. Осторожно перемешивают, остужают до комнатной температуры. Срок хранения раствора не ограничен.

9.2.8. Исходный раствор акролеина (раствор 1). В мерную колбу вместимостью 50 куб. см помещают 40-45 куб. см спирта этилового, 50 куб. мм чистого акролеина (с учетом плотности 42 мг) и доводят этиловым спиртом до метки. Массовая концентрация акролеина в исходном растворе - 0,84 мг/куб. см. Срок хранения раствора 14 дней в холодильнике при температуре 4-6 °С.

9.2.9. Раствор акролеина для градуировки (раствор 2). В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 40-45 куб. см спирта этилового, 0,6 куб. см исходного раствора акролеина и доводят этиловым спиртом до метки. Массовая концентрация акролеина в разбавленном растворе составляет 0,005 мг/куб. см. Используют свежеприготовленный раствор.

9.2.10. Раствор 7-гидроксихинолина для идентификации продукта реакции акролеина с 3-аминофенолом. В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают навеску 0,0100 г 7-гидроксихинолина, растворяют в 5-6 мл раствора 0,1 Н хлористо-водородной кислоты, доводят до метки дистиллированной водой. Концентрация 7-гидроксихинолина в растворе составляет 100 мкг/куб. см. Срок хранения раствора 60 дней в холодильнике при температуре 4-6 °С.

Колонку устанавливают в хроматограф, подают ацетонитрил со скоростью 0,2 куб. см/мин. в течение 0,5 ч., затем подают элюент состава: 94% (объемная доля) раствора для элюирования А, 6% (объемная доля) раствора для элюирования В со скоростью 0,2 куб. см/мин. до установления равновесия колонки, которое определяют по стабильности нулевой линии детектора. Проводят холостую разгонку с установлением ступеней градиента: 6 мин. - 6% раствора В, 13 мин. - 8% раствора В, 17 мин. - 10% раствора В, 22 мин. - 20% раствора В с увеличением скорости подвижной фазы до 0,5 куб. см/мин., 36 мин. - остановка разгонки.

9.4.1. Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади пика 7-гидроксихинолина (дериват акролеина) от массовой концентрации акролеина в крови устанавливают методом абсолютной градуировки по трем сериям растворов. Каждую серию, состоящую из шести градуировочных растворов, готовят из раствора акролеина для градуировки N 2, приготовленного по п. 9.2.9.

9.4.2. Градуировочные растворы готовят в стеклянных пробирках с притертой пробкой вместимостью 10 куб. см. Для этого в каждую пробирку вносят 0,25 куб. см цельной крови с гепарином, раствор акролеина для градуировки и этанол в соответствии с табл. 2. В соответствии с п. 11 проводят анализ холостой пробы. При наличии анализируемого вещества в холостой пробе вычитают его фоновое содержание при построении градуировки.

Проводят реакцию дериватизации для перевода акролеина в форму производного (7-гидроксихинолина). В каждую пробирку с градуировочным раствором добавляют 2 куб. см раствора 3-аминофенола, 2 куб. см раствора гидроксиламина соляно-кислого, 0,1 куб. см раствора сульфата железа, 0,2 куб. см раствора серной кислоты. Пробирки закрывают пробкой и тщательно перемешивают содержимое интенсивным встряхиванием. Пробирки нагревают на водяной бане 15 мин. при температуре 100 °С, периодически открывая пробки. После охлаждения очищают прореагировавшую смесь способом твердофазной экстракции. Для этого в пробирку добавляют 0,35 г магния серно-кислого 7-водного и 0,05 г сорбента для хроматографии , интенсивно встряхивают смесь в течение 1 мин., переносят в конические пробирки из полипропилена и центрифугируют 10 мин. со скоростью 2000 об./мин. Надосадочный слой отбирают и пропускают через пористый фильтр (размер пор 0,45 мкм), используя шприц медицинский типа Люэр, фильтрат собирают в виалу, анализируют 20 куб. мм экстракта в рабочем режиме хроматографа.

9.4.3. Режим работы хроматографа:

Градуировочный коэффициент рассчитывают по формуле:

- массовая концентрация акролеина в градуировочном растворе, мг/куб. дм;

- среднее значение трех измерений площади пика акролеина в форме его производного (7-гидроксихинолина), полученное при анализе i-го градуировочного раствора, условные единицы (усл. ед.);

n - количество градуировочных смесей (n = 6).

Градуировку проводят при смене реактивов или разделительной колонки.

9.4.4. Контроль стабильности градуировочной характеристики. Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят 1 раз в квартал в анализируемой серии измерений. Образцами для контроля стабильности являются градуировочные растворы, выбранные таким образом, чтобы массовая концентрация акролеина соответствовала нижней, верхней границам и середине диапазона построения градуировочной характеристики. Градуировка признается стабильной при выполнении условия:

C - заданная массовая концентрация акролеина в градуировочном растворе;

- результат измерения массовой концентрации акролеина в образце для градуировки.

При невыполнении условия (1) стабильности градуировочной характеристики эксперимент повторяют с другим градуировочным раствором. При повторном невыполнении условия стабильности градуировочной характеристики выясняют и устраняют причины нестабильности градуировочной характеристики.

Отбирают пробу крови объемом 1 куб. см в пробирку, содержащую 0,025 куб. см гепарина. Отобранные пробы хранят в холодильнике при температуре 4-6 °С, срок хранения проб 8 ч.

Выполняют два параллельных измерения массовой концентрации акролеина в образце крови. Для этого в стеклянные пробирки с притертой пробкой вместимостью 10 куб. см вносят по 0,25 куб. см пробы крови, добавляют 0,25 куб. см этанола, 2 куб. см раствора 3-аминофенола, 2 куб. см раствора гидроксиламина соляно-кислого, 0,1 куб. см раствора сульфата железа, 0,2 куб. см раствора серной кислоты, закрывают пробкой. Смесь интенсивно встряхивают, нагревают на водяной бане 15 мин. при температуре 100 °С, периодически открывая пробирки. После охлаждения очищают прореагировавшую смесь способом твердофазной экстракции. Для этого в каждую пробирку добавляют 0,35 г магния серно-кислого 7-водного и 0,15 г сорбента для хроматографии , интенсивно встряхивают смесь в течение 1 мин., переносят в конические пробирки из полипропилена и центрифугируют 10 мин. со скоростью 2000 об./мин. Надосадочный слой отбирают и пропускают через пористый фильтр (размер пор 0,45 мкм), используя шприц медицинский типа Люэр, фильтрат собирают в виалу, анализируют 20 куб. мм экстракта в рабочем режиме хроматографа.

11.1. Массовую концентрацию акролеина в крови (мг/куб. дм) вычисляют по формуле:

С - массовая концентрация акролеина в анализируемой пробе, мг/куб. дм;

- площадь пика 7-гидроксихинолина на хроматограмме, (усл. ед.);

К - градуировочный коэффициент.

11.2. За результат измерения принимают среднее арифметическое значение двух результатов измерений, полученных в условиях повторяемости , (параллельных определений), для которых выполняется условие:

r - предел повторяемости. Значения предела повторяемости приведены в табл. 3.

При невыполнении условия (2) получают дополнительно еще два результата измерений. За результат измерений принимают среднее арифметическое четырех результатов измерений, полученных в условиях повторяемости, для которых выполняется условие:

- критический диапазон. Значения критического диапазона приведены в табл. 3.

При невыполнении условия (3) в качестве окончательного результата измерений принимают медиану четырех результатов измерений, полученных в условиях повторяемости (параллельных определений). Выявляют и устраняют причины, приводящие к невыполнению условий (2) и (3).

Результат измерений представляют в виде мг/куб. дм, где:

- средний результат измерений, мг/куб. дм;

- характеристика погрешности, мг/куб. дм при Р - 0,95, значение рассчитывают по формуле: , где - относительное значение характеристики погрешности, % (приведено в табл. 1).

Контроль качества результатов измерений в пределах лаборатории организуют и проводят путем проведения оперативного контроля процедуры измерений и контроля стабильности результатов измерений в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-(1-6)-2002 и РМГ 76-2004.

Периодичность получения результатов контрольных процедур и формы их регистрации приводят в документах лаборатории, устанавливающих порядок и содержание работ по организации методов контроля стабильности результатов измерений в пределах лаборатории.

Оперативный контроль процедуры измерений с использованием метода добавок проводят путем сравнения результата отдельно взятой контрольной процедуры с нормативом контроля К.

Результат контрольной процедуры рассчитывают по формуле

- результат измерений массовой концентрации акролеина в пробе с известной добавкой - среднее арифметическое двух результатов измерений, полученных в условиях повторяемости, расхождение между которыми удовлетворяет условию (2);

- результат измерений массовой концентрации акролеина в исходной пробе - среднее арифметическое двух результатов измерений, полученных в условиях повторяемости, расхождение между которыми удовлетворяет условию (2).

Норматив контроля К рассчитывают по формуле:

, - значения характеристики погрешности результатов измерений, установленные в лаборатории при реализации методики, соответствующие массовой концентрации акролеина в пробе с известной добавкой и в исходной пробе соответственно.

Примечание. Допустимо характеристику погрешности результатов измерений при внедрении методики в лаборатории устанавливать на основе выражения: , с последующим уточнением по мере накопления информации в процессе контроля стабильности результатов измерений.

Процедуру измерений признают удовлетворительной при выполнении условия:

При невыполнении условия (4) контрольную процедуру повторяют. При повторном невыполнении условия (4) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

Образцами для контроля внутрилабораторной прецизионности являются пробы крови (рабочие пробы).

При реализации контрольной процедуры получают два результата контрольных измерений (первичного и повторного ) массовой концентрации акролеина в условиях внутрилабораторной прецизионности.

Результат контрольной процедуры признают удовлетворительным при выполнении следующего условия:

и - результаты измерений массовых концентраций акролеина, полученные в условиях внутрилабораторной прецизионности, т.е. в одной лаборатории в разное время, разными операторами;

, - предел внутрилабораторной прецизионности, значения предела внутрилабораторной прецизионности приведены в табл. 4.

При невыполнении условия (5), процедуру повторяют. При повторном превышении предела внутрилабораторной прецизионности выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

Образцами для проверки приемлемости результатов измерений, получаемых в условиях воспроизводимости, являются образцы крови с внесенными в них добавками аттестованного раствора акролеина, подготовленные в соответствии с п. 9.4.2.

Проверку приемлемости результатов измерений, получаемых в условиях воспроизводимости, проводят по результатам измерений массовых концентраций акролеина из образцов крови (специально подготовленные образцы крови с внесенными добавками аттестованного раствора акролеина) с одинаковым содержанием акролеина.

Результаты измерений признают приемлемыми при выполнении условия

и - результаты измерений массовых концентраций акролеина (средние арифметические параллельных определений), полученные в условиях воспроизводимости, т.е. в разных лабораториях;

R - предел воспроизводимости, значения предела воспроизводимости приведены в табл. 3.

При выполнении условия (6) результаты измерений, полученные в двух лабораториях, являются совместимыми и может быть рассчитано общее среднее арифметическое результатов измерений, полученных в двух лабораториях.

При невыполнении условия (6) могут быть проведены процедуры проверки приемлемости согласно раздела 5 ГОСТ Р ИСО 5725-6.