"МУК 4.1.3270-15. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Измерение остаточного содержания флуоксастробина в репке и зеленой массе лука методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 18.06.2015)

1. Разработаны сотрудниками ГНУ "Всероссийский НИИ фитопатологии" (Т.Н. Талалакина, А.М. Макеев).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 22 мая 2015 г. N 1).

3. Утверждены руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 18 июня 2015 г.

4. Введены впервые.

Свидетельство о метрологической аттестации от 27.10.2014 N 01.00225/205-36-14.

Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения массовых концентраций флуоксастробина в репке и зеленой массе лука в диапазоне 0,05 - 0,5 мг/кг.

Методические указания носят рекомендательный характер.

Название вещества по ИСО: флуоксастробин.

Название вещества по ИЮПАК: (1E)-{2-[6-(2-хлорфенокси)-5-фторпиримидин-4-илокси]фенил}(5,6-дигидро-1,4,2-диоксазин-3-ил)метанон O-метилоксим.

Эмпирическая формула: C₂₁H₁₆ClFN₄O₅.

Молекулярная масса: 458,8.

Белое кристаллическое вещество со слабым запахом, состоит из двух оптических изомеров E и Z. Температура плавления: 103 - 108 °C. Давление паров при 20 °C: 6 x 10^-7 мПа. Коэффициент распределения в системе н-октанол/вода при 20 °C: K_ow log P = 2,86. Растворимость (г/дм³) при 20 °C: н-гептан - 0,04, 2-пропанол - 6,7, ксилол - 38,1, ацетон, ацетонитрил, дихлорметан, этилацетат - все > 250; вода - 0,0023.

Вещество стабильно при хранении на воздухе, а также в кислой и щелочной средах (DT₅₀ = > 1 года).

В присутствии света в водных фотолитических условиях флуоксастробин достаточно быстро деградирует с периодом полураспада 4,1 дня.

В биологически активных почвах в аэробных условиях флуоксастробин разрушается достаточно медленно: показатель DT₅₀ варьирует от нескольких дней до нескольких недель.

Острая пероральная токсичность (LD₅₀) для крыс > 2 500 мг/кг; острая дермальная токсичность (LD₅₀) для крыс > 2 000 мг/кг; острая ингаляционная токсичность (LC₅₀) для крыс > 4 998 мг/м³ воздуха. Вещество не обладает раздражающим действием на слизистую оболочку глаз кролика и сенсибилизирующими свойствами. LC₅₀ для рыб - 0,97 мг/дм³ (96 ч). Фунгицид нетоксичен для птиц, пчел, дождевых червей, дафний и водорослей.

Флуоксастробин - системный синтетический фунгицид из класса стробилуринов, являющихся продуцентами гриба Strobilurus tenacellus. Механизм его действия связан с подавлением дыхания, приводящего к прекращению прорастания спор и роста мицелия. Вещество обладает защитным и искореняющим действием. При обработке вегетирующих растений в дозах до 200 г/га оно эффективно подавляет развитие возбудителей ржавчины, септориоза, мучнистой росы, ломкости стеблей и пятнистости листьев на посевах ячменя, пшеницы и других культур, а при протравливании семян зерновых колосовых культур в дозах 50 - 100 г/т защищает последние от заражения твердой и пыльной головней и фузариозной корневой гнилью.

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешности (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышают значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций.

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для всего диапазона измерений (n = 20) приведены в табл. 2.

Метод основан на экстракции флуоксастробина из репки и зеленой массы лука водным раствором ацетонитрила, очистке экстрактов от коэкстрактивных компонентов перераспределением в системе несмешивающихся растворителей и на колонке с силикагелем с последующим измерением содержания - E- и Z-изомеров флуоксастробина в очищенных экстрактах на жидкостном хроматографе с ультрафиолетовым детектированием и обработкой хроматограмм методом абсолютной градуировки.

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Примечание. Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией.

Примечание. Допускается использование вспомогательных средств измерений, устройств и материалов с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

5.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ Р 12.1.019-09, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф.

5.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 и 2.2.5.2308-07. Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004-90.

К выполнению измерений и обработке их результатов допускают лиц, имеющих высшее или специальное химическое образование, опыт работы в химической лаборатории, прошедших обучение и владеющих техникой проведения хроматографического анализа, освоивших метод анализа в процессе тренировки и уложившихся в нормативы контроля.

При выполнении измерений соблюдают следующие условия.

Температура воздуха (20 +/- 5) °C

Атмосферное давление 84 - 106 кПа

Относительная влажность воздуха не более 80%.

Температура колонки: комнатная.

Подвижная фаза: ацетонитрил-0,025%-ая уксусная кислота (58:42 по объему).

Скорость потока элюента: 0,85 см³/мин.

Рабочая длина волны: 250 нм.

Объем вводимой пробы: 20 мм³.

Линейный диапазон детектирования: 1 - 10 нг.

Измерениям предшествуют следующие операции: очистка органических растворителей, приготовление подвижной фазы для высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), кондиционирование хроматографической колонки, градуировка хроматографа, подготовка колонки с силикагелем, проверка хроматографического поведения изомеров флуоксастробина на колонке.

Ацетон перегоняют над перманганатом калия и калием углекислым (на 1 дм³ ацетона - 10 г калия перманганата и 2 г калия углекислого).

Навеску (5,0 +/- 0,1) г натрия углекислого в конической колбе растворяют в 40 - 60 см³ деионизованной воды. Полученный раствор переносят в мерную колбу вместимостью 100 см³ и доводят объем раствора до метки деионизованной водой.

Срок хранения раствора 1 неделя.

Этилацетат промывают последовательно раствором натрия углекислого с массовой долей 5%, насыщенным раствором хлорида кальция, сушат над безводным углекислым калием и перегоняют.

Растворитель последовательно промывают порциями концентрированной серной кислоты до прекращения окрашивания последней в желтый цвет, затем водой до нейтральной реакции промывных вод, перегоняют над калием углекислым.

В мерную колбу вместимостью 1 000 см³ помещают 250 - 300 см³ бидистиллированной воды, вносят 0,25 см³ ледяной уксусной кислоты, доводят водой до метки, перемешивают.

В мерную колбу вместимостью 1 000 см³ помещают 580 см³ ацетонитрила, вносят 420 см³ раствора уксусной кислоты с массовой долей 0,025%, перемешивают, фильтруют через мембранный фильтр.

Промывают хроматографическую колонку подвижной фазой для ВЭЖХ, приготовленной по п. 8.2.2, при скорости подачи растворителя 0,5 см³/мин не менее 2 часов до установления стабильной базовой линии (дрейф базовой линии в течение 1 часа не более 5%, а уровень шумов не более 2% от верхнего значения шкалы измерений).

В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают (0,0100 +/- 0,0001) г E- или Z-изомера флуоксастробина, растворяют в 40 - 50 см³ ацетонитрила, доводят объем раствора ацетонитрилом до метки, тщательно перемешивают.

Раствор хранят в морозильной камере при температуре не выше (-18) °C в течение месяца.

В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 10 см³ исходного раствора E- или Z-изомера флуоксастробина с массовой концентрацией 100 мкг/см³ (п. 8.4.1), раствор разбавляют ацетонитрилом и доводят объем до метки. Этот раствор используют для приготовления градуировочных растворов N 2 - 5 и проб репки и зеленой массы лука с внесением при оценке полноты извлечения флуоксастробина из исследуемых образцов.

Градуировочный раствор N 1 хранят в морозильной камере при температуре не выше (-18) °C в течение месяца.

В 4 мерные колбы вместимостью 100 см³ помещают 0,5; 1,0; 2,5 и 5,0 см³ градуировочного раствора E- или Z-изомера флуоксастробина с массовой концентрацией 10 мкг/см³ (п. 8.4.2), объем доводят до метки подвижной фазой, приготовленной по п. 8.2.2, каждый раствор тщательно перемешивают, получают растворы N 2 - 5 с массовой концентрацией E- и Z-изомеров флуоксастробина 0,05; 0,10; 0,25 и 0,5 мкг/см³ соответственно.

Растворы готовят непосредственно перед использованием.

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади пика (мВ) от массовой концентрации E- или Z-изомера флуоксастробина в растворе (мкг/см³), устанавливают методом абсолютной градуировки по 4 градуировочным растворам (п. 8.4.3).

В инжектор хроматографа вводят по 20 мм³ каждого градуировочного раствора (п. 8.4.3) и анализируют при условиях п. 7.2. Осуществляют не менее 3 параллельных определений. Расхождение между параллельными определениями не должно превышать предел повторяемости r.

По полученным данным строят градуировочные характеристики.

Контроль стабильности градуировки проводят не реже 1 раза в три месяца, а также при смене реактивов или изменении условий анализа.

Для контроля стабильности используют вновь приготовленные градуировочные растворы с массовой концентрацией исследуемого вещества в начале, середине и в конце диапазона измерений, которые анализируют в точном соответствии с методикой.

Градуировочная характеристика считается стабильной, если для каждого контрольного образца выполняется условие:

X - содержание E- или Z-изомера флуоксастробина в пробе при контрольном измерении, мкг;

C - известное содержание E- или Z-изомера флуоксастробина в градуировочном растворе, взятом для контроля стабильности градуировочной характеристики, мкг;

B - норматив контроля погрешности градуировочной характеристики, % (равен 10% при P = 0,95).

Если величина расхождения (A) превышает 10%, делают вывод о невозможности применения градуировочной характеристики для дальнейших измерений. В этом случае выясняют причины нестабильности и повторяют контроль стабильности с использованием других образцов для градуировки, предусмотренных методикой. При повторном обнаружении нестабильности градуировки прибор градуируют заново согласно п. 8.5.

Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

Нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см и внутренним диаметром 8 - 10 мм уплотняют тампоном из стекловаты, медленно выливают в колонку (при открытом кране) суспензию 5 г силикагеля в 20 см³ этилацетата. Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента и помещают на него слой безводного сернокислого натрия высотой 1 см. Колонку последовательно промывают 20 см³ этилацетата и 20 см³ смеси гексан-этилацетат с объемным соотношением компонентов 8:2 со скоростью 1 - 2 капли в секунду, после чего она готова к работе.

В круглодонную колбу вместимостью 10 см³ помещают 0,1 см³ градуировочных растворов E- и Z-изомеров флуоксастробина с массовой концентрацией 10 мкг/см³ в ацетонитриле (п. 8.4.2). Раствор упаривают досуха, остаток растворяют в 3 см³ смеси гексан-этилацетат в объемном соотношении 8:2, помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин. Раствор наносят на колонку, подготовленную по п. 8.7, элюат отбрасывают. Через колонку пропускают 80 см³ смеси гексан-этилацетат в объемном соотношении 6:4 со скоростью 2 - 3 капли в секунду, отбирая последовательно по 10 см³ элюата. Каждую фракцию упаривают, остатки растворяют в 1 см³ ацетонитрила, помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин, вносят 2 см³ подвижной фазы, подготовленной по п. 8.2.2, перемешивают, а затем хроматографируют в соответствии с п. 7.2.

По результатам обнаружения изомеров флуоксастробина в каждой из фракций определяют объем смеси гексан-этилацетат с объемным соотношением компонентов 6:4, необходимый для полного вымывания фунгицида из колонки.

Примечание. Проверку хроматографического поведения флуоксастробина проводят обязательно, поскольку профиль вымывания вещества может изменяться при использовании новой партии сорбента и растворителей.

Отбор проб производится в соответствии с правилами, определенными ГОСТ 1723-86 "Лук репчатый свежий заготовляемый и поставляемый. Технические условия", ГОСТ Р 51783-01 "Лук репчатый свежий, реализуемый в розничной торговой сети. Технические условия", "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (N 2051-79 от 21.08.79).

Отобранные пробы хранят в стеклянной или полиэтиленовой таре в холодильнике не более 5 дней. Для длительного хранения образцы замораживают и хранят при температуре не выше -18 °C. Перед анализом образцы измельчают.

В мерную колбу вместимостью 500 см³ вносят 50 см³ бидистиллированной воды и доводят объем раствора до метки ацетонитрилом. Срок хранения - 1 неделя.

Навеску измельченного образца массой 20 г помещают в стакан гомогенизатора вместимостью 500 см³, приливают 100 см³ водного раствора ацетонитрила с объемной долей 90% и гомогенизируют 3 минуты при 10 000 об./мин. Суспензию фильтруют под вакуумом на воронке Бюхнера через бумажный фильтр в колбу Бунзена вместимостью 250 см³. Осадок переносят в коническую колбу вместимостью 250 см³, приливают 50 см³ водного раствора ацетонитрила с объемной долей 90%, перемешивают и колбу помещают на аппарат для встряхивания на 20 минут. Суспензию фильтруют и остаток на фильтре промывают 10 см³ ацетонитрила. Экстракт и промывную жидкость переносят в химический стакан, перемешивают, измеряют объем раствора. Переносят 1/4 часть экстракта, эквивалентную 5 г образца, в круглодонную колбу вместимостью 100 см³ и упаривают на роторном вакуумном испарителе при температуре не выше 40 °C до водного остатка (~2 - 3 см³). Далее проводят очистку экстракта по п. 10.2.

Водный остаток в колбе, полученный по п. 10.1, переносят в делительную воронку вместимостью 100 см³, добавляют 30 см³ бидистиллированной воды и 30 см³ гексана, предварительно обмыв ими колбу, в которой находилась проба, интенсивно встряхивают в течение 1 минуты. После разделения фаз верхний гексановый слой собирают, нижний водный слой возвращают в воронку и экстрагируют дважды гексаном порциями по 20 см³. Объединенный гексановый экстракт фильтруют через слой безводного сернокислого натрия в круглодонную колбу вместимостью 100 см³, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 40 °C и остаток подвергают дополнительной очистке на колонке с силикагелем по п. 10.3.

Остаток в круглодонной колбе, полученный по п. 10.2, растворяют в 2 см³ смеси гексан-этилацетат в объемном соотношении 8:2, помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин. Раствор наносят на колонку с силикагелем, подготовленную по п. 8.7. Колбу обмывают 2 см³ смеси гексан-этилацетат в объемном соотношении 8:2, которые также наносят на колонку. Элюат отбрасывают. Промывают колонку 25 см³ смеси гексан-этилацетат с объемным соотношением компонентов 6:4 со скоростью 1 - 2 капли в секунду, элюат отбрасывают. Флуоксастробин элюируют с колонки 60 см³ смеси гексан-этилацетат с объемным соотношением компонентов 6:4 со скоростью 1 - 2 капли в секунду, собирая элюат в круглодонную колбу вместимостью 100 см³. Раствор упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 40 °C. Сухой остаток экстрактов зеленой массы и репки лука растворяют в 5 см³ подвижной фазы для ВЭЖХ, подготовленной по п. 8.2.2, помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин, и анализируют на содержание флуоксастробина по п. 11.

Полнота извлечения изомеров флуоксастробина при проведении всех операций подготовки пробы не менее 83% для образцов репки и зеленой массы лука.

11.1. В инжектор хроматографа вводят 20 мм³ очищенного экстракта анализируемой пробы (пп. 10.1 - 10.3), анализируют при условиях п. 7.2 и регистрируют хроматограмму. Каждый экстракт хроматографируют дважды.

11.2. Для каждого образца репки и зеленой массы повторяют операции по пп. 10.1 - 10.3, 11.1.

12.1. Для обработки результатов хроматографического анализа используют программу сбора и обработки хроматографической информации.

По градуировочным характеристикам находят значение массовой концентрации каждого из изомеров флуоксастробина в экстрактах, C, мкг/см³.

Массовую долю E- и Z-изомеров флуоксастробина X, мг/кг в образцах репки и зеленой массы рассчитывают по формуле:

C - значение массовой концентрации E- и Z-изомеров флуоксастробина в экстракте, мкг/см³,

V_экстр - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, см³,

m - масса анализируемой части образца, соответствующая доле экстракта, использованной для очистки на колонке с силикагелем и последующего хроматографического определения, г;

0,83 - коэффициент извлечения E- и Z-изомеров флуоксастробина, учитывающий все процедуры подготовки пробы.

Общее содержание флуоксастробина в каждой из матриц определяют как сумму массовой доли E- и Z-изомеров вещества.

12.2. За результат измерений принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, если выполняется условие приемлемости

X₁, X₂ - результаты параллельных определений массовой доли E- и Z-изомеров флуоксастробина, мг/кг;

r - значение предела повторяемости, % (табл. 1).

Если условие (3) не выполняется, выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и повторяют выполнение измерений в соответствии с требованиями методики.

12.3. Результат анализа в документах, предусматривающих его использование, представляют в виде:

- среднее арифметическое значение результатов n определений, признанных приемлемыми по п. 12.2, мг/кг;

- границы относительной погрешности измерений, % (табл. 1).

В случае, если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание флуоксастробина в пробах репки и зеленой массы лука менее 0,05 мг/кг" <*>

--------------------------------

<*> - 0,05 мг/кг - предел обнаружения.

Экстракты, при хроматографировании которых получают аналитический сигнал флуоксастробина, превышающий аналитический сигнал, получаемый при хроматографировании градуировочного раствора с массовой концентрацией 0,5 мкг/см³, разбавляют подвижной фазой и анализируют в соответствии с данной методикой.

13.1. Проверку приемлемости результатов измерений в условиях воспроизводимости проводят:

а) при возникновении спорных ситуаций между двумя лабораториями;

б) при проверке совместимости результатов измерений, полученных при сличительных испытаниях (при проведении аккредитации лабораторий и инспекционного контроля).

13.2. Для проведения проверки приемлемости результатов измерений в условиях воспроизводимости каждая лаборатория использует пробы, оставленные на хранение.

13.3. Расхождение между результатами измерений, выполненных в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), не должно превышать предела воспроизводимости (R):

X₁, X₂ - результаты измерений массовой доли флуоксастробина, выполненных в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), мг/кг;

R - предел воспроизводимости (%), рассчитываемый по формуле .

Если предел воспроизводимости не превышен, то приемлемы все результаты измерений и в качестве окончательного результата используют их среднее арифметическое значение. Если предел воспроизводимости превышен, то выполняют процедуры, изложенные в ГОСТ Р ИСО 5725-6-02 (п. 5.3.3).

При разногласиях руководствуются ГОСТ Р ИСО 5725-6-02 (п. 5.3.4).

Контроль качества результатов измерений в лаборатории при реализации методики осуществляют по ГОСТ Р ИСО 5725-6-02 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений", используя контроль стабильности среднеквадратического (стандартного) отклонения повторяемости по п. 6.2.2 ГОСТ Р ИСО 5725-6-02 и показателя правильности по п. 6.2.4 ГОСТ Р ИСО 5725-6-02.

Рекомендуется устанавливать контролируемый период так, чтобы количество результатов контрольных измерений было от 20 до 30.

При неудовлетворительных результатах контроля, например, при превышении предела действия или регулярном превышении предела предупреждения, выясняют причины этих отклонений, в том числе проводят смену реактивов, проверяют работу оператора.