"МУК 4.1.3183-14. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств квинмерака в ботве и корнеплодах сахарной свеклы методом газожидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 24.07.2014)

Разработаны сотрудниками "Всероссийского НИИ защиты растений" С.-Петербург (Долженко В.И., Цибульская И.А., Карпова Л.М.).

Свидетельство о метрологической аттестации N 01.5.04.174/01.00043/2014.

Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода газожидкостной хроматографии для определения в ботве и корнеплодах сахарной свеклы массовой концентрации квинмерака в диапазоне концентраций 0,05 - 0,5 мг/кг.

Методические указания носят рекомендательный характер.

Название действующего вещества по ИСО: квинмерак.

Название действующего вещества по ИЮПАК: 7-хлор-3-метилхинолинил-8-карбоновая кислота.

Структурная формула:

Эмпирическая формула: C₁₁H₈ClNO₂.

Молекулярная масса: 221,63.

Химически чистый препарат - бесцветное кристаллическое вещество без запаха.

Температура плавления: 244 °C. Давление пара при 20 °C: < 0,01 мПа.

Коэффициент распределения октанол-вода K_ow logP = -1,11 (pH 7), 20 °C. pK_a - 4,32 (20 °C).

Растворимость при 20 °C, г/дм³: в воде - 240; ацетоне и хлористом метилене - 2,0; этаноле и ацетонитриле - 1,0; н-гексане и этилацетате < 1,0.

Стабилен при нагревании, на свету и в водной среде при pH 3 - 9. ДТ₅₀ в почве 12 - 38 дней.

Краткая токсикологическая характеристика. ЛД₅₀ пероральная (в мг/кг) для крыс > 5 000, дермальная > 2 000. Не оказывает раздражающего действия на кожу и глаза кроликов.

Гигиенические нормативы. МДУ для квинмерака в рапсе 0,1 мг/кг, в сахарной свекле не установлен.

Область применения. Гербицид для борьбы с однолетними двудольными сорными растениями, эффективен на посевах сахарной свеклы и рапса.

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций.

Метрологическая характеристика метода представлена в табл. 1 и 2.

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для полного диапазона концентраций (n = 20, P = 0,95) приведены в табл. 2.

Методика основана на определении квинмерака методом газожидкостной хроматографии с использованием электронозахватного детектора (ДЭЗ) или детектора постоянной скорости рекомбинации ионов (ДПР) после его извлечения из растительного материала ацетоном с последующей очисткой экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей, метилировании и дальнейшей очисткой на колонке с флорисилом.

Идентификация квинмерака проводится по времени удерживания, количественное определение - методом абсолютной калибровки. Избирательность метода обеспечивается сочетанием условий подготовки проб и хроматографирования.

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Примечание. Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией, не требующих дополнительной очистки растворителей.

Примечание. Допускается применение оборудования и материалов с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-09, а также требования, изложенные в технической документации на газовый хроматограф.

4.2. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией, соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и 2.2.5.2308-07. Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004-90.

4.3. При работе с газами, находящимися в баллонах под давлением до 15 мПа (150 кгс/см²) необходимо соблюдать "Правила устройства и безопасной эксплуатации стационарных компрессорных установок, воздуховодов и газопроводов под давлением" ПБ-03-576-03. Запрещается открывать вентиль баллона, не установив на нем понижающий редуктор.

Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист-химик, имеющий опыт работы методом газожидкостной хроматографии, ознакомленный с руководством по эксплуатации хроматографа, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 14.

При выполнении измерений выполняют следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C и относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на газовом хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Отбор проб свеклы производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (от 21.08.79 N 2051-79), а также в соответствии с ГОСТ 1722-85 "Свекла столовая свежая, заготовляемая и поставляемая". Для длительного хранения аналитические пробы свеклы (ботва и корнеплоды) помещают в морозильную камеру с температурой -18 °C и хранят в закрытой полиэтиленовой таре.

Перед началом работы рекомендуется проверить чистоту применяемых органических растворителей. Для этого 100 мл растворителя упаривают в ротационном вакуумном испарителе при температуре 40 °C до объема 1,0 см³ и хроматографируют. При обнаружении мешающих определению примесей очистку растворителей производят в соответствии с общепринятыми методиками.

Перед началом анализа насадочную колонку, не присоединяя к детектору, кондиционируют в токе инертного газа (азот) при температуре 250 °C до получения стабильной нулевой линии.

8.3.1. Приготовление 40%-го гидроксида калия. В мерную колбу на 100 см³ наливают 40 см³ дистиллированной воды, вносят в колбу 40 г гидроксида калия. Раствор перемешивают и после охлаждения доводят до метки дистиллированной водой.

8.3.2. Приготовление элюента N 1 для колоночной хроматографии. В мерной колбе объемом 100 см³ смешивают 50 см³ н-гексана и 50 см³ этилацетата.

8.3.3. Приготовление элюента N 2 для колоночной хроматографии. В мерной колбе объемом 100 см³ смешивают 70 см³ н-гексана и 30 см³ этилацетата.

8.3.4. Приготовление метилирующей смеси. В коническую колбу 100 см³ вносят 20 см³ 40%-го раствора гидроксида калия и 50 см³ диэтилового эфира, колбу помещают в баню со льдом и охлаждают до температуры 3 - 4 °C. После чего в колбу начинают постепенно добавлять нитрозометилмочевину (5 г), осторожно покачивая колбу. Колбу оставляют в холодной бане на 10 - 15 мин, затем сливают полученный раствор диазометана в чистую колбу и сушат над гидроксидом калия в течение 3 ч в эксикаторе в вытяжном шкафу. Колбу с метилирующей смесью хранят в холодильнике 24 - 48 ч неплотно закрытой.

8.4.1. Основной раствор с концентрацией 0,5 мг/см³. Точную навеску квинмерака (50 +/- 0,1) мг помещают в мерную колбу на 100 см³, растворяют в ацетоне и доводят до метки тем же растворителем.

Рабочие растворы с концентрациями 0,5; 1,0; 2,0 и 5,0 мкг/см³ готовят методом последовательного разбавления основного раствора по объему, используя н-гексан.

8.4.2. Раствор N 1 с концентрацией квинмерака 5 мкг/см³. В мерную колбу вместимостью 100 см³ вносят 1 см³ основного раствора и доводят объем до метки гексаном.

8.4.3. Раствор N 2 с концентрацией квинмерака 2,5 мкг/см³. В мерную пробирку вместимостью 10 см³ вносят 5 см³ раствора N 1 и доводят объем до метки гексаном.

8.4.4. Раствор N 3 с концентрацией квинмерака 1 мкг/см³. В мерную пробирку вместимостью 10 см³ вносят 5 см³ раствора N 3 и доводят объем до метки гексаном.

8.4.5. Раствор N 4 с концентрацией квинмерака 0,5 мкг/см³. В мерную пробирку вместимостью 10 см³ вносят 5 см³ раствора N 3 и доводят объем до метки гексаном.

Основной раствор хранится в холодильнике в течение 2 месяцев, рабочие растворы - в течение 2 недель.

Для внесения в образец ботвы или корнеплодов сахарной свеклы при определении полноты извлечения используют растворы квинмерака, приготовленные из основного раствора методом последовательного разбавления ацетоном.

Для приготовления градуировочных растворов в мерные пробирки со шлифом емкостью 5,0 см³ вносят по 1,0 см³ рабочих растворов квинмерака с концентрациями 5,0; 2,5; 1,0 и 0,5 мкг/см³. Растворитель в пробирках упаривают в токе азота досуха и проводят метилирование квинмерака по п. 8.5.

В пробирки с сухим остатком добавляют по 2,0 см³ свежеприготовленного по п. 8.3.4 эфирного раствора диазометана. Пробирки закрывают пробками и ставят на 12 - 14 ч (на ночь) в холодильник с температурой 4 - 6 °C. После этого этиловый эфир в пробирках упаривают в токе азота досуха и сухой остаток растворяют в 1,0 см³ н-гексана.

Для построения градуировочного графика (площадь пика - концентрация квинмерака в растворе) в хроматограф вводят по 1 мм³ градуировочных растворов (не менее 3 параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4 точек по диапазону измеряемых концентраций). Затем измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации определяемого компонента в градуировочном растворе.

Методом наименьших квадратов рассчитывают градуировочный коэффициент (K) в уравнении линейной регрессии:

где S - площадь пика градуировочного раствора.

Градуировку признают удовлетворительной, если значение коэффициента линейной корреляции оказывается не ниже 0,99.

Градуировочную характеристику необходимо проверять при замене реактивов, хроматографической колонки или элементов хроматографической системы, а также при отрицательном результате контроля градуировочного коэффициента.

Градуировочную зависимость признают стабильной при выполнении следующего условия:

где C - аттестованное значение массовой концентрации определяемого компонента в градуировочном растворе;

C_к - результат контрольного измерения массовой концентрации определяемого компонента в градуировочном растворе;

- норматив контроля градуировочного коэффициента, % ( при P = 0,95).

8.7.1. На дно стеклянной колонки длиной 25 см и внутренним диаметром 10 мм с закрытым краном помещают тампон из стекловаты и частично заполняют элюентом N 1 и затем через воронку вливают непрерывной струей подвижную суспензию 4 г флорисила в элюенте N 1, дают растворителю слиться через кран, чтобы сорбент осел, и постукивают по колонке куском толстостенного резинового шланга, чтобы сорбент уплотнился, не допуская падения уровня растворителя ниже уровня слоя сорбента с помощью крана. Сверху наносят слой 5 - 10 мм безводного сульфата натрия и, открыв кран, промывают колонку 20 см³ н-гексана. Когда уровень растворителя достигнет верхнего слоя сорбента в колонке, кран закрывают. Колонка готова к работе.

8.7.2. Проверка хроматографического поведения метилового эфира квинмерака на колонке с флорисилом.

В круглодонную колбу емкостью 10 см³ отбирают 1 см³ стандартного раствора метилового эфира квинмерака в н-гексане с концентрацией 1 мкг/см³. Отдувают растворитель током азота. Сухой остаток количественно переносят тремя порциями по 2 см³ н-гексана в подготовленную хроматографическую колонку с флорисилом.

Промывают колонку последовательно 10 см³ н-гексана, 10 см³ элюента N 1 и 30 см³ элюента N 2, отбирая фракции по 10 см³ каждая. Фракции упаривают досуха, растворяют в 2 см³ гексана и анализируют на содержание метилового эфира квинмерака.

Фракции, содержащие метиловый эфир квинмерака, объединяют, упаривают досуха, остаток растворяют в 2 см³ гексана и вновь хроматографируют. Рассчитывают содержание метилового эфира квинмерака в объединенной фракции, определяют полноту вымывания из колонки и необходимый для этого объем элюента.

Примечание. Необходимо проверять профиль вымывания метилового эфира квинмерака при использовании новой партии сорбента и растворителей.

К навеске (50 +/- 0,5) г измельченных корнеплодов или ботвы сахарной свеклы добавляют 100 см³ ацетона и встряхивают в течение 30 мин в перемешивающем устройстве. Экстракт аккуратно сливают, фильтруя через бумажный фильтр под вакуумом на воронке Бюхнера в коническую колбу объемом 500 см³. Экстракцию повторяют еще дважды порциями ацетона по 100 см³. Осадок на фильтре промывают 20 см³ ацетона. Из объединенного фильтрата отбирают аликвоту раствора, эквивалентную 10 г навески, т.е. 1/5 часть суммарного объема фильтрата, и упаривают на роторном вакуумном испарителе при температуре 30 °C до водного остатка.

Водный остаток переносят в делительную воронку емкостью 250 мл. Концентратор обмывают 100 см³ дистиллированной воды и присоединяют к водному остатку. В делительную воронку вносят 30 см³ н-гексана, встряхивают в течение 2 мин и после разделения фаз гексановый слой отбрасывают. Промывку водного остатка повторяют дважды порциями н-гексана по 30 см³. Водный остаток подкисляют муравьиной кислотой до pH 3,5 и экстрагируют квинмерак 50 см³ дихлорметана, встряхивая делительную воронку в течение 2 мин. Органический слой собирают, фильтруя его через фильтр с безводным сульфатом натрия, в колбу-концентратор объемом 100 см³. Операцию повторяют еще дважды порциями дихлорметана по 30 см³. Промывают фильтр 10 см³ дихлорметана. Объединенный органический экстракт упаривают на роторном вакуумном испарителе при температуре 30 °C до объема 1 - 2 см³, затем досуха в токе азота. Сухой остаток метилируют по п. 8.5.

В хроматограф вводят 2 мм³ раствора.

При необходимости проводят дополнительную очистку экстракта на колонке с флорисилом по п. 9.2.

Сухой остаток, полученный по п. 8.1, растворяют в 5 см³ н-гексана и переносят на колонку с флорисилом. Элюат отбрасывают. Колбу-концентратор последовательно обмывают 10 см³ н-гексана и 10 см³ элюата N 2, каждый раз перенося смывы на колонку. Элюаты отбрасывают. Метиловый эфир квинмерака элюируют 15 - 20 см³ элюата N 1 в колбу-концентратор, раствор упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °C. Сухой остаток растворяют в 1 см³ н-гексана. В хроматограф вводят 2 мм³ раствора.

Газовый хроматограф с детектором постоянной скорости рекомбинации ионов, колонка стеклянная, длиной 2 м, внутренним диаметром 3 мм, с неподвижной полярной фазой на инертном носителе (0,16 - 0,20). Температура колонки: 210 °C, детектора: 300 °C, испарителя: 250 °C. Расход газа-носителя 1 (азот): 50 см³/мин. Дозируемый объем: 2 мм³. Анализируемый объем: 1 см³. Абсолютное время удерживания квинмерака (в виде метилового эфира): (3,75 +/- 0,05) мин.

Количественное определение квинмерака проводят методом абсолютной калибровки и вычисляют по формуле:

где X - содержание квинмерака в пробе, мг/кг;

H₂ - площадь пика анализируемого вещества, мм² (усл. ед.);

H₁ - площадь пика стандартного вещества, мм² (усл. ед.);

C - концентрация стандартного раствора, мкг/см³;

V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, см³;

P - масса анализируемого образца, г.

Содержание остаточных количеств квинмерака в анализируемом образце вычисляют как среднее из двух параллельных определений. При получении зашкаленных пиков анализируемый раствор разбавляют н-гексаном.

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости:

где X₁, X₂ - результаты параллельных определений, мг/кг;

r - значение предела повторяемости .

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

Результат анализа представляют в виде:

мг/кг при вероятности P = 0,95,

где - среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

- граница абсолютной погрешности, мг/кг:

где - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

В случае, если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде: "содержание вещества в пробе менее 0,05 мг/кг" <*>, где <*> - 0,05 мг/кг - предел определения квинмерака в корнеплодах свеклы.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1 - 6-02 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.

Величина добавки C_д должна удовлетворять условию:

где - характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой соответственно), мг/кг;

при этом:

где - граница абсолютной погрешности, мг/кг:

где - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

Результат контроля процедуры K_к рассчитывают по формуле:

где X', X, C_д - среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки соответственно, мг/кг.

Норматив контроля K рассчитывают по формуле:

Проводят сопоставление результата контроля процедуры (K_к) с нормативом контроля (K).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию

процедуру анализа признают удовлетворительной. При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):

где X₁, X₂ - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;

R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций), %.