"МУК 4.1.3514-17. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств касугамицина в капусте, томатах и томатном соке, плодах и соке яблок методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 29.12.2017)

1. Разработаны сотрудниками ФГБНУ "Всероссийский НИИ защиты растений" (В.И. Долженко, А.С. Комарова) и ООО "Инновационный центр защиты растений" (И.А. Цибульская, Т.Д. Черменская), Санкт-Петербург, Пушкин.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 24 ноября 2017 г. N 1).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 29 декабря 2017 г.

4. Введены впервые.

Свидетельство об аттестации методики (метода) измерений N 88-16207-035-RA.RU.310657-2017.

Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием для определения массовой концентрации касугамицина в капусте, томатах и томатном соке, плодах и соке яблок в диапазоне концентраций 0,05 - 0,5 мг/кг.

Методические указания носят рекомендательный характер.

[5-амино-2-метил-6-(2,3,4,5,6-пентагидроксициклогексилокси)тетрагидропиран-3-ил]амино--иминоуксусная кислота гидрохлорид (IUPAC).

Структурная формула:

Эмпирическая формула: C₁₄H₂₅N₃O₉ x HCl.

Молекулярная масса: 415,8.

Химически чистое вещество представляет собой бесцветное кристаллическое вещество. Температура плавления: 202 - 204 °C. Давление пара при 25 °C: < 1,3 x 10^-2 МПа.

Растворимость (в г/дм³ при 25 °C): вода - 125, метанол - 0,003, в ацетоне и ксилоле < 0,001.

Стабилен при комнатной температуре. Стабилен в слабых кислотах и нестабилен в сильных кислотах и щелочах. DT₅₀ (50 °C): 47 дней (pH 5), 14 дней (pH 9).

Краткая токсикологическая характеристика. Острая пероральная токсичность LD₅₀ для крыс более 5 000 мг/кг, острая дермальная токсичность LD₅₀ для кроликов более 2 000 мг/кг. Не оказывает раздражающего действия на кожу и слизистую оболочку глаз кролика, не обладает мутагенными и тератогенными свойствами, не влияет на репродукцию крыс.

Область применения препарата. Системный фунгицид и бактерицид, получаемый ферментацией Streptomyces kasugaensis. Используется для контроля грибных и бактериальных заболеваний на рисе, овощных и плодовых культурах. Не фитотоксичен для риса, томатов, сахарной свеклы, картофеля и др.

В России для касугамицина гигиенические нормативы не установлены.

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций.

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительные интервалы среднего результата для полного диапазона концентраций (n = 20) приведены в табл. 2.

Метод основан на определении касугамицина с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием масс-спектрометрического детектора после извлечения из образцов подкисленным метанолом.

Идентификация касугамицина проводится по времени удерживания, количественное определение - методом абсолютной калибровки.

Избирательность метода обеспечивается сочетанием условий подготовки проб и хроматографирования.

Примечание. Допускается использование других средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Примечание. Допускается использование других реактивов с более высокой квалификацией, не требующих дополнительной очистки растворителей.

Примечание. Допускается использование вспомогательных устройств и материалов с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-09, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф.

4.2. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией, соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и ГН 2.2.5.2308-07.

Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004-90.

4.3. При работе с газами, находящимися в баллонах под давлением до 15 МПа (150 кгс/см²), необходимо соблюдать Федеральные нормы и правила в области промышленной безопасности "Правила промышленной безопасности опасных производственных объектов, на которых используется оборудование, работающее под избыточным давлением" (утв. приказом Ростехнадзора от 25.03.2014 N 116). Запрещается открывать вентиль баллона, не установив на нем понижающий редуктор.

Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист, имеющий опыт работы на жидкостном хроматографе, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений.

При выполнении измерений выполняют следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C и относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Перед началом анализа аналитическую колонку кондиционируют в потоке подвижной фазы (0,2 - 0,3 см³/мин) до стабилизации нулевой линии.

Компонент A - раствор 0,5%-й (по объему) муравьиной кислоты в воде. В мерную колбу вместимостью 1 000 см³ помещают 300 - 400 см³ бидистиллированной воды, вносят 5,0 см³ муравьиной кислоты, доводят водой до метки, перемешивают.

Компонент B - раствор 0,5%-й (по объему) муравьиной кислоты в метаноле. В мерную колбу вместимостью 1 000 см³ помещают 300 - 400 см³ метанола, вносят 5,0 см³ муравьиной кислоты, доводят метанолом до метки, перемешивают.

7.2.2. Раствор для экстракции и приготовления растворов - 1%-й раствор муравьиной кислоты в метаноле: 10 см³ муравьиной кислоты помещают в мерную колбу объемом 1 дм³ и доводят объем до метки метанолом.

7.3.1. Основной раствор касугамицина с концентрацией 0,5 мг/см³: точную навеску касугамицина гидрохлорида (55 +/- 0,5) мг помещают в мерную колбу вместимостью 100 см³, растворяют в метаноле и доводят объем до метки метанолом.

7.3.2. Приготовление градуировочных растворов

Градуировочные растворы с концентрациями касугамицина 0,002; 0,005; 0,01; 0,02 и 0,05 мкг/см³ готовят методом последовательного разбавления по объему, используя 1%-й раствор муравьиной кислоты в метаноле.

7.3.2.1. Раствор N 1 с концентрацией 1,0 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 100 см³ вносят 0,2 см³ основного раствора и доводят до метки 1%-м раствором муравьиной кислоты в метаноле.

7.3.2.2. Раствор N 2 с концентрацией 0,05 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 0,5 см³ раствора N 1 и доводят до метки 1%-м раствором муравьиной кислоты в метаноле.

7.3.2.3. Раствор N 3 с концентрацией 0,02 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 0,2 см³ раствора N 1 и доводят объем до метки 1%-м раствором муравьиной кислоты в метаноле.

7.3.2.4. Раствор N 4 с концентрацией 0,01 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 0,1 см³ раствора N 1 и доводят объем до метки 1%-м раствором муравьиной кислоты в метаноле.

7.3.2.5. Раствор N 5 с концентрацией 0,005 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 1,0 см³ раствора N 2 и доводят объем до метки 1%-м раствором муравьиной кислоты в метаноле.

7.3.2.6. Раствор N 6 с концентрацией 0,002 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 1,0 см³ раствора N 3 и доводят объем до метки 1%-м раствором муравьиной кислоты в метаноле.

Основной раствор касугамицина можно хранить в холодильнике при температуре 0 - 4 °C в течение 6 месяцев, градуировочные растворы - в течение недели.

При изучении полноты определения касугамицина используют метанольные растворы веществ, приготовленные из основного раствора методом последовательного разбавления по объему метанолом.

Для каждого из градуировочных растворов регистрируют хроматограммы в условиях, указанных в п. 9.2, и определяют абсолютное время удерживания и площадь пика касугамицина (в усл. ед.), соответствующего MRM . Одновременно в режиме автоматической обработки данных определяют соотношение площадей пиков для касугамицина, соответствующих MRM и MRM (S₁₁₂/S₇₀).

Для установления градуировочной характеристики (площадь пика - концентрация касугамицина в растворе) в хроматограф вводят по 3 мм³ градуировочных растворов (не менее 3 параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4 точек по диапазону измеряемых концентраций). Затем измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации касугамицина в градуировочном растворе.

Методом наименьших квадратов рассчитывают градуировочный коэффициент (K) в уравнении линейной регрессии:

S - площадь пика градуировочного раствора.

Градуировку признают удовлетворительной, если значение коэффициента линейной корреляции оказывается не ниже 0,99.

Градуировочную характеристику необходимо проверять при замене реактивов, хроматографической колонки или элементов хроматографической системы, а также при отрицательном результате контроля градуировочного коэффициента.

Градуировочную зависимость признают стабильной при выполнении следующего условия:

C - аттестованное значение массовой концентрации касугамицина в градуировочном растворе;

C_к - результат контрольного измерения массовой концентрации касугамицина в градуировочном растворе;

- норматив контроля градуировочного коэффициента, % ( при P = 0,95).

Отбор проб проводится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (N 2051-79 от 21.08.79). Пробы капусты отбирают в соответствии с ГОСТ 1724-85 "Капуста белокочанная свежая, заготовляемая и поставляемая. Технические условия (с Изменениями N 1 - 4)"; томатов - в соответствии с ГОСТ 1725-85 "Томаты свежие. Технические условия"; яблок - в соответствии с ГОСТ 27572-87 "Яблоки свежие для промышленной переработки". Пробы капусты, томатов и томатного сока, яблок и яблочного сока хранят до анализа в герметичной таре в морозильной камере при температуре не выше -18 °C, сок хранят в холодильнике при температуре 0 - 4 °C в стеклянной таре с притертой пробкой в течение недели.

Навеску измельченной матрицы или сока 10 г помещают в полипропиленовую центрифужную пробирку вместимостью 50 см³ и добавляют 40 см³ 1%-го раствора муравьиной кислоты в метаноле. Пробирку плотно закрывают и помещают в перемешивающее устройство на 10 мин, затем центрифугируют в течение 10 мин при скорости 4 000 об./мин. Измеряют объем полученного экстракта с помощью мерного цилиндра (V_экстр.). От верхнего слоя отбирают 1 см³ и переносят в градуированные пробирки вместимостью 10 см³. Добавляют 1%-й раствор муравьиной кислоты в метаноле до объема (100/V_экстр.) соответствующего содержанию матрицы 0,1 г в 1 см³, и фильтруют через фильтр в виалы для хроматографирования. Виалы помещают в автосамплер хроматографа для анализа методом ВЭЖХ-МС по п. 9.2.

Хромато-масс-спектрометр, состоящий из высокоэффективного жидкостного хроматографа и масс-спектрометра с тройным квадруполем.

Аналитическая колонка с обращенной фазой, ионными группами и длинной гидрофобной цепью (150 x 2,1 мм), 5 мкм. Температура колонки (45 +/- 1) °C. Скорость потока элюента 0,2 см³/мин. Объем вводимой пробы 3 мм³. Время удерживания касугамицина - (6,9 +/- 0,2) мин.

Режим элюирования - градиентный:

Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки. Содержание касугамицина в пробе (X, мг/кг) вычисляют по формуле:

S_x - площадь пика касугамицина на хроматограмме испытуемого образца, (AU);

K - градуировочный коэффициент, найденный на стадии построения соответствующей градуировочной зависимости;

f - полнота извлечения касугамицина, приведенная в табл. 2, %;

V - объем пробы, подготовленной для хроматографического анализа, см³ (1 см³);

P - навеска анализируемого образца, г (аликвота, равная 0,1 г).

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор касугамицина с концентрацией 0,05 мкг/см³, разбавляют 1%-м раствором муравьиной кислоты в метаноле.

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости:

X₁, X₂ - результаты параллельных определений, мг/кг;

r - значение предела повторяемости .

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

Результат анализа представляют в виде:

при вероятности P = 0,95, где

- среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

- граница абсолютной погрешности, мг/кг:

- граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

В случае если содержание компонента меньше нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание вещества в пробе менее нижней границы определения" (например: менее 0,05 мг/кг <*>, где <*> - 0,05 мг/кг - предел определения касугамицина в капусте).

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-02 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода "добавок".

Величина добавки C_д должна удовлетворять условию:

- характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой соответственно), мг/кг, при этом:

- граница абсолютной погрешности, мг/кг:

- граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

Результат контроля процедуры К_к рассчитывают по формуле:

, , C_д - среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки соответственно, мг/кг.

Норматив контроля К рассчитывают по формуле:

Проводят сопоставление результата контроля процедуры (К_к) с нормативом контроля (К).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры к их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):

X₁, X₂ - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;

R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций), %.