"МУ 1.2.2967-11. 1.2. Гигиена, токсикология, санитария. Порядок оценки действия наноматериалов на рыб по морфологическим и генетическим признакам. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 17.10.2011)

1. Разработаны Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека; Учреждением Российской академии медицинских наук "Научно-исследовательский институт питания"; Учреждением Российской академии наук "Институт проблем экологии и эволюции им. А.Н. Северцова"; Федеральным государственным унитарным предприятием "Всероссийский научно-исследовательский институт метрологической службы"; Учреждением Российской академии наук Центр "Биоинженерия"; Учреждением Российской Академии наук "Институт биохимии им. А.Н. Баха"; ООО "Интерлаб".

Разработаны в рамках Федеральной целевой программы "Развитие инфраструктуры наноиндустрии в Российской Федерации на 2008 - 2011 годы".

2. Рекомендованы Государственной Комиссией по санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 17 октября 2011 г.

4. Введены в действие с момента утверждения.

5. Введены впервые.

1.1. Настоящие методические указания определяют порядок и методы оценки действия наноматериалов на рыб по морфологическим и генетическим признакам при проведении тестирования безопасности искусственных наноматериалов.

1.2. Настоящие методические указания применяются в ходе проведения тестирования безопасности искусственных наноматериалов для рыб в целях принятия решений по оценке рисков, связанных с воздействием наночастиц и наноматериалов на организм человека и объекты окружающей среды.

1.3. Методические указания разработаны с целью обеспечения единства измерений и адаптации имеющихся методов и средств измерений в ходе оценки безопасности наноматериалов и нанотехнологий для состояния здоровья человека и животных.

1.4. Методические указания предназначены для специалистов органов и организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, а также могут быть использованы научно-исследовательскими организациями гигиенического профиля, медицинскими учебными заведениями, производителями нанотехнологической продукции и иными организациями и учреждениями, проводящими оценку безопасности наноматериалов для здоровья человека, производителями и поставщиками нанотехнологической продукции.

2.1. Федеральный закон от 30 марта 1999 г. N 52-ФЗ "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения".

2.2. Федеральный закон от 26 июня 2008 г. N 102-ФЗ "Об обеспечении единства измерений".

2.3. Федеральный закон от 27 декабря 2002 г. N 184-ФЗ "О техническом регулировании".

2.4. Федеральный закон от 10 января 2002 г. N 7-ФЗ "Об охране окружающей среды".

2.5. Приказ Минздравсоцразвития России от 23 августа 2010 г. N 708н "Об утверждении Правил лабораторной практики".

2.6. Постановление Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 23 июля 2007 г. N 54 "О надзоре за продукцией, полученной с использованием нанотехнологий и содержащей наноматериалы".

2.7. Постановление Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 31 октября 2007 г. N 79 "Об утверждении Концепции токсикологических исследований, методологии оценки риска, методов идентификации и количественного определения наноматериалов".

2.8. Приказ Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека от 19 июля 2007 г. N 224 "О санитарно-эпидемиологических экспертизах, обследованиях, исследованиях, испытаниях и токсикологических, гигиенических и иных видах оценок".

2.9. ГН 1.2.2633-10 "Гигиенические нормативы содержания приоритетных наноматериалов в объектах окружающей среды".

2.10. СанПиН 2.1.4.1074-01 "Питьевая вода. Гигиенические требования к качеству воды централизованных систем питьевого водоснабжения. Контроль качества".

2.11. СП 2.2.2.1327-03 "Гигиенические требования к организации технологических процессов, производственному оборудованию и рабочему инструменту".

2.12. МУ 1.2.2520-09 "Токсиколого-гигиеническая оценка безопасности наноматериалов".

2.13. МУ 1.2.2744-10 "Порядок отбора проб для выявления, идентификации и характеристики действия наноматериалов в рыбах".

2.14. МР 1.2.2566-09 "Оценка безопасности наноматериалов in vitro и в модельных системах in vivo".

2.15. МР 1.2.2641-10 "Определение приоритетных видов наноматериалов в объектах окружающей среды, пищевых продуктах и живых организмах".

2.16. МР 1.2.2639-10 "Использование методов количественного определения наноматериалов на предприятиях наноиндустрии".

2.17. МР 1.2.2522-09 "Методические рекомендации по выявлению наноматериалов, представляющих потенциальную опасность для здоровья человека".

2.18. МР 4.2.0014-10 "Оценка генотоксических свойств методом ДНК-комет in vitro".

2.19. ГОСТ 2761-84 "Источники централизованного хозяйственно-питьевого водоснабжения. Гигиенические, технические требования и правила выбора".

2.20. ГОСТ Р 51232-98 "Вода питьевая. Общие требования к организации и методам контроля качества".

2.21. ГОСТ Р 51652-2000 "Спирт этиловый ректификованный из пищевого сырья. Технические условия".

2.22. ГОСТ 6709-72 "Вода дистиллированная. Технические условия".

2.23. ГОСТ 8.207-76 "Государственная система обеспечения единства измерений. Прямые измерения с многократными наблюдениями. Методы обработки результатов наблюдений. Основные положения".

2.24. ГОСТ 30333-2007 "Паспорт безопасности химической продукции. Общие требования".

2.25. ГОСТ 12.0.004-79 "Организация обучения работающих безопасности труда. Общие положения".

2.26. ГОСТ 12.1.007-76 "Вредные вещества. Классификация и общие требования".

2.27. ГОСТ 7.32-2001 "Отчет о научно-исследовательской работе. Структура и правила оформления".

3.1.1. Оценка действия наноматериалов на рыб по морфологическим и генетическим признакам проводится в целях обеспечения безопасности, предотвращения и/или снижения риска для возникновения заболеваний у человека и животных с учетом свойств и разнообразных условий применения наноматериалов.

3.1.2. Оценка действия наноматериалов на рыб по морфологическим и генетическим признакам является видом специальных токсиколого-гигиенических исследований, направленных на установление возможной тератогенной и мутагенной токсичности наноматериалов.

3.1.3. Токсиколого-гигиенические исследования наноматериалов на животных проводятся в соответствии с МУ 1.2.2520-09, МР 1.2.2566-09 и другими нормативно-методическими документами, утвержденными в установленном порядке.

3.1.4. При постановке экспериментов обязательно наличие контрольных групп рыб, содержащихся в таких же условиях, как и подопытные, и получающих вспомогательные ингредиенты (дисперсионная среда, стабилизатор), входящие в состав исследуемого наноматериала, тем же путем, что и тестируемый наноматериал.

3.1.5. При наличии у вещества, входящего в состав наноматериала, собственных токсических свойств в макродисперсной ("традиционной") форме (как, например, у наночастиц, содержащих мышьяк, свинец, кадмий, теллур, селен и другие токсичные элементы) необходимо наличие дополнительной контрольной группы, получающей в эквивалентных дозах химический аналог наноматериала "традиционной" степени дисперсности (в форме макроскопической дисперсии или молекулярного (ионного) раствора).

3.2.1. Исследования по оценке действия наноматериалов на рыб проводятся в лабораториях, аккредитованных в установленном порядке.

3.2.2. Требованиями, предъявляемыми к лабораториям при их аккредитации, являются: использование стандартизованных и (или) метрологически аттестованных методик определения показателей качества исследуемого объекта; наличие стандартных образцов наноматериалов; наличие поверенных средств измерений для контроля качества объекта по исследуемым показателям; наличие системы повышения квалификации сотрудников лаборатории; наличие системы контроля качества проводимых исследований.

3.2.3. Проведение исследований по действию наноматериалов на рыб определяется правилами надлежащей лабораторной практики.

3.2.4. На все производственные операции, включая: содержание и разведение рыб, проведение экспериментов и обработку результатов, хранение стандартов; обслуживание и калибровку измерительных приборов; приготовление реактивов, ведение записей, отчетов и их хранение; обслуживание помещений; обезвреживание и утилизацию наноматериалов; осуществление программы по обеспечению качества - разрабатываются стандартные операционные процедуры (СОП). Соблюдение СОП осуществляется в целях обеспечения качества, достоверности и воспроизводимости результатов исследований.

3.2.5. К выполнению исследований с использованием наноматериалов допускаются сотрудники со специальным образованием, имеющие опыт работы с соответствующими средствами измерений не менее 1 года, изучившие техническое описание измерительных приборов и методику выполнения измерений, имеющие опыт работы в химической лаборатории, обученные в соответствии с ГОСТ 12.0.004.

3.2.6. Средства измерений, используемые в организациях, проводящих оценку воздействия наноматериалов на рыб, проходят метрологический контроль (поверку) аккредитованными для этого организациями в установленном порядке и в установленные сроки.

3.2.7. Эксплуатация лабораторного оборудования и средств измерений проводится в соответствии с техническим паспортом и инструкцией по применению.

3.2.8. Калибровка измерительной аппаратуры при количественном определении наноматериалов должна проводиться с применением стандартных образцов наноматериалов по показателям химического состава (включая наличие примесей), размеру и форме частиц, удельной площади поверхности, типу кристаллической структуры. Результаты проведения калибровки измерительной аппаратуры фиксируются в специальном журнале.

3.2.9. Каждый стандартный образец должен быть оснащен "Паспортом безопасности наноматериалов", который составляется в соответствии с ГОСТ 30333-2007.

3.2.10. Хранение стандартных образцов наноматериалов осуществляется отдельно от остальных веществ (реактивов) с соблюдением условий хранения, указанных в паспорте безопасности, на протяжении всего срока годности образца.

3.2.11. Контроль за качеством работ включает в себя: оформление перечня исследований, проводимых в организации, с указанием для каждого исследования руководителя и заказчика, названия определяемого наноматериала, даты начала и состояния каждого исследования на текущий момент времени; оценку протоколов и методов исследования на соответствие правилам лабораторной практики; мониторинг текущих исследований; отчет о проведенных проверках и рекомендации по устранению недостатков.

3.2.12. Оценка действия наноматериалов на рыб по морфологическим и генетическим показателям проводится по утвержденному плану с ведением протокола (Приложение 3) и составлением отчета, в который заносятся все результаты исследований.

3.2.13. При выполнении работы с наноматериалами сотрудники должны быть проинструктированы об основных правилах безопасности при работе в химической лаборатории, мерах техники безопасности при работе с веществами 1 - 2 класса опасности, органическими растворителями (ГОСТ 12.0.004-79, ГОСТ 12.1.007-76).

3.2.14. В процессе выполнения работ с наноматериалами персонал обязан соблюдать личную гигиену. После завершения работ с наноматериалами проводят влажную уборку на рабочем месте и в помещении.

3.2.15. Руководство организации, выполняющей исследования с использованием наночастиц и наноматериалов, несет ответственность за проведение надлежащего наблюдения за здоровьем сотрудников. Для этого необходимо проведение в установленные сроки медицинских осмотров сотрудников и обеспечение контроля за лабораторным загрязнением наночастицами, в частности загрязнением аэрозолями наночастиц воздуха производственных помещений.

3.2.16. При возникновении нештатных ситуаций, способных нанести вред здоровью работающих, руководство организации обязано принять меры к их устранению и обеспечить доставку пострадавших в медицинское учреждение для оказания необходимой помощи.

3.2.17. Результаты исследований по оценке воздействия наноматериалов на рыб заносят в протокол, в котором отражены цели работ и методы, используемые для достижения этих целей, используемые стандартные образцы, схема исследований и ее обоснование, методы отбора проб объектов исследований, результаты исследований, статистическая обработка результатов исследования, заключение. Протокол исследований утверждается руководителем организации, проводящей исследования.

3.2.18. По окончании проведенных исследований оформляется отчет в соответствии с требованиями ГОСТ 7.32-2001, содержащий следующие позиции: название отчета; адрес организации, проводившей исследования; дату начала и завершения исследований; цели и задачи исследования, характеристику определяемого наноматериала; перечень исследованных образцов и применяемых стандартов; схему проведения исследования; описание методов статистической обработки результатов; результаты исследования, представленные в виде обобщенных таблиц, рисунков с соответствующей статистической обработкой и комментариев к ним; заключение.

3.3.1. Исследования проводятся на здоровых рыбах. Вновь прибывших рыб изолируют (подвергают карантину) для оценки состояния их здоровья. Источники поступления, условия и дата поступления должны быть документально оформлены. В случае ухудшения состояния здоровья животных и их гибели, не связанных с проведением исследования, указанных животных необходимо изолировать от основной группы.

3.3.2. Корма и вода для рыб должны обеспечивать как пищевые потребности, так и необходимые условия существования их в соответствии с протоколом исследования, быть свободными от патогенных микроорганизмов и вредных примесей и не должны влиять на результаты исследования. Корма хранятся в специально отведенном для этой цели помещении (холодильнике).

3.3.3. Водоподготовка для содержания рыб осуществляется в специально оборудованном помещении в соответствии с рецептурой, разработанной для каждого вида рыбы.

3.3.4. Места содержания рыб и производственные помещения подвергаются периодической санитарной обработке, не оказывающей влияния на результаты исследования.

3.3.5. Кормление рыб должно осуществляться только после окончания уборки помещения и мытья аквариумов. Отбор рыб, пересаживание их в другие аквариумы проводится только с помощью специально закрепленных за каждым аквариумом средств (сачков). Мытье и дезинфекция аквариумов проводится 1 - 2 раза в месяц. Замена воды осуществляется 1 раз в неделю, допускается замена не более 1/3 объема.

3.3.6. Не реже одного раза в месяц проводится санитарный день, в течение которого производится уборка всех помещений. Порядок проведения санитарного дня определяется заведующим аквариальной.

3.3.7. В аквариальной необходимо установить постоянный контроль за температурно-влажностным режимом и режимом освещения. Кроме того, необходимо контролировать состав воды (pH, жесткость, уровень кислорода, минеральный состав, температуру). Величины температуры и влажности, цикличность смены светлого и темного периода суток определяются условиями содержания.

3.3.8. Посещение аквариальной посторонними лицами без специального разрешения запрещается. Сотрудники учреждения, выполняющие работы в аквариальной, обязаны:

- соблюдать установленные правила распорядка дня и режим работы;

- вести систематические наблюдения за своими экспериментальными животными;

- по окончании экспериментов или любой другой текущей работы с лабораторными животными оставлять рабочее место в надлежащем порядке;

- сообщать специалистам аквариальной обо всех замеченных случаях заболеваний среди экспериментальных животных, а также своевременно уведомлять специалистов аквариальной о предполагаемых патологических состояниях животных в соответствии с условиями эксперимента.

3.4.1. Аквариальную размещают в отдельном, изолированном от других, помещении, имеющем автономные системы вентиляции и теплообеспечения.

3.4.2. Аквариальная должна предусматривать содержание в отдельных помещениях животных, подвергаемых воздействию различных тестируемых образцов (наноматериалов). Она должна быть обеспечена квалифицированными кадрами, включая ветеринарного врача и технический персонал.

3.4.3. На каждом аквариуме прикрепляют этикетку с указанием номера аквариума, названия опыта, даты начала и окончания исследования, даты введения тестируемого образца, фамилии, имени, отчества ответственного сотрудника, что и когда вводилось животным.

3.4.4. В аквариальной должны быть:

- помещение для хранения кормов;

- помещение и система для водоподготовки;

- помещение для чистого запасного инвентаря, аквариумов, стоек и др.

3.4.5. Аквариальная должна иметь документы, содержащие следующую информацию:

- источники получения рыб, дату получения, количество, возраст, пол, вид;

- перечень и количество рыб, находящихся в аквариальной, из них: на карантине; в опыте, подвергнутых воздействию тестируемых образцов, с указанием, в каких помещениях находятся все эти группы рыб.

3.5.1. Эксплуатация вспомогательного оборудования проводится в соответствии с техническим паспортом и инструкцией по применению. Результаты проведения поверки измерительного оборудования, профилактических осмотров и текущего ремонта фиксируются в специальном журнале, доступном в любое время сотрудникам, эксплуатирующим оборудование или обеспечивающим его обслуживание, и содержащем следующие сведения: наименование прибора, производителя, страны происхождения; модель прибора; серийный (заводской) номер; дата получения и постановки на учет в лаборатории; дата запуска в эксплуатацию; инвентарный номер; место расположения прибора; сотрудник, ответственный за использование прибора; сотрудник (подразделение, организация), ответственный за техническое обслуживание прибора; детальные записи о плановом обслуживании оборудования, датированные и заверенные подписью ответственного лица; детальные записи о любых повреждениях, отказах, ремонте прибора, датированные и заверенные подписью сотрудника (лица), ответственного за техническое состояние прибора; детальные записи о калибровке прибора, датированные и заверенные подписью лица, ответственного за обслуживание прибора.

3.5.2. Объемно-планировочные и конструктивные решения аквариальных помещений должны отвечать установленным требованиям. Гигиенические параметры производственных факторов должны отвечать действующим гигиеническим нормативам.

3.5.3. Предусмотренные отопление и вентиляция аквариальных совместно с другими технологическими системами должны обеспечивать в них оптимальные параметры микроклимата (температуры, влажности, подвижности воздуха) и химического состава воздушной среды, не превышающие гигиенические нормативы.

3.5.4. Для обеспечения гигиенически оптимального температурно-влажностного режима необходимо предусмотреть:

- автоматическое регулирование температуры и влажности помещения;

- механическое регулирование системы аэрации (фрамуги, форточки и т.д.).

На все отопительно-вентиляционные системы должны быть заведены паспорта и эксплуатационные журналы.

3.5.5. Выбор источников водоснабжения должен проводиться в соответствии с ГОСТ 2761-84. Качество воды должно отвечать требованиям СанПиН 2.1.4.1074-01.

3.5.6. Производственные стоки, образующиеся при дезинфекции и уборке помещений, транспортных средств, аппаратуры, оборудования, тары, спецодежды, собираются в водонепроницаемые бетонированные резервуары с мешалками, нейтрализуются, очищаются на местных (локальных) очистных сооружениях и передаются на поля орошения или спускаются в водоемы при соблюдении требований Положения о водоохранных зонах, зонах санитарной охраны поверхностных и подземных водоисточников.

3.5.7. Теплогенераторы следует размещать в изолированных помещениях или специально оборудованных технических коридорах. Аппаратуру для водоподготовки необходимо размещать в специально оборудованном помещении. При обогреве воздухораспределительные устройства должны обеспечивать равномерное распределение тепла в обогреваемом объеме при оптимальной подвижности воздуха. Перепады температур в аквариальной должны быть не более 2 - 3 °C, подвижность воздуха более 0,5 - 1,0 м/с. Открывание (закрывание) вентиляционных проемов должно быть автоматизировано либо механизировано. Лаборатории, комнаты отдыха и санитарно-бытовые помещения должны иметь обособленные системы вентиляции.

3.6.1. Все сотрудники, участвующие в работах с рыбами, проходят инструктаж по методам работы, порядку эксплуатации оборудования аквариальной, правилам техники безопасности при работе.

3.6.2. Руководитель аквариальной должен иметь высшее зоотехническое, биологическое, медицинское или ветеринарное образование и подчиняться директору учреждения или его заместителю по научной работе. Руководитель аквариальной несет ответственность за ее санитарное состояние и эпизоотическое благополучие.

3.6.3. Штатная численность обслуживающего персонала аквариальной определяется в зависимости от объема и характера экспериментальных исследований, а также от количества лабораторных животных.

3.6.4. Сотрудники аквариальной несут ответственность за соблюдение инструкций и правил по уходу, кормлению и содержанию рыб. Обслуживающий персонал аквариальной осуществляет уход за лабораторными животными в течение всего времени их содержания. Контроль за состоянием подопытных животных осуществляется сотрудниками научного подразделения, проводящими тестирования на животных.

4.1.1. Выбор видов рыб, на которых выполняется оценка воздействия наноматериалов по морфологическим и генетическим признакам, определяется следующими характеристиками: простотой содержания и разведения в лабораторных условиях, небольшими размерами, коротким жизненным циклом, возможностью получения необходимого количества икры, коротким периодом развития икры.

4.1.2. Экспериментальная модель должна давать возможность проводить сравнение результатов, полученных в других лабораториях. В качестве объектов, подвергаемых воздействию искусственных наночастиц в эксперименте, используют икру и взрослых особей рыб данио рерио (Danio rerio).

4.1.3. Порядок тестирования, включая численность опытных и контрольных групп животных, методики их содержания и кормления, способ введения наночастиц должны соответствовать МР 1.2.2566-09 (п. 6.4). Тестируемые наночастицы добавляют в воду, в которой содержатся тестируемые организмы, как минимум в пяти последовательно 10-кратно возрастающих концентрациях в виде дисперсии в дехлорированной питьевой воде по ГОСТ Р 51232-98. При диспергировании наноматериала применяют физические методы диспергирования (перемешивание, встряхивание, ультразвуковая обработка). Применение органических растворителей и детергентов не допускается. В порядке исключения допустимо введение наноматериалов на носителе, биологическая инертность которого подтверждена в дополнительных контрольных исследованиях. Финальная концентрация носителя, вносимого вместе с тестируемым наноматериалом, не должна превышать 100 куб. мм/куб. дм. Стандартизованная вода используется в качестве отрицательного контроля.

4.2.1. За день до начала теста самцов и самок в соотношении 2:1 помещают в нерестовые аквариумы непосредственно перед началом темного периода. Рекомендуется одновременно использовать как минимум 3 нерестовых аквариума. Для стимуляции икрометания и в качестве субстрата используются искусственные растения. Спаривание, нерест икры и оплодотворение начинаются через 30 мин. после светлого периода утром.

4.2.2. Так как данио рерио (Danio rerio) могут поедать икринки, дно нерестового аквариума должно быть закрыто сеткой. Через 30 - 60 мин. после начала спаривания икру собирают пластиковой пипеткой, рассматривают под бинокуляром и подсчитывают количество икринок, при этом неоплодотворенные (непрозрачные) икринки изымают.

4.2.3. Для отбора оплодотворенных икринок используется инвертированный микроскоп или бинокуляр с минимальным увеличением 25x. Для теста используются только оплодотворенные икринки на стадии от 4 до 128 бластомеров. Икринки с явными аномалиями (асимметрия, образование пузырьков) или поврежденной мембраной также изымаются. Неоплодотворенные икринки можно легко отличить по отсутствию бластомеров и непрозрачности.

4.2.4. Тест на тератогенность начинают не позднее через 3 ч после оплодотворения икринок (стадия 128 бластомеров). Для того чтобы начать тестирование с минимальной задержкой, как минимум 30 случайно выбранных икринок для каждого тестируемого вещества первоначально помещают в чашки Петри, содержащие по 50 куб. см тестовых веществ каждой концентрации, и контроль.

4.2.5. Наноматериалы должны быть протестированы как минимум в 5 концентрациях, приготовленных в соответствии с пунктом 4.1.3 настоящих методических указаний.

4.2.6. Тест проводится в 24-луночных плашках. Для каждой тестируемой концентрации под бинокуляром отбирают по 10 икринок, которые помещают в лунки, заполненные 2 мл свежеприготовленного тестируемого вещества, и контроль. Плашки накрывают крышкой и инкубируют без аэрации при t = (26,0 +/- 1,0) °C в течение 120 ч.

4.2.7. Обследование икринок проводят каждые 24 ч. Эмбрион считается погибшим, если отмечается один из перечисленных признаков: коагуляция эмбриона, отсутствие отделения хвоста, нерегулярность туловищных сомитов и отсутствие сердцебиения (Приложение 1).

4.2.8. Результаты эксперимента подвергают статистической обработке с целью установления различий в показателях между экспериментальными группами. Анализ результатов основан на установлении частоты гибели эмбрионов и морфологических аномалий. Статистическую обработку результатов проводят по единому плану, включающему: описательную статистику, расчет выборочного среднего (M), выборочной ошибки среднего (m), медианы распределения (Med), максимального и минимального значения выборки.

4.2.9. Проверку достоверности различия между контрольной группой и группами, получавшими наноматериалы, осуществляют с использованием критериев непараметрической статистики - критерий Хи-квадрат или критерий Фишера. Проводят также проверку достоверности различия между группами, получавшими наноматериал, и группами, получавшими носитель наноматериала, и/или группами, получавшими в эквивалентных количествах химический аналог наноматериала традиционной степени дисперсности (при его наличии).

4.2.10. Эффект наноматериала (воздействие на выбранный показатель организма животного) считается выявленным при достоверности различия контрольной и опытной групп (вероятности принятия нуль-гипотезы) на уровне P = 0,05 и менее.

4.3.1. Для исследования мутагенного действия наноматериалов на рыб проводят "комет-тест". Щелочной "комет-тест" (применяемый буфер для электрофореза имеет pH >= 13) детектирует широкий спектр повреждений ДНК, что позволяет использовать его для оценки генотоксичности наноматериалов. Этот метод позволяет определять как двунитевые, так и однонитевые разрывы ДНК.

4.3.2. Для проведения эксперимента используют взрослых особей данио рерио (Danio rerio). В каждой экспериментальной группе должно быть не менее 5 рыб. Порядок приготовления водных суспензий наночастиц - см. п. 4.1.3 настоящих методических указаний.

4.3.4. В качестве негативного контроля используется стандартизованная вода, а в качестве позитивного - генотоксичные агенты, такие как этилметансульфанат (CAS N 62-50-0) или циклофосфамид (CAS N 50-18-0).

4.3.5. Эксперимент проводят при однократном добавлении наночастиц в воду. Через 72 часа рыб забивают, извлекают печень и проводят щелочной "комет-тест" (Приложение 2).

4.3.6. Микропрепараты анализируют на флуоресцентном микроскопе с соответствующими для конкретного красителя фильтрами. Рекомендуемое увеличение 200x - 400x. На каждый микропрепарат анализируют не менее 100 "ДНК-комет" без наложений хвостов. В анализ не включают апоптотические клетки, выявляемые на микропрепаратах в виде слабо флуоресцирующих "ДНК-комет" с широким диффузным "хвостом" и практически отсутствующей "головой". Анализ "ДНК-комет" проводится с помощью программно-аппаратного комплекса, например "Comet assay" (MetaSystems).

4.3.7. Статистическую оценку результатов проводят путем сравнения среднегрупповых показателей поврежденности ДНК в опытной и контрольной группах с использованием непараметрических критериев Даннета ("ДНК в хвосте", "момент хвоста", "длина хвоста") или критерия Краскалла-Уоллеса (индекс "ДНК-комет"). Критериями положительного результата являются статистически достоверное, дозозависимое увеличение показателя поврежденности ДНК при одном из сроков экспозиции или статистически достоверный, воспроизводимый эффект, по крайней мере, для одной экспериментальной точки. Полученный положительный результат свидетельствует о том, что исследуемый наноматериал проявляет генотоксическое действие. Полученные результаты заносят в протокол опыта (Приложение 3).

"*" - сроки, на которых возможно проявление указанных признаков.