"МР 4.2.0014-10. 4.2. Методы контроля. Биологические факторы. Оценка генотоксических свойств методом ДНК-комет in vitro. Методические рекомендации"
(утв. Роспотребнадзором 14.10.2010)

1. Разработаны: НИИ фармакологии им. В.В. Закусова РАМН, Москва; Институтом теоретической и экспериментальной биофизики РАН, Пущино, Московская область; Открытым Акционерным Обществом Заводом экологической техники и экопитания "ДИОД", Москва.

2. Утверждены и введены в действие Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Г.Г. Онищенко 14 октября 2010 г.

3. Введены впервые.

Предупреждение контакта человека с потенциальными генотоксикантами представляется наиболее конструктивным способом защиты организма человека от последствий индуцированного мутагенеза. Вместе с тем тотальная проверка ксенобиотиков/комплекса ксенобиотиков на генотоксичность невозможна вследствие огромного объема исследований. Это обусловило внедрение в практику генотоксикологических исследований понятия "первоочередность" тестирования. Первоочередному тестированию подлежат лекарственные средства, пищевые добавки, пестициды, парфюмерно-косметические средства, бытовая химия, а также наиболее широко распространенные загрязнители воды, воздуха и производственные вредности. Для удешевления и ускорения работ по генетическому скринингу проводится изучение генотоксичности с помощью простых и быстровыполнимых методов и использованием качестве тест-объекта микроорганизмов или культур клеток млекопитающих.

Из имеющихся на сегодняшний день в арсенале генотоксикологии методов для решения указанных задач наиболее перспективным представляется метод гель-электрофореза отдельных клеток или метод ДНК-комет. Метод является высокочувствительным и обеспечивает высокую надежность получаемых результатов.

Данные Методические рекомендации содержат порядок проведения оценки генотоксических свойств с применением метода ДНК-комет в клетках млекопитающих в системе in vitro. Преимуществом настоящей тест-системы являются простота, экономичность, быстрота получения результатов. Кроме того, система отвечает современным этическим требованиям, согласно которым следует ограничивать использование млекопитающих в эксперименте.

Методические рекомендации предназначены для токсикологических (генотоксикологических) исследований и испытаний пищевых ингредиентов (пищевых добавок, красителей и др.), биологически активных добавок к пище и сырья для их производства, парфюмерно-косметической продукции и средств гигиены полости рта, товаров бытовой химии, полимерных материалов и различных изделий из них (изделия детского ассортимента, изделия, контактирующие с пищевыми продуктами), сырья и продуктов, с том числе полученных с применением нанотехнологий, а также объектов и факторов среды обитания (вода централизованных источников, сточная вода и т.д.).

Метод основан на регистрации различной подвижности в постоянном электрическом поле поврежденной ДНК и/или фрагментов ДНК индивидуальных лизированных клеток, заключенных в агарозный гель. При этом ДНК мигрирует к аноду, формируя электрофоретический след, визуально напоминающий "хвост кометы", параметры которого зависят от степени поврежденности ДНК.

Общая процедура метода включает получение гель-слайдов (подложки), получение микропрепаратов, лизис, щелочную денатурацию, электрофорез, нейтрализацию, окрашивание и микроскопический анализ. Гель-слайды готовятся с использованием предметных стекол, которые покрывают агарозным гелем. Исследуемые образцы инкубируют с клетками, затем в агарозном геле на подготовленные гель-слайды. После затвердевания геля клетки подвергают лизису, приводящему к разрушению клеточных и ядерных мембран, диссоциации ДНК-белковых комплексов. Проводится щелочная денатурации (pH > 13), которая переводит щелочно-лабильные сайты ДНК в однонитевые разрывы, затем проводят электрофорез. После завершения щелочного электрофореза слайды нейтрализуют, окрашивают и анализируют под флуоресцентным микроскопом. Далее проводят компьютерный анализ цифровых изображений комет с помощью специализированного программного обеспечения и определяют основной показатель процент ДНК в хвосте кометы и другие параметры.

Для оценки генотоксических свойств в качестве тест-объекта используют традиционно применяемые в генотоксикологических исследованиях клетки первичных и перевиваемых клеточных культур человека (лимфоциты периферической крови и фибробласты человека, карцинома шейки матки HeLa, карцинома легкого А-549, карцинома гортани Hep2 и др.). Среди данных тест-объектов целесообразно использовать лимфоциты периферической крови, клеточные культуры фибробластов человека или HeLa, что обусловлено рядом их преимуществ по сравнению с другими клетками: простота процедуры получения материала; высокая синхронизированность популяции клеток, широкая изученность биологических процессов.

Фосфатно-солевой буфер (ФСБ), pH 7,4 (хранят при 4 °С).

Фосфатно-солевой буфер с 1 мМ ЭДТА-Na (ФСБ + ЭДТА), pH 7,4 (хранят при 4 °С).

Универсальная 1%-ная агароза. Готовят 10 мл 1%-ного раствора универсальной агарозы в ФСБ + ЭДТА в стеклянном флаконе с крышкой на водяной бане до получения полностью прозрачного геля.

Легкоплавкая 1%-ная агароза. Готовят 1%-ный раствор легкоплавкой агарозы в ФСБ + ЭДТА и инкубируют в микротермостате при 70 °С до получения полностью прозрачного агарозного геля. Приготовленный агарозный гель охлаждают до (39 +/- 2) °С.

Легкоплавкая 0,5%-ная агароза.

Основной лизирующий раствор. Готовят основной лизирующий раствор - 10 мМ Трис-HCl (pH 10), 2,5 М NaCl, 100 мМ ЭДТА-Na. Раствор хранится при комнатной температуре в течение месяца.

Рабочий лизирующий раствор готовится и используется непосредственно в день эксперимента.

Готовят 1%-ный раствор Тритон-Х100 в основном лизирующем растворе.

Щелочной раствор для электрофореза (pH 13). Готовят раствор 0,3 М NaOH и 1 мМ ЭДТА-Na. Раствор охлаждают до 4 °С.

Раствор этидиум бромида. Готовят раствор с концентрацией этидиум бромида 2 мкг/куб. см в ФСБ. Полученный раствор хранят при 4 °С.

SYBR Green I. Готовят раствор SYBR Green I 1:10000 в TE-буфере. Полученный раствор хранят при 4 °С не более 2 недель.

6.3.1. Растворители

При работе с гидрофильными веществами в качестве растворителя используют бидистиллированную воду. При работе с гидрофобными веществами в качестве растворителя используют диметилсульфоксид или этиловый спирт в конечной концентрации не более 1%. При необходимости допускается использование других растворителей в концентрациях, не вызывающих токсического эффекта, что должно быть установлено экспериментально.

6.3.2. Контроли

В качестве негативного контроля используется растворитель, вносимый в эквивалентных объемах. В качестве позитивного контроля используют пероксид водорода. Непосредственно перед использованием готовят 1 мМ раствор пероксида водорода в охлажденном (4 °С) ФСБ.

6.3.3. Исследуемые концентрации

Во избежание ложноположительных или ложноотрицательных результатов образцы исследуются в концентрациях, не вызывающих изменение pH инкубационной среды и/или осмотического давления.

6.3.4. Подготовка парфюмерно-косметической продукции и средств гигиены полости рта

Экстракты из испытуемых образцов готовят согласно МР N 29 ФЦ/394 от 29.01.03 путем настаивания в дистиллированной воде. Соотношения веса образца и объема модельной среды (дистиллированной воды) приведены в табл. 1. Навески образцов взвешивают в сухой чистой колбе, куда потом добавляют требуемый объем модельной среды. В другую колбу наливают модельную среду и обе колбы помещают в термостат на 24 часа при 37 °С. После окончания экстракции растворы охлаждают до комнатной температуры.

После завершения экстракции раствор подвергают фильтрации через бумажный фильтр. Фильтрованию также подвергают модельную среду. Используют фильтр АФА-ВП-10 диаметром 9 см. Бумажные фильтры заранее промывают в дистиллированной воде. Для этого 10 бумажных фильтров опускают в большой стакан, заполненный 1,5 л дистиллированной воды. Стакан накрывают и ставят в термостат на 24 ч при 37 °С. Затем воду сливают и высушивают фильтры, не вынимая из стакана, в термостате до постоянной массы. Достижение постоянной массы контролируют взвешиванием каждого фильтра на аналитических весах.

6.3.5. Подготовка товаров бытовой химии

Растворы образцов готовят согласно МР N 29 ФЦ/4746 от 27.12.01. Испытуемый образец в количестве 0,1 г помещают в мерную колбу с притертой крышкой объемом 250 куб. см и доводится до метки дистиллированной водой, что соответствует разведению образца 1:2500. Это разведение является стандартным для исследования моющих средств. Во вторую колбу в качестве контроля помещается 250 куб. см дистиллированной воды. Обе колбы помещают в термостат на 24 ч при 37 °С, затем охлаждают до комнатной температуры. После охлаждения контрольный и опытный образцы подвергают фильтрованию через бумажный фильтр.

6.3.6. Подготовка изделий из полимерных материалов

Образцы изделий из полимерных материалов готовятся согласно МУ N 1.1.037-95 от 20.12.95.

Изделия из полимерных материалов измельчаются на куски максимальным сечением 20 х 20 мм. Навеску 30 г помещают в термостойкую колбу емкостью 250 куб. см, заливают 100 куб. см кипящей дистиллированной воды. По достижении температуры вытяжки 37 °С колбу помещают в термостат и выдерживают до 24 часов при температуре 37 °С.

6.3.7. Подготовка стекол для микропрепаратов

Обезжиренные предметные стекла выкладывают на термостатируемую поверхность электрической плитки, нагретой до 65 - 70 °С. Расправленную 1%-ную агарозу из расчета 20 куб. мм на площадь стекла 25 мм дозатором наносят на край стекла и равномерно распределяют по всей поверхности. После полного высыхания геля стекла снимают и охлаждают до комнатной температуры. Приготовленные стекла для микропрепаратов могут храниться 1 месяц при комнатной температуре.

При использовании предметных стекол нестандартного размера для получения микропрепаратов исследуемые клетки иммобилизируют в трехслойные агарозные блоки по принципу "сэндвича". На стекла с высушенной универсальной 1%-ной агарозой наносят слой универсальной 1%-ной агарозы. Охлаждают 5 мин. при 4 °С для застывания геля. В микропробирке быстро смешивают в равных частях (1:1) 1%-ную легкоплавкую агарозу с суспензией клеток после воздействия исследуемых образцов и наносят следующим слоем. Охлаждают 5 мин. при 4 °С для застывания геля. После этого наносят третий слой - 0,5%-ную легкоплавкую агарозу и охлаждают 5 мин. при 4 °С.

При использовании стандартных стекол в микроцентрифужные пробирки с 240 куб. мм агарозного геля вносят 60 куб. мм клеточной суспензии, 2 - 3 раза прокачивают дозатором. В центральную часть предметного стекла наносят 60 куб. мм полученного агарозного геля с клетками и накрывают покровным стеклом под углом так, чтобы не было пузырей. Предметные стекла кладут на поверхность емкости со льдом и оставляют на 10 мин. для затвердевания геля. Аккуратно снимают покровные стекла (тянут за край) и предметные стекла помещают в стеклянную кювету.

Далее все манипуляции проводятся только в затемненном месте при свете желтой или зеленой лампы.

В кювету с микропрепаратами заливают рабочий лизирующий раствор, пока раствор не покроет микропрепараты на 2 - 3 мм, накрывают крышкой и инкубируют при 4 °С в течение 1 ч. Допускается нахождение препаратов в лизирующем растворе до 24 ч.

По окончании лизиса микропрепараты вынимают из лизирующего раствора и переносят в кювету с охлажденным (4 °С) щелочным раствором для электрофореза (pH 13). Инкубируют при 4 °С в течение 20 мин.

Микропрепараты раскладывают на поверхности камеры для горизонтального электрофореза. Электрофорез осуществляют в свежей порции охлажденного (4 °С) щелочного раствора для электрофореза (pH 13) при температуре окружающей среды 20 - 25 °С. Отклонения в указанных температурных режимах может приводить к вариабельности получаемых результатов. Электрофорез проводят в течение 20 мин. при напряженности электрического поля 1 В на 1 см длины площадки для микропрепаратов.

Для окрашивания ДНК-комет этидиум бромидом микропрепараты погружают в кювету с раствором красителя и инкубируют в темном месте при 4 °С не менее 1 ч. Непосредственно перед проведением анализа микропрепарат, выбранный для регистрации ДНК-комет, промывают в дистиллированной воде 2 - 3 раза.

Для окраски ДНК-комет SYBR Green I краситель наносят на микропрепарат из расчета 100 куб. мм на площадь 25 кв. мм и проводят окраску в течение 20 мин. По окончании окраски остающийся на микропрепаратах краситель не удаляется.

Микропрепараты анализируют под флуоресцентным микроскопом. Рекомендуемое увеличение х200 - х400. С каждого микропрепарата рандомизированно анализируется не менее 50 ДНК-комет без наложений хвостов. Получение изображения и обработку данных осуществляют с помощью программно-аппаратного комплекса, включающего в себя высокочувствительную камеру или цифровой фотоаппарат, совмещенные с микроскопом, и специализированное программное обеспечение. В зависимости от имеющегося программного обеспечения анализ параметров ДНК-комет проводится в режиме "реального времени" либо с сохраненных цифровых изображений. В качестве показателя поврежденности ДНК используют % ДНК в хвосте кометы.

Статистическая обработка экспериментальных данных проводится по всем повторностям каждой экспериментальной точки путем сравнения показателей поврежденности ДНК в опытной и контрольной группах с использованием непараметрического критерия Даннета. Данные двух повторностей объединяются и определяется среднее, если 95%-ные доверительные интервалы перекрываются. Критериями положительного результата являются статистически достоверное, дозозависимое увеличение показателя поврежденности ДНК или статистически достоверный, воспроизводимый эффект по крайней мере для одной экспериментальной точки. Позитивный результат в данном тесте указывает на то, что исследуемое соединение индуцирует ДНК-повреждения в данном типе клеток в условиях in vitro.

Критериями положительного результата являются статистически достоверное, дозозависимое увеличение показателя поврежденности ДНК или статистически достоверный, воспроизводимый эффект по крайней мере для одной экспериментальной точки. Позитивный результат в данном тесте указывает на то, что исследуемый агент индуцирует ДНК-повреждения в данном типе клеток в условиях in vitro.

Показателем генотоксического действия является индекс повреждения (ИП), который вычисляется по формуле:

ИП = "% ДНК в хвосте" в опытной группе/"% ДНК в хвосте" в контрольной группе.

Индекс повреждения, превышающий 2,0, указывает на то, что исследуемый образец обладает генотоксическими свойствами в условиях in vitro.

В случае выявления положительного результата для оценки безопасности применения необходимо проведение дальнейших исследований в тестах in vivo на млекопитающих.

1. Дурнев А.Д., Жанатаев А.К., Анисина Е.А., Сиднева Е.С., Никитина В.А., Оганесянц Л.А., Середенин С.Б., Бекиш В.Я., Чернуха И.М. Применение метода щелочного гель-электрофореза изолированных клеток для оценки генотоксических свойств природных и синтетических соединений: Методические рекомендации. Москва, 2006, 28 стр.

2. Жанатаев А.К., Дурнев А.Д., Оганесянц Л.А. Метод гель-электрофореза изолированных клеток (метод "ДНК-комет") в пищевой генотоксикологии//Хранение и переработка сельхозсырья. 2007. N 1. с. 31 - 33.

3. Collins A.R., Oscoz A.A., Brunborg G., Gaivao I., Giovannelli L., Kruszewski M., Smith C.C., Stetina R. The comet assay: topical issues//Mutagenesis. 2008 May; 23(3):143-51.

4. Comet Assay in Toxicology//A. Dhawan, D. Anderson (Eds); Royal Society of Chemistry, 2009, 461 p.

5. Dhawan A., Bajpayee M., Parmar D. Comet assay: a reliable tool for the assessment of DNA damage in different models//Cell Biol Toxicol. 2009 Feb; 25(1):5-32.

6. Landsiedel R., Kapp M.D., Schulz M., Wiench K., Oesch F. Genotoxicity investigations on nanomaterials: methods, preparation and characterization of test material, potential artifacts and limitations - many questions, some answers//Mutat Res. 2009 Mar-Jun; 681(2 - 3):241-58.

7. Tice R.R., Agurell E., Anderson D., Burlinson B., Hartmann A., Kobayashi H., Miyamae Y., Rojas E., Ryu J.C., Sasaki Y.F. Single cell gel/comet assay: guidelines for in vitro and in vivo genetic toxicology testing//Environ Mol Mutagen. 2000; 35(3):206-21.

8. Методические рекомендации по выявлению наноматериалов, представляющих потенциальную опасность для здоровья человека: МР 1.2.2522-09. Москва, 2009.

9. Токсиколого-гигиеническая оценка безопасности наноматериалов: МУ 1.2.2520-09. Москва, 2009.