"МУК 4.1.3132-13. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств дифлубензурона в ягодах и соке черной смородины методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 12.11.2013)

1. Разработаны сотрудниками ГНУ "Всероссийский НИИ защиты растений Россельхозакадемии" (В.И. Долженко, И.А. Цибульская, А.О. Берестецкий, Е.В. Полуэктова); ГБОУ ДПО "Российская медицинская академия последипломного образования" Минздрава России (М.С. Орлов).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (Протокол от 29 октября 2013 г. N 3).

3. Утверждены врио руководителя Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главного государственного санитарного врача Российской Федерации А.Ю. Поповой 12 ноября 2013 г.

Свидетельство о метрологической аттестации N 01.5.04.134/01.00043/2013.

Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения массовой концентрации дифлубензурона в ягодах и соке черной смородины в диапазоне концентраций 0,001 - 0,01 мг/кг.

Методические указания носят рекомендательный характер.

Название действующего вещества по ИСО: дифлубензурон.

Название действующего вещества по ИЮПАК: 1-(4-хлорфенил)-3-(2,6-дифторбензоил)мочевина.

N-{[(4-хлорфенил)амино]карбонил}-2,6-дифторбензамид (С.А.)

Структурная формула:

Эмпирическая формула: .

Молекулярная масса: 310,7.

Бесцветное кристаллическое вещество (технический - кристаллы от белых до желтых).

Температура плавления: 228 °C (техн.: 210 - 230 °C).

Давление паров при 25 °C: .

Коэффициент распределения н-октанол/вода: .

Растворимость (г/л) при 20 °C: н-гексан - 0,063, толуол - 0,29, дихлорметан - 1,8, метанол - 1,1, вода - 0,08 мг/л (при pH 7 и 25 °C).

Вещество стабильно в кислых средах (20 °C, pH 5 - 7, ), разлагается в щелочных растворах (при pH 9 42 дня).

Краткая токсикологическая характеристика: Острая пероральная токсичность для мышей и крыс - более 4 640 мг/кг; острая дермальная токсичность для кроликов - более 2 000 мг/кг, для крыс - более 10 000 мг/кг; острая ингаляционная токсичность для крыс - более 2,88 мг/л. Токсичен для пчел. для рыб 130 - 150 мг/л при экспозиции 96 ч.

Мутагенный и онкогенный эффекты при использовании препарата не наблюдались.

Гигиенические нормативы для дифлубензурона в России в ягодах и соке черной смородины не установлены.

Область применения: Несистемный регулятор роста насекомых с контактным и кишечным действием. Используется для уничтожения широкого диапазона насекомых-вредителей, питающихся листьями лесных и плодовых деревьев, а также плодами. Эффективен против яблонной плодожорки, листоверток и др.

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1. для соответствующих диапазонов концентраций.

Методика основана на определении дифлубензурона методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с ультрафиолетовым детектором после его извлечения из образцов ацетонитрилом и очистке экстрактов на патронах для твердофазной экстракции (ТФЭ).

Идентификация дифлубензурона проводится по времени удерживания, количественное определение - методом абсолютной калибровки.

Избирательность метода обеспечивается сочетанием условий подготовки проб и хроматографирования.

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Примечание. Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией, не требующих дополнительной очистки растворителей.

Примечание: Допускается применение оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-09, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф.

4.2. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией, соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленные ГН 2.2.5.1313-03 и 2.2.5.2308-07. Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004-90.

Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист-химик, имеющий опыт работы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, ознакомленный с руководством по эксплуатации хроматографа, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 13.

При выполнении измерений выполняют следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C и относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Перед началом анализа колонку кондиционируют в потоке подвижной фазы (0,1 - 0,2 см3/мин) до стабилизации нулевой линии.

7.2.1. Для приготовления элюента N 1 смешивают в мерной колбе на 100 см3 40 см3 ацетонитрила и 60 см3 бидистиллированной воды, используя мерные цилиндры.

7.2.2. Для приготовления элюента N 2 смешивают в мерной колбе на 100 см3 80 см3 гексана и 20 см3 диэтилового эфира, используя мерные цилиндры.

7.2.3. Для приготовления элюента N 3 смешивают в мерной колбе на 100 см3 55 см3 гексана и 45 см3 диэтилового эфира, используя мерные цилиндры.

7.2.4. Для приготовления элюента N 4 смешивают в мерной колбе на 100 см3 30 см3 ацетонитрила и 70 см3 бидистиллированной воды, используя мерные цилиндры.

7.2.5. Для приготовления подвижной фазы в мерную колбу на 1 дм3 вносят 600 см3 ацетонитрила и доводят водой объем раствора до метки, встряхивая в течение 2 мин.

7.3.1. Основной раствор с концентрацией 0,5 мг/см3: точную навеску дифлубензурона (50 +/- 0,5) мг помещают в мерную колбу вместимостью 100 см3, растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки ацетонитрилом.

Градуировочные растворы с концентрациями дифлубензурона 0,1; 0,2; 0,5; 1,0 мкг/см3 готовят методом последовательного разбавления по объему, используя раствор подвижной фазы (смесь ацетонитрил-вода в соотношении 60:40).

7.3.2. Раствор N 1 с концентрацией 1,0 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 100 см3 вносят 0,2 см3 основного раствора и доводят до метки подвижной фазой.

7.3.3. Раствор N 2 с концентрацией 0,5 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 10 см3 помещают 5,0 см3 раствора N 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.3.4. Раствор N 3 с концентрацией 0,2 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 10 см3 помещают 2 см3 раствора N 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.3.5. Раствор N 4 с концентрацией 0,1 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 10 см3 помещают 1 см3 раствора N 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

Основной раствор можно хранить в холодильнике при температуре 0 - 4 °C в течение 1 месяца, градуировочные растворы - в течение суток.

При изучении полноты извлечения дифлубензурона в ягодах и соке смородины используют ацетонитрильные растворы вещества, приготовленные из основного раствора методом последовательного разбавления по объему ацетонитрилом.

Для построения градуировочного графика (площадь пика - концентрация дифлубензурона в растворе) в хроматограф вводят по 10 мм3 градуировочных растворов (не менее 3 параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4 точек по диапазону измеряемых концентраций). Затем измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации дифлубензурона в градуировочном растворе.

Методом наименьших квадратов рассчитывают градуировочный коэффициент (K) в уравнении линейной регрессии:

S - площадь пика градуировочного раствора.

Градуировку признают удовлетворительной, если значение коэффициента линейной корреляции оказывается не ниже 0,99.

Градуировочную характеристику необходимо проверять при замене реактивов, хроматографической колонки или элементов хроматографической системы, а также при отрицательном результате контроля градуировочного коэффициента.

Градуировочную зависимость признают стабильной при выполнении следующего условия:

C - аттестованное значение массовой концентрации дифлубензурона в градуировочном растворе;

- результат контрольного измерения массовой концентрации дифлубензурона в градуировочном растворе;

- норматив контроля градуировочного коэффициента, %. ( при P = 0,95).

Патрон кондиционируют, последовательно промывая элюентом N 3 и гексаном (по 6 см3). В испарительную колбу емкостью 50 см3 отбирают 0,1 см3 раствора дифлубензурона в ацетонитриле концентрации 10 мкг/см3, добавляют 3 см3 элюента N 2 и помещают колбу в ультразвуковую ванну на 2 мин. Раствор вносят в кондиционированный патрон. Колбу обмывают 3 см3 элюента N 2 и также вносят в патрон. Затем патрон промывают 6 см3 элюента N 3. Отбирают фракции по 3 см3 каждая, упаривают, сухой остаток растворяют в 2 см3 подвижной фазы для ВЭЖХ в ультразвуковой ванне (10 с) и анализируют на содержание дифлубензурона по п. 9.3.

Фракции, содержащие дифлубензурон, объединяют, упаривают досуха, остаток растворяют в 2 см3 подвижной фазы для ВЭЖХ и вновь анализируют по п. 9.3. Рассчитывают содержание дифлубензурона в элюате, определяя полноту вымывания вещества и необходимый для очистки экстракта объем элюента.

Кондиционирование патрона проводят так же, как описано в п. 7.5. В круглодонную колбу емкостью 50 см3 вносят 10 см3 воды, добавляют 0,1 см3 раствора дифлубензурона в ацетонитриле концентрации 10 мкг/см3, перемешивают и полученную смесь вносят в кондиционированный патрон. Патрон промывают 6 см3 элюента N 4 и 6 см3 ацетонитрила. Отбирают фракции по 3 см3 каждая, упаривают, остаток растворяют в 2 см3 подвижной фазы для ВЭЖХ в ультразвуковой ванне (10 с) и анализируют на содержание дифлубензурона по п. 9.3. Фракции, содержащие дифлубензурон, объединяют, упаривают досуха, остаток растворяют в 2 см3 подвижной фазы для ВЭЖХ и вновь анализируют по п. 9.3. Рассчитывают содержание дифлубензурона в элюате, определяя полноту вымывания вещества и необходимый для очистки экстракта объем элюента.

Примечание: профиль вымывания дифлубензурона с патрона может меняться при использовании новой партии патронов и растворителей.

Установка и подготовка всех приборов и средств измерения проводится в соответствии с требованиями технической документации.

Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (N 2051-79 от 21.08.79), а также в соответствии с ГОСТ 6829-89 (СТ СЭВ 6534-88) "Смородина черная свежая. Требования при заготовках, поставках и реализации".

9.1.1. Экстракция. Для экстракции дифлубензурона навеску массой (10 +/- 0,1) г ягод помещают в пробирку емкостью 50 см3, добавляют 30 см3 ацетонитрила, измельчают, перемешивают 1 - 2 мин вручную либо на встряхивателе, центрифугируют 10 мин при 4 000 об./мин, супернатант декантируют в мерный цилиндр на 100 см3. Экстракцию повторяют два раза. Объем объединенных растворов доводят ацетонитрилом до 100 см3. Для последующего анализа отбирают 20 см3 раствора (или аликвоту 20% экстракта) и переносят в испарительную колбу объемом 50 см3. Растворитель упаривают из полученного раствора на роторном испарителе при температуре не выше 40 °C. Дальнейшую очистку экстракта проводят по пунктам 9.1.2 и 9.1.3.

9.1.2. Очистка на патроне с привитыми гексадецильными группами. Экстракт растворяют в 2 см3 ацетонитрила и добавляют 8 см3 воды. Кондиционируют патрон, как описано в п. 7.5, и вводят в него экстракт (скорость потока не более 2 мл/мин). Обмывают колбу с остатком экстракта элюентом N 4 (6 см3), промывают патрон этим раствором, элюат отбрасывают. Патрон подсушивают током воздуха 1 мин. Аналит смывают в испарительную колбу объемом 50 см3 ацетонитрилом (объем 3 см3). Растворитель отгоняют из полученного раствора на роторном испарителе при температуре не выше 40 °C. Далее очистку экстракта проводят по п. 9.1.3.

9.1.3. Очистка на патроне с гидрофильным сорбентом с постоянной активностью. Патрон кондиционируют по п. 7.5. Экстракт, очищенный по п. 9.1.2, растворяют в 2 см3 элюента N 2 и вносят в кондиционированный патрон. Колбу обмывают 5 см3 элюента N 2 и также вносят в патрон. Элюат отбрасывают. Аналит смывают элюентом N 3 (3 см3) в испарительную колбу объемом 50 см3. Растворитель упаривают из полученного раствора на роторном испарителе при температуре не выше 40 °C.

Для проведения анализа растворяют сухой остаток в 1,2 см3 ацетонитрила в ультразвуковой ванне (10 с) и добавляют 0,8 см3 воды. После перемешивания в ультразвуковой ванне (10 с) 10 мм3 раствора вводят в хроматограф и проводят анализ по п. 9.3.

Патрон с привитыми гексадецильными группами кондиционируют, как описано в п. 7.6, и вводят в него 2 см3 сока (скорость вытекания раствора с патрона должна быть не более 2 см3/мин). Промыть колбу с остатком сока и картридж 6 см3 элюента N 4. Патрон подсушивают током воздуха 1 мин. Аналит смывают в испарительную колбу объемом 50 см3 ацетонитрилом (объем 3 см3). Растворитель упаривают из полученного раствора на роторном испарителе при температуре не выше 40 °C.

Для проведения анализа растворяют сухой остаток в 1,2 см3 ацетонитрила в ультразвуковой ванне (10 с) и добавляют 0,8 см3 воды. После перемешивания в ультразвуковой ванне (10 с) 10 мм3 раствора вводят в хроматограф и проводят анализ по п. 9.3.

Ультраэффективный жидкостный хроматограф с быстросканирующим ультрафиолетовым детектором, снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки. Аналитическая колонка, заполненная сорбентом с привитыми монофункциональными полярными группами C18, (100 x 2,1) мм, 1,7 мкм. Температура колонки (30 +/- 1) °C. Подвижная фаза: смесь ацетонитрила и воды в соотношении 60:40 (по объему). Скорость потока элюента: 0,25 см3/мин. Рабочая длина волны ультрафиолетового детектора 260 нм. Объем вводимой пробы 10 мм3.

Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки, содержание дифлубензурона в пробе (X, мг/кг) вычисляют по формуле:

- площадь пика дифлубензурона на хроматограмме испытуемого образца, мм2 (AU);

K - градуировочный коэффициент, найденный на стадии построения соответствующей градуировочной зависимости;

V - объем пробы, подготовленной для хроматографического анализа, см3;

P - навеска анализируемого образца, г;

f - полнота извлечения дифлубензурона, приведенная в табл. 2, %.

Содержание остаточных количеств дифлубензурона в анализируемом образце вычисляют как среднее из 2 параллельных определений.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор дифлубензурона 1 мкг/см3, разбавляют подвижной фазой.

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предел повторяемости:

, - результаты параллельных определений, мг/кг;

r - значение предела повторяемости .

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

Результат анализа представляют в виде:

- среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

- граница абсолютной погрешности, мг/кг:

- граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

В случае если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

содержание вещества в пробе "менее нижней границы определения" (например: менее 0,001 мг/кг*, где * - 0,001 мг/кг - предел обнаружения дифлубензурона в ягодах смородины).

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-02 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.

Величина добавки должна удовлетворять условию:

, - характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой, соответственно), мг/кг;

при этом:

- граница абсолютной погрешности, мг/кг:

- граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

Результат контроля процедуры рассчитывают по формуле:

X', X, - среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки, соответственно, мг/кг.

Норматив контроля K рассчитывают по формуле:

Проводят сопоставление результата контроля процедуры с нормативом контроля (K).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры к их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предел воспроизводимости (R):

, - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;

R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций), %.