"МУК 4.1.2853-11. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств Мезотриона в кукурузном масле методом капиллярной газожидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 31.03.2011)

1. Разработаны Российским государственным аграрным университетом - МСХА им. К.А. Тимирязева, Учебно-научный консультационный центр "Агроэкология пестицидов и агрохимикатов" Минсельхоза России.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 28.12.2010 N 3).

3. Утверждены руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 31.03.2011.

4. Введены в действие с момента утверждения.

5. Введены впервые.

Свидетельство об аттестации методики от 01.12.2010 N 0063.30.11.10.

Настоящие методические указания устанавливают метод капиллярной газожидкостной хроматографии для определения уровня остаточных количеств Мезотриона в кукурузном масле в диапазоне 0,01 - 0,1 мг/кг.

Название действующего вещества по ИЮПАК: 2-(4-мезил-2-нитробензоил)циклогексан-1,3-дион.

Структурная формула (не приводится).

Молекулярная масса: 339,3.

Химически чистый Мезотрион представляет собой бледно-желтый порошок без запаха.

Температура плавления: 165,3 °C.

Растворимость (г/куб. дм, при 20 °C): 1,2-дихлорэтан - 66,3; этилацетат - 18,6; метанол - 4,6; толуол - 3,1.

Растворимость в воде (г/куб. дм, при 20 °C): 2,2 (при pH 4,8), 15 (при pH 6,9), 22 (при pH 9).

Стабилен к гидролизу в стерильных условиях при pH 5 - 9 и фотолизу в воде.

Область применения: Мезотрион применяется для борьбы со всеми основными однолетними широколистными и некоторыми злаковыми сорняками в посевах кукурузы при нормах расхода 100 - 225 г/га (до всходов) и 70 - 150 г/га (по всходам).

В России для Мезотриона установлены следующие гигиенические нормативы: ДСД - 0,5 мг/кг массы тела человека; МДУ в зерне кукурузы - 0,1 мг/кг.

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций.

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительные интервалы среднего результата для полного диапазона концентраций (n = 20) приведены в табл. 2.

Метод основан на определении Мезотриона методом капиллярной газожидкостной хроматографии с использованием детектора по захвату электронов (ДПР, ДЭЗ) после его экстракции из образцов органическим растворителем, очистки экстракта перераспределением между двумя несмешивающимися фазами, гидролиза Мезотриона до 4-(метилсульфонил)-2-нитробензойной кислоты (MNBA) с целью получения метилового эфира этой кислоты.

Идентификацию вещества проводят по времени удерживания путем сравнения с аналитическим стандартом. Количественное определение - методом абсолютной калибровки.

В предлагаемых условиях анализа метод специфичен. Избирательность обеспечивается путем подбора капиллярной колонки и условий программирования температуры.

Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Допускается использование реактивов иных производителей с аналогичными или лучшими характеристиками.

Допускается применение хроматографических колонок и другого оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на газовый хроматограф.

4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 "Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны". Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004.

К выполнению измерений и обработке их результатов допускаются специалисты, имеющие высшее или специальное химическое образование, опыт работы в химической лаборатории, прошедшие обучение и владеющие техникой проведения анализа, освоившие метод анализа в процессе тренировки и уложившиеся в нормативы контроля при проведении процедуры контроля погрешности анализа.

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C, относительной влажности не более 80% и нормальном атмосферном давлении;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Выполнению измерений предшествуют следующие операции: очистка растворителей (при необходимости), приготовление растворов для анализа, кондиционирование хроматографической колонки, подготовка концентрирующих патронов Диапак С и Диапак С16 для очистки экстракта, проверка хроматографического поведения вещества на концентрирующих патронах Диапак С и Диапак С16, установление градуировочной зависимости.

Ацетонитрил, содержащий воду, предварительно осушают, добавляя в него гранулированный безводный хлористый кальций из расчета не менее 100 г/куб. дм. Выдерживают его над осушителем в течение 5 - 6 ч. Затем ацетонитрил сливают с осушителя в круглодонную колбу со шлифом объемом 4000 куб. см аппарата для перегонки растворителей.

Ацетонитрил перегоняют при температуре 81,5 °C, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше 81,5 °C, отбрасывают.

Ацетон помещают в круглодонную колбу со шлифом объемом 4000 куб. см от аппарата для перегонки растворителей, добавляют к нему марганцовокислый калий из расчета 1 г/куб. дм.

Ацетон перегоняют при температуре 56,2 °C, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше 56,2 °C, отбрасывают.

Дистиллят помещают в круглодонную колбу со шлифом объемом 4000 куб. см от аппарата для перегонки растворителей, добавляют к нему марганцовокислый калий из расчета 1 г/куб. дм и кипятят в течение 6 ч.

Собирают фракции, отогнанные при температуре 100,0 °C, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше 100,0 °C, отбрасывают.

7.2.1.1. Приготовление реактива Джонса.

53,6 г хромового ангидрида переносят в мерную колбу на 250 куб. см, куда предварительно наливают 150 куб. см дистиллированной воды, перемешивают и добавляют 14 куб. см концентрированной серной кислоты. Затем раствор перемешивают и после охлаждения доводят водой объем в колбе до метки (при приготовлении раствора соблюдать осторожность и работать под тягой). Хранить раствор при комнатной температуре.

7.2.1.2. Приготовление реактива A.

10 г сульфата меди переносят в мерную колбу на 250 куб. см, куда предварительно наливают 150 куб. см дистиллированной воды, перемешивают и добавляют 14 куб. см концентрированной серной кислоты. В полученный раствор добавляют 80 г сульфата натрия, перемешивают содержимое колбы и доводят водой объем в колбе до метки (при приготовлении раствора соблюдать осторожность и работать под тягой). Хранить раствор при комнатной температуре.

7.2.1.3. Приготовление 5%-го раствора гидрокарбоната натрия.

50 г гидрокарбоната натрия переносят в мерную колбу на 1000 куб. см, добавляют 200 - 300 куб. см дистиллированной воды, перемешивают до полного растворения и доводят водой объем в колбе до метки.

7.2.1.4. Приготовление 40%-го раствора гидроокиси калия.

40 г гидроокиси калия переносят в мерную колбу на 100 куб. см, куда предварительно наливают около 40 куб. см дистиллированной воды. Затем раствор перемешивают и после охлаждения доводят водой объем в колбе до метки (при приготовлении раствора соблюдать осторожность и работать под тягой).

7.2.1.5. Получение N-нитрозо-N-метилмочевины.

При отсутствии коммерческого препарата нитрозометилмочевины осуществляют его синтез.

При получении нитрозометилмочевины соблюдать осторожность и обязательно работать под тягой.

В круглодонную колбу на шлифе вместимостью 1000 куб. см, снабженную обратным холодильником, помещают 80 г метиламина гидрохлорида и 300 г мочевины, растворяют содержимое в 400 куб. см воды и нагревают 3 ч с обратным холодильником. После этого добавляют в раствор 110 г нитрита натрия, охлаждают в бане со льдом до -10 °C и медленно при перемешивании вливают в смесь 600 г льда и 60 куб. см концентрированной серной кислоты, помещенную в стакан вместимостью 2000 куб. см, охлаждаемый снаружи смесью льда с поваренной солью. Выпавшее нитрозосоединение немедленно отфильтровывают на воронке Бюхнера, хорошо отсасывают под вакуумом и промывают на фильтре ледяной водой.

ВНИМАНИЕ! Нитрозометилмочевину хранят в темной склянке в холодильнике, т.к. под действием света и тепла она может взорваться.

Продукт без дальнейшей очистки может быть использован для получения диазометана.

7.2.1.6. Получение раствора диазометана (метилирующей смеси).

ВНИМАНИЕ! Диазометан взрывоопасен и очень ядовит. При получении раствора диазометана, а также при работе с этим раствором необходимо соблюдать осторожность и обязательно работать под тягой.

В коническую колбу на 100 куб. см вносят 20 куб. см 40%-го раствора гидроокиси калия и 50 куб. см диэтилового эфира, колбу помещают в баню со льдом и охлаждают до температуры 2 - 5 °C. Затем, постоянно встряхивая колбу, небольшими порциями прибавляют 5 г нитрозометилмочевины. Через 10 мин. после внесения последней порции сливают эфирный раствор диазометана и сушат его 3 ч над небольшим количеством твердого едкого калия.

Полученный раствор диазометана годен в течение 1 - 2 суток при хранении в холодильнике в неплотно закрытом сосуде.

7.2.2.1. Стандартный раствор N 1 с концентрацией Мезотриона 1,0 мг/куб. см.

Взвешивают 50 мг Мезотриона в мерной колбе объемом 50 куб. см. Навеску растворяют в ацетоне и доводят объем до метки ацетоном. Полученный стандартный раствор N 1 используется для приготовления стандартных растворов для хроматографического исследования и установления градуировочной характеристики. Раствор хранится в холодильнике в течение 6 месяцев.

7.2.2.2. Стандартный раствор N 2 с концентрацией Мезотриона 10,0 мкг/куб. см.

Из стандартного раствора N 1 отбирают пипеткой 1 куб. см, помещают в мерную колбу объемом 100 куб. см и доводят объем до метки ацетоном. Стандартный раствор N 2 используется для приготовления стандартных растворов для установления градуировочной характеристики и для внесения в контрольные образцы. Раствор может храниться в холодильнике не более 30 суток.

7.2.2.3. Стандартный раствор N 3 с концентрацией Мезотриона 5,0 мкг/куб. см.

Из стандартного раствора N 2 отбирают пипеткой 5 куб. см, помещают в мерную колбу объемом 10 куб. см и доводят объем до метки ацетоном. Стандартный раствор N 3 используется для приготовления стандартных растворов для установления градуировочной характеристики и для внесения в контрольные образцы. Раствор может храниться в холодильнике не более 30 суток.

7.2.2.4. Стандартный раствор N 4 с концентрацией Мезотриона 2,5 мкг/куб. см.

Из стандартного раствора N 3 отбирают пипеткой 5 куб. см, помещают в мерную колбу объемом 10 куб. см и доводят объем до метки ацетоном. Стандартный раствор N 4 используется для установления градуировочной характеристики и для внесения в контрольные образцы. Раствор может храниться в холодильнике не более 30 суток.

7.2.2.5. Стандартный раствор N 5 с концентрацией Мезотриона 1,0 мкг/куб. см.

Из стандартного раствора N 2 отбирают пипеткой 1 куб. см, помещают в мерную колбу объемом 10 куб. см и доводят объем до метки ацетоном. Стандартный раствор N 5 используется для установления градуировочной характеристики и для внесения в контрольные образцы. Раствор может храниться в холодильнике не более 30 суток.

7.2.2.6. Стандартные растворы с концентрацией Мезотриона 5,0, 2,0, 1,0 и 0,5 мкг/куб.см для внесения в контрольные образцы.

Методом последовательного разведения ацетоном готовят растворы, содержащие по 5,0; 2,0; 1,0 и 0,5 мкг/куб. см, и используют эти растворы для внесения в контрольные образцы масла. Стандартные растворы для внесения в контрольные образцы хранятся в холодильнике не более 30 суток.

Из полученных стандартных растворов Мезотриона отбирают по 1 куб. см и помещают в виалы с плотно закрывающимися крышками, имеющими тефлоновые прокладки. Содержимое виал высушивают в токе теплого воздуха, затем в каждую добавляют по 2 куб. см реактива Джонса (п. 7.2.1.1), закрывают виалы крышками и перемешивают содержимое, обмывая стенки виал. Помещают виалы в Dri-Block, нагретый до температуры 88 - 89 °C, и выдерживают их в течение 13 мин. Через 5 мин. после начала гидролиза содержимое виал быстро перемешивают еще раз и продолжают гидролиз. (Внимание! При гидролизе температура не должна опускаться ниже 85 °C.)

По окончании гидролиза виалы охлаждают при комнатной температуре. В каждую виалу добавляют по 10 куб. см бидистиллированной воды, 2 - 3 г сульфата натрия и 10 куб. см этилацетата, плотно закрывают крышками, встряхивают содержимое виал в течение 30 с и оставляют на 5 мин. для полного разделения слоев. Из верхнего слоя этилацетата пипеткой отбирают 8 - 9 куб. см и переносят в чистую виалу. (Следить за тем, чтобы конец пипетки не касался нижнего слоя! Использовать каждый раз чистые пипетки!)

К отобранной порции этилацетата добавляют 2 куб. см реактива A (п. 7.2.1.2), закрывают виалу крышкой, встряхивают 20 с и оставляют на 5 мин. Из верхнего слоя отбирают 6 - 7 куб. см этилацетата, переносят в чистую виалу, добавляют 2 куб. см реактива A, встряхивают 30 с и оставляют на 5 мин. Затем отбирают из верхнего слоя 5 куб. см этилацетата и переносят в концентратор емкостью 100 куб. см. Этилацетат выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре 25 - 30 °C.

При гидролизе Мезотриона получают 4-(метилсульфонил)-2-нитробензойную кислоту - MNBA.

Гидролиз проб, содержащих Мезотрион, проводится аналогичным образом.

Для получения метилового эфира MNBA (MNBA-Me) к сухому остатку в концентраторе, полученному по п. 7.4, добавляют 2 куб. см раствора диазометана (метилирующей смеси), плотно закрывают концентратор, перемешивают содержимое, обмывая стенки концентратора, и оставляют при комнатной температуре на 30 мин. По окончании метилирования эфир из концентратора удаляют током воздуха или азота. Сухой остаток в концентраторе растворяют в 5 куб. см ацетона.

Метилирование проб, содержащих MNBA, проводится аналогичным образом.

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади (высоты) пика от концентрации Мезотриона в растворе (мкг/куб. см), устанавливают методом абсолютной калибровки по 4 растворам для градуировки MNBA-Me с концентрациями по Мезотриону 0,05, 0,10, 0,25 и 0,50 мкг/куб. см.

В инжектор хроматографа вводят по 1 куб. мм каждого градуировочного раствора Мезотриона и хроматографируют в условиях, указанных в п. 9.2. Проводят не менее 5 параллельных измерений и находят среднее значение площади хроматографического пика дня каждой концентрации.

Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" от 21.08.1979 N 2051-79, а также в соответствии с ГОСТ 8808-2000 "Масло кукурузное. ТУ", ГОСТ 5471-83 "Масла растительные. Правила приемки и методы отбора проб".

Пробы кукурузного масла хранят в стеклянной герметично закрытой таре в холодильнике при температуре 4 °C не более 10 суток.

Из пробы кукурузного масла отбирают в стакан навеску массой 10 г, растворяют ее в 40 куб. см гексана и переносят в делительную воронку объемом 250 куб. см. Мезотрион экстрагируют тремя порциями ацетонитрила объемом по 50, 40 и 40 куб. см, каждый раз встряхивая делительную воронку 2 мин. После полного разделения фаз в делительной воронке нижний ацетонитрильный слой собирают в концентратор объемом 250 куб. см и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °C.

Сухой остаток в концентраторе, полученный по п. 9.1.1, растворяют в 5 куб. см ацетонитрила, тщательно обмывая стенки концентратора, добавляют 30 куб. см 5%-го раствора бикарбоната натрия, перемешивают содержимое и переносят в делительную воронку. Исходный концентратор обмывают 50 куб. см дистиллированной воды и переносят в делительную воронку. Насыпают в делительную воронку 5 г хлористого натрия, перемешивают содержимое воронки до полного растворения соли, приливают 30 куб. см диэтилового эфира и встряхивают воронку в течение 2 мин. После разделения фаз нижний водный слой сливают в чистый стакан объемом 250 куб. см, а эфир отбрасывают. Водную фазу из стакана возвращают в делительную воронку и повторяют промывку эфиром еще два раза, добавляя по 30 куб. см диэтилового эфира и встряхивая каждый раз делительную воронку в течение 2 мин.

Водную фазу переносят в стакан и доводят pH раствора до значения 2 с помощью концентрированной соляной кислоты. Полученный раствор переносят в чистую делительную воронку объемом 250 куб. см и осторожно дегазируют. Мезотрион экстрагируют тремя порциями этилацетата по 50 куб. см, каждый раз встряхивая воронку 2 мин. После разделения фаз нижнюю водную фазу сливают в стакан объемом 250 куб. см, а этилацетат собирают через безводный сульфат натрия в концентратор объемом 250 куб. см. Объединенный в концентраторе этилацетат выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре 30 °C.

Сухой остаток в концентраторе, полученный по п. 9.1.2, растворяют в 2 куб. см ацетона, тщательно обмывают стенки концентратора. Раствор переносят в виалу объемом 40 куб. см с помощью пипетки Пастера. Процедуру повторяют еще два раза, обмывая исходный концентратор по 2 куб. см ацетона, ацетон объединяют в виале, а затем удаляют током теплого воздуха.

Далее проводят гидролиз, как указано в п. 7.3.

К сухому остатку в концентраторе, полученному после гидролиза по п. 9.1.3, добавляют 2 куб. см метилирующей смеси и подвергают метилированию, как указано в п. 7.4.

Сухой остаток растворяют в 10 куб. см гексана, и 1 куб. мм пробы вводят в хроматограф.

Колонка капиллярная кварцевая HP-1 (Crosslinked Methyl Siloxane), длина 30 м, внутренний диаметр 0,25 мм, толщина пленки 0,25 мкм.

Температура термостата колонки программированная. Начальная температура - 180 °C, выдержка 2 мин.; нагрев колонки по 8 град./мин. до температуры 230 °C, выдержка 7 мин.

Температура испарителя - 250 °C, детектора - 320 °C.

Газовый режим - Splitless.

Газ-носитель - гелий (Г1). Тип регулятора расхода гелия - РРГ-11, линейная скорость - 22 см/с, давление на входе - 98,26 кПа.

Газ 2 (Г2) - гелий, расход 0,5 куб. см/мин., сброс 1:40, начало сброса - 10 с, длительность сброса - 2 мин.

Газ 3 (ГЗ) - азот (поддув в детектор), расход во время анализа - 35 куб. см/мин.

Продувка системы после анализа при температуре 260 °C в течение 4 мин.: продувка испарителя гелием - 50 куб. см/мин.; продувка детектора азотом - 65 куб. см/мин.

Абсолютное время удерживания Мезотриона: 8 мин. 51 с +/- 2%.

Объем вводимой пробы: 1 куб. мм.

Линейность детектирования сохраняется в пределах 0,05 - 0,5 нг.

Содержание Мезотриона в пробах пера и репки лука рассчитывают методом абсолютной калибровки по формуле:

A - концентрация стандартного раствора, мкг/куб. см;

V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, куб. см;

m - масса анализируемого образца, г (куб. см);

P - содержание Мезотриона в аналитическом стандарте, %.

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

Результат анализа представляют в виде:

где дельта - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

В случае, если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание вещества в пробе менее 0,01 мг/кг" <*>.

--------------------------------

<*> 0,01 мг/кг - предел обнаружения.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом добавок.

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):

R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

Российский государственный аграрный университет - МСХА им. К.А. Тимирязева.

Учебно-научный консультационный центр "Агроэкология пестицидов и агрохимикатов".