"МУК 4.1.3051-13. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств флуксапироксада в зеленой массе и клубнях картофеля, яблоках, яблочном соке, винограде и виноградном соке методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 05.07.2013)

1. Разработаны сотрудниками ГНУ Всероссийский НИИ защиты растений Россельхозакадемии.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 30 мая 2013 г. N 1).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 5 июля 2013 г.

4. Введены впервые.

Свидетельство о метрологической аттестации N 01.5.04.127/01.00043/2013.

Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения массовой концентрации флуксапироксада в клубнях картофеля, яблоках, винограде, яблочном и виноградном соках в диапазоне концентраций 0,005 - 0,050 мг/кг, в зеленой массе - в диапазоне концентраций 0,01 - 0,10 мг/кг.

Методические указания носят рекомендательный характер.

Название действующего вещества по ИСО: флуксапироксад.

Название действующего вещества по ИЮПАК: (+/-)3-(дифторметил)-1-метил-N(3',4',5'-трифтор[1,1'-бифенил]-2-ил)-1H-пиразол-4-карбоксамид.

Структурная формула:

Эмпирическая формула: .

Молекулярная масса: 381.

Химически чистое вещество представляет собой кристаллический порошок бежевого цвета без запаха.

Температура плавления: > 157 °C.

Давление пара: .

Коэффициент распределения в системе н-октанол-вода: (20 °C).

Растворимость в воде (мг/куб. дм, 20 °C): 3,88.

Растворимость в органических растворителях (г/куб. дм, 20 °C): ацетон > 250; ацетонитрил, дихлорметан, этилацетат > 100, метанол - 53,4, толуол - 20,0.

Гидролитически стабилен в водных растворах при pH 4 - 9.

Краткая токсикологическая характеристика

Острая пероральная - массы тела. Острая кожная - массы тела. Острая ингаляционная - .

Раздражающее действие - кролики: кожа - не раздражает; глаза - не раздражает.

Сенсибилизация - не обладает.

Область применения: фунгицид для обработки вегетирующих растений против комплекса болезней зерновых культур.

В России для флуксапироксада гигиенические нормативы не установлены.

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1, для соответствующих диапазонов концентраций.

--------------------------------

<*> Соответствует расширенной неопределенности при коэффициенте охвата k = 2.

Методика основана на определении флуксапироксада методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием ультрафиолетового детектора после его извлечения из образцов водно-ацетоновой смесью, очистки перераспределением в системе несмешивающихся растворителей и последующей очистки на патроне с гидрофильным слабокислотным сорбентом на основе силикагеля.

Идентификация флуксапироксада проводится по времени удерживания, количественное определение - методом абсолютной калибровки.

Избирательность метода обеспечивается сочетанием условий подготовки проб и хроматографирования.

Жидкостный хроматограф с быстросканирующим ультрафиолетовым детектором, снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки.

Весы аналитические с пределом взвешивания до 210 г и пределом допустимой погрешности 0,2 мг, ГОСТ 24104-2001.

Весы технические с пределом взвешивания до 400 г и допустимой погрешностью 0,1 г, ГОСТ 24104-2001.

Колбы мерные на 10, 100 и 1000 куб. см, ГОСТ 23932-90.

Микродозаторы одноканальные переменного объема от 200 до 1000 куб. мм и от 1 до 5 куб. см.

Цилиндры мерные на 50 и 100 куб. см, ГОСТ 23932-90.

Примечание: Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Ацетон, особой чистоты, ТУ 6-09-3513-86.

Ацетонитрил, химически чистый, ТУ 6-09-3534-87.

Вода для лабораторного анализа (бидистиллированная, деионизованная), ГОСТ Р 52501-2005.

н-Гексан, химически чистый, ТУ 6-09-3375-78.

Кислота ортофосфорная , химически чистая, ГОСТ 6552-80.

Метилен хлористый, химически чистый, ТУ 2631-019-44493179-98.

Натрия гидроксид, химически чистый, ГОСТ 4328-77.

Натрий сернокислый безводный, химически чистый, ГОСТ 4166-76.

Натрий хлористый, чистый для анализа, ГОСТ 4233-77.

Смесь N 1: этилацетат-гексан в соотношении 1:4 по объему.

Смесь N 2: этилацетат-гексан в соотношении 1:1 по объему.

Смесь N 3: ацетон-вода в соотношении 3:1 по объему.

Подвижная фаза для ВЭЖХ: смесь ацетонитрила и 0,005 М в соотношении 40:60.

Флуксапироксад с содержанием основного вещества 99,7%.

Этилацетат, химически чистый, ГОСТ 1138-84.

Примечание: Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией, не требующих дополнительной очистки растворителей.

Аналитическая колонка, заполненная сорбентом с привитыми монофункциональными полярными группами C18, (100 x 2,1) мм, 1,7 мкм.

Воронки лабораторные В-75-110, ГОСТ 25336-82.

Воронки делительные вместимостью 250 куб. см, ГОСТ 25336-82.

Колбы круглодонные на шлифе вместимостью 10, 100 куб. см, ГОСТ 9737-93.

Колбы плоскодонные конические вместимостью 100 куб. см, ГОСТ 25336-82

Патроны для твердофазной экстракции, заполненные гидрофильным слабокислотным сорбентом на основе силикагеля, 0,4 г, ТУ 4215-002-0545-931-94.

Ротационный вакуумный испаритель с мембранным насосом, обеспечивающим вакуум до 10 мбар.

Стаканы химические вместимостью 150 куб. см, ГОСТ 25336-82.

Ультразвуковая ванна с рабочей частотой 35 кГц.

Фильтры бумажные средней плотности, ТУ 6.091678-86.

Примечание: Допускается применение оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-2009, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф.

4.2. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией, соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и ГН 2.2.5.2308-07.

Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004-90.

Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист-химик, имеющий опыт работы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, ознакомленный с руководством по эксплуатации хроматографа, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 13.

При выполнении измерений выполняют следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C и относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Перед началом анализа колонку кондиционируют в потоке подвижной фазы (0,1 - 0,2 куб. см/мин.) до стабилизации нулевой линии.

Патрон с гидрофильным слабокислотным сорбентом на основе силикагеля промывают 2 куб. см смеси N 2, затем 3 куб. см гексана.

7.3.1. 0,005 М раствор ортофосфорной кислоты: 0,5 +/- 0,01 г 98% ортофосфорной кислоты помещают в мерную колбу объемом 1 куб. дм, растворяют в бидистиллированной воде и доводят объем до метки.

7.3.2. Для приготовления подвижной фазы смешивают ацетонитрил с 0,005 М раствором ортофосфорной кислоты в соотношении 40:60 по объему, используя мерные цилиндры.

7.3.3. 20% раствор хлорида натрия: в мерную колбу объемом 1 куб. дм помещают 200 г хлорида натрия, растворяют в бидистиллированной воде и доводят объем до метки.

7.3.4. 0,0025 М раствор гидроксида натрия: 1,0 г гидроксида натрия помещают в мерную колбу объемом 1 куб. дм, растворяют в бидистиллированной воде и доводят объем до метки.

7.4.1. Основной раствор с концентрацией 0,5 мг/куб. см: точную навеску флуксапироксада (50 +/- 0,5 мг) помещают в мерную колбу вместимостью 100 куб. см, растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки ацетонитрилом.

7.4.2. Приготовление градуировочных растворов

Градуировочные растворы с концентрациями флуксапироксада 0,05, 0,1, 0,2, 0,5 и 1,0 мкг/куб. см готовят методом последовательного разбавления по объему, используя раствор подвижной фазы (смесь ацетонитрила и 0,005 М ортофосфорной кислоты в соотношении 40:60).

7.4.2.1. Раствор N 1 с концентрацией 1,0 мкг/куб. см: в мерную колбу вместимостью 100 куб. см вносят 0,2 куб. см основного раствора и доводят до метки подвижной фазой.

7.4.2.2. Раствор N 2 с концентрацией 0,5 мкг/куб. см: в мерную колбу вместимостью 10 куб. см помещают 5,0 куб. см раствора N 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.4.2.3. Раствор N 3 с концентрацией 0,2 мкг/куб. см: в мерную колбу вместимостью 10 куб. см помещают 2 куб. см раствора N 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.4.2.4. Раствор N 4 с концентрацией 0,1 мкг/куб. см: в мерную колбу вместимостью 10 куб. см помещают 1 куб. см раствора N 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.4.2.5. Раствор N 5 с концентрацией 0,05 мкг/куб. см: в мерную колбу вместимостью 10 куб. см помещают 0,5 куб. см раствора N 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

Основной раствор можно хранить в холодильнике при температуре 0 - 4 °C в течение 1 месяца, градуировочные растворы - в течение суток.

При изучении полноты определения флуксапироксада в клубнях и зеленой массе картофеля, яблоках, яблочном соке, винограде и виноградном соке используют ацетонитрильные растворы вещества, приготовленные из основного раствора методом последовательного разбавления по объему ацетонитрилом.

Для установления градуировочной характеристики (площадь пика - концентрация флуксапироксада в растворе) в хроматограф вводят по 10 куб. мм градуировочных растворов (не менее 3 параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4 точек по диапазону измеряемых концентраций). Затем измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации флуксапироксада в градуировочном растворе.

Методом наименьших квадратов рассчитывают градуировочный коэффициент (K) в уравнении линейной регрессии:

где S - площадь пика градуировочного раствора.

Градуировку признают удовлетворительной, если значение коэффициента линейной корреляции оказывается не ниже 0,99.

Градуировочную характеристику необходимо проверять при замене реактивов, хроматографической колонки или элементов хроматографической системы, а также при отрицательном результате контроля градуировочного коэффициента.

Градуировочную зависимость признают стабильной при выполнении следующего условия:

где C - аттестованное значение массовой концентрации флуксапироксада в градуировочном растворе;

- результат контрольного измерения массовой концентрации флуксапироксада в градуировочном растворе;

- норматив контроля градуировочного коэффициента, % ( при P = 0,95).

В круглодонную колбу емкостью 10 куб. см отбирают 1 куб. см стандартного раствора флуксапироксада с концентрацией 1 мкг/куб. см. Отдувают растворитель током воздуха. Остаток растворяют в 1 куб. см гексана и переносят на подготовленный патрон. Колбу обмывают 1 куб. см гексана и смыв тоже переносят на патрон. Промывают патрон 6 куб. см смеси N 1, элюат отбрасывают. Затем элюируют флуксапироксад смесью N 2 со скоростью 1 - 2 капли в сек. Отбирают фракции по 2 куб. см, упаривают досуха, растворяют в 1 куб. см подвижной фазы (ацетонитрил - 0,005 М , 40:60) и анализируют по п. 9.4.

Фракции, содержащие флуксапироксад, объединяют и вновь анализируют.

Устанавливают уровень вещества в элюате, определяют полноту смывания с патрона и необходимый для очистки объем элюата.

Примечание: Проверку хроматографического поведения флуксапироксада следует проводить обязательно, поскольку профиль вымывания может изменяться при использовании новой партии патронов и растворителей.

Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (от 21.08.79 N 2051-79), а также отбор проб винограда производят в соответствии с ГОСТ 25896-83 "Виноград свежий столовый. Технические условия". Пробы ягод винограда хранят до анализа в герметично закрытом двойном полиэтиленовом пакете в морозильной камере при температуре не выше -18 °C в течение 6 месяцев. Отбор проб яблок производят в соответствии с ГОСТ 27572-87 "Яблоки свежие для промышленной переработки". Пробы виноградного и яблочного сока хранят до анализа в морозильной камере при температуре не выше -18 °C в течение месяца, в холодильнике при температуре 0 - 4 °C в стеклянной таре с притертой пробкой в течение недели.

Отбор проб картофеля производится в соответствии с ГОСТ 26832-86 "Картофель свежий для переработки на продукты питания". Пробы клубней и ботвы картофеля для определения остатков в урожае хранят в морозильной камере при -18 °C.

Навеску измельченной культуры (10 г - зеленая масса, 20 г - клубни картофеля, яблоки, виноград) помещают в коническую колбу вместимостью 100 куб. см, добавляют 40 куб. см смеси N 3 и колбу помещают в ультразвуковую ванну на 10 мин. Водно-ацетоновый экстракт декантируют в круглодонную колбу вместимостью 100 куб. см, пропуская через бумажный фильтр, к остатку в колбе добавляют 30 куб. см смеси N 3 и повторяют экстракцию. Объединенный экстракт упаривают на ротационном вакуумном испарителе до водного остатка, доводят объем до 100 куб. см 20%-ым водным раствором хлорида натрия и переносят в делительную воронку вместимостью 250 куб. см, добавляют 30 куб. см хлористого метилена и интенсивно встряхивают 2 - 3 мин. После полного разделения фаз нижний органический слой отбирают, к водному добавляют 30 куб. см хлористого метилена и экстракцию повторяют. Объединенные органические фракции дважды промывают в делительной воронке 20 куб. см 0,0025 М раствора гидроксида натрия, пропускают через воронку, содержащую безводный сульфат натрия, собирают в круглодонную колбу вместимостью 100 куб. см и растворитель упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 40 °C. Сухой остаток подвергают очистке на патроне по п. 9.3.

Навеску 10 г сока помещают в стакан вместимостью 150 куб. см, доводят объем до 100 куб. см 20%-ым водным раствором хлорида натрия и переносят в делительную воронку вместимостью 250 куб. см, добавляют 30 куб. см хлористого метилена и интенсивно встряхивают 2 - 3 мин. После полного разделения фаз нижний органический слой отбирают, к водному добавляют 30 куб. см хлористого метилена и экстракцию повторяют. Объединенные органические фракции промывают в делительной воронке два раза по 20 куб. см 0,0025 М раствора гидроксида натрия, пропускают через воронку, содержащую безводный сульфат натрия, собирают в круглодонную колбу вместимостью 100 куб. см и растворитель упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 40 °C. Сухой остаток подвергают очистке на патроне по п. 9.3.

Сухой остаток, полученный по пп. 9.1 или 9.2, растворяют в 1 куб. см гексана, наносят на предварительно кондиционированный патрон, колбу ополаскивают 1 куб. см гексана и так же наносят на патрон. Патрон промывают 6 куб. см смеси N 1, элюат отбрасывают. Флуксапироксад элюируют 5 куб. см смеси N 2, элюат собирают, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе, остаток растворяют в 1 куб. см подвижной фазы и 10 куб. мм вводят в хроматограф.

Ультраэффективный жидкостной хроматограф с быстросканирующим ультрафиолетовым детектором, снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки. Аналитическая колонка (2,1 x 100) мм, 1,7 мкм, заполненная сорбентом с привитыми монофункциональными полярными группами C18. Температура колонки (30 +/- 1) °C. Подвижная фаза: смесь ацетонитрила и 0,005 М ортофосфорной кислоты в соотношении 40:60. Скорость потока элюента: 0,2 куб. см/мин. Рабочая длина волны ультрафиолетового детектора 230 нм. Объем вводимой пробы 10 куб. мм.

Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки. Содержание флуксапироксада в пробе (X, мг/кг) вычисляют по формуле:

где - площадь пика флуксапироксада на хроматограмме испытуемого образца, кв. мм (AU);

K - градуировочный коэффициент, найденный на стадии построения соответствующей градуировочной зависимости;

V - объем пробы, подготовленной для хроматографического анализа, куб. см;

P - навеска анализируемого образца, г;

f - полнота извлечения флуксапироксада, приведенная в табл. 2, %.

Содержание остаточных количеств флуксапироксада в образце вычисляют как среднее из двух параллельных определений.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор флуксапироксада с концентрацией 1,0 мкг/куб. см, разбавляют подвижной фазой для ВЭЖХ.

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предел повторяемости:

где , - результаты параллельных определений, мг/кг;

r - значение предела повторяемости .

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

Результат анализа представляют в виде:

где - среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

- граница абсолютной погрешности, мг/кг;

где - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

В случае, если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание вещества в пробе "менее нижней границы определения" (например: менее 0,005 мг/кг <*>).

--------------------------------

<*> 0,005 мг/кг - предел обнаружения флуксапироксада в клубнях картофеля.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.

Величина добавки должна удовлетворять условию:

где - характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой соответственно), мг/кг; при этом:

где - граница абсолютной погрешности, мг/кг:

где - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

Результат контроля процедуры рассчитывают по формуле:

где , , - среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки, соответственно, мг/кг.

Норматив контроля K рассчитывают по формуле:

Проводят сопоставление результата контроля процедуры () с нормативом контроля (K).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию:

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры к их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости:

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предел воспроизводимости (R):

где , - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;

R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций), %.