"МУК 4.1.3096-13. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств пропамокарба гидрохлорида в луке-репке методом капиллярной газожидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 31.07.2013)

1. Разработаны Российским государственным аграрным университетом - МСХА им. К.А. Тимирязева, Учебно-научным консультационным центром "Агроэкология пестицидов и агрохимикатов" Минсельхоза России (В.А. Калинин, Т.С. Калинина).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 30 мая 2013 г. N 1).

3. Утверждены руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 31 июля 2013 г.

4. Введены впервые.

Свидетельство о метрологической аттестации от 24.04.2012 N 0118.24.04.12.

Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода капиллярной газожидкостной хроматографии для определения уровня остаточных количеств пропамокарба гидрохлорида в луке-репке в диапазоне 1,0 - 10,0 мг/кг.

Методические указания носят рекомендательный характер.

Название действующего вещества по ИСО: пропамокарба гидрохлорид.

Название действующего вещества по ИЮПАК: пропил-3-(диметиламин)пропилкарбамат гидрохлорид.

Структурная формула:

Эмпирическая формула: C₉H₂₁ClN₂O₂.

Молекулярная масса: 224,7.

Агрегатное состояние: кристаллическое, чрезвычайно гигроскопическое вещество.

Цвет, запах: бесцветное вещество без запаха.

Давление паров (при 20 °C): 3,85 x 10^-2 мПа.

Температура плавления: 64,2 °C.

Коэффициент распределения октанол-вода (при pH 7): K_ow logP_ow = -1,21.

Растворимость в воде (г/дм³, при 20 °C): более 500.

Растворимость в органических растворителях (г/дм³, при 20 °C): метанол - 656; хлористый метилен - более 626; ацетон - 560; этилацетат - 4,34; толуол - 0,14; гексан - менее 0,01.

Пропамокарба гидрохлорид стабилен при нормальных условиях хранения, не гидролизуется в водном растворе при различных значениях pH и температуры.

Пропамокарб гидрохлорид относится к мало опасным веществам по острой пероральной (ЛД₅₀ для крыс от 2 000 до 2 900 мг/кг) и дермальной (ЛД₅₀ для крыс и мышей более 3 000 мг/кг) токсичностям, но к умеренно опасным веществам по ингаляционной токсичности (ЛК₅₀/4 ч/для крыс более 5 540 мг/м³ воздуха).

Пропамокарба гидрохлорид нетоксичен для пчел, птиц и диких животных.

Пропамокарба гидрохлорид - системный фунгицид с продолжительным защитным действием, рекомендуемый для борьбы с возбудителями пероноспороза, фитофтороза, черной ножки, корневых гнилей овощных (в том числе лука-репки), декоративных культур и табака путем внесения в почву, опрыскивания вегетирующих растений и обработки семян, корней рассады, клубней и клубнелуковиц перед посадкой.

МДУ в импортируемом луке-репке 10 мг/кг.

В России гигиенический норматив не установлен.

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций.

--------------------------------

<*> X - среднее значение массовой концентрации пропамокарба гидрохлорида в пробе, мг/кг.

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительные интервалы среднего результата для полного диапазона концентраций (n = 20) приведены в табл. 2.

Метод основан на определении пропамокарба гидрохлорида с помощью газожидкостной хроматографии (ГЖХ) с использованием капиллярной колонки и термоионного детектора после его экстракции из образцов органическим растворителем, очистки экстракта перераспределением между двумя несмешивающимися фазами и на концентрирующих патронах N 1.

Идентификация веществ проводится по времени удерживания, а количественное определение - методом абсолютной калибровки.

В предлагаемых условиях анализа метод специфичен. Специфичность обеспечивается подбором колонки и условий программирования.

Примечание. Допускается использование средств измерений с аналогичными или лучшими характеристиками.

Примечание. Допускается использование реактивов с аналогичными или лучшими характеристиками.

Примечание. Допускается применение оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-09, а также требования, изложенные в технической документации на газовый хроматограф.

4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004-90 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать нормы, установленные ГН 2.2.5.1313-03 "Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны". Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004-90.

К выполнению измерений и обработке их результатов допускаются специалисты, имеющие опыт работы в химической лаборатории, прошедшие обучение и владеющие техникой проведения анализа, освоившие метод анализа в процессе тренировки и уложившиеся в нормативы контроля при проведении процедуры контроля погрешности анализа.

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C, относительной влажности не более 80% и нормальном атмосферном давлении;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Выполнению измерений предшествуют следующие операции: очистка растворителей (при необходимости), приготовление растворов, кондиционирование хроматографической колонки, подготовка концентрирующих патронов N 1 для очистки экстракта, проверка хроматографического поведения вещества на концентрирующих патронах N 1, установление градуировочной характеристики.

Ацетонитрил, содержащий воду, предварительно осушают, добавляя в него гранулированный безводный хлористый кальций из расчета не менее 100 г/дм³. Выдерживают его над осушителем в течение 5 - 6 ч. Затем ацетонитрил сливают с осушителя в круглодонную колбу со шлифом объемом 4 000 см³ аппарата для перегонки растворителей.

Ацетонитрил перегоняют при температуре 81,5 °C, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше 81,5 °C, отбрасывают.

Ацетон помещают в круглодонную колбу со шлифом объемом 4 000 см³ от аппарата для перегонки растворителей, добавляют к нему марганцово-кислый калий из расчета 1 г/дм³.

Ацетон перегоняют при температуре 56,2 °C, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше 56,2 °C, отбрасывают.

Дистиллят помещают в круглодонную колбу со шлифом объемом 4 000 см³ от аппарата для перегонки растворителей, добавляют к нему марганцово-кислый калий из расчета 1 г/дм³ и кипятят в течение 6 ч.

Собирают фракции, отогнанные при температуре 100,0 °C, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше 100,0 °C, отбрасывают.

Постепенно переносят в мерную колбу на 500 см³ 200 г гидроксида натрия, куда предварительно наливают около 300 см³ дистиллированной воды. Затем раствор перемешивают и после охлаждения доводят водой объем в колбе до метки (при приготовлении раствора соблюдать осторожность и работать под тягой).

Мерным цилиндром отбирают 82 см³ концентрированной соляной кислоты и осторожно переносят в мерную колбу на 1 000 см³, куда предварительно наливают около 400 см³ дистиллированной воды. Затем раствор перемешивают и после охлаждения доводят водой объем в колбе до метки (при приготовлении раствора соблюдать осторожность и работать под тягой).

Мерной пипеткой отбирают 8,2 см³ концентрированной соляной кислоты и осторожно переносят в мерную колбу на 1 000 см³, куда предварительно наливают около 400 см³ дистиллированной воды. Затем раствор перемешивают и после охлаждения доводят водой объем в колбе до метки (при приготовлении раствора соблюдать осторожность и работать под тягой).

Взвешивают 50 мг пропамокарба гидрохлорида в мерной колбе объемом 50 см³. Навеску растворяют в ацетоне и доводят объем до метки ацетоном. Полученный стандартный раствор N 1 используется для приготовления стандартных растворов, хроматографического исследования и установления градуировочной характеристики. Раствор хранится в холодильнике около 120 суток.

Из стандартного раствора N 1 отбирают пипеткой 1 см³, помещают в мерную колбу объемом 10 см³ и доводят объем до метки ацетоном. Стандартный раствор N 2 используется для приготовления стандартных растворов, установления градуировочной характеристики и внесения в контрольные образцы. Раствор может храниться в холодильнике не более 30 суток.

Из стандартного раствора N 2 отбирают пипеткой 2 см³, помещают в мерную колбу объемом 10 см³ и доводят объем до метки ацетоном. Стандартный раствор N 3 используется для приготовления стандартных растворов, установления градуировочной характеристики и внесения в контрольные образцы. Раствор может храниться в холодильнике не более 30 суток.

Из стандартного раствора N 2 отбирают пипеткой 1 см³, помещают в мерную колбу объемом 100 см³ и доводят объем до метки ацетоном. Стандартный раствор N 4 используется для приготовления стандартных растворов, установления градуировочной характеристики и внесения в контрольные образцы. Раствор может храниться в холодильнике не более 30 суток.

Из стандартного раствора N 4 отбирают пипеткой 5 см³, помещают в мерную колбу объемом 10 см³ и доводят объем до метки ацетоном. Стандартный раствор N 5 используется для приготовления стандартных растворов, установления градуировочной характеристики и внесения в контрольные образцы. Раствор может храниться в холодильнике не более 30 суток.

Из стандартного раствора N 3 отбирают пипеткой 1 см³, помещают в мерную колбу объемом 10 см³ и доводят объем до метки ацетоном. Стандартный раствор N 6 используется для установления градуировочной характеристики и внесения в контрольные образцы. Раствор может храниться в холодильнике не более 30 суток.

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади (высоты) пика от концентрации пропамокарба гидрохлорида в растворе (мкг/см³), устанавливают методом абсолютной калибровки по 4 растворам для градуировки с концентрацией 20,0; 10,0; 5,0 и 2,0 мкг/см³.

В испаритель хроматографа вводят по 1 мм³ каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.2. Осуществляют не менее 5 параллельных измерений.

По полученным данным строят градуировочный график зависимости площади хроматографического пика (мВ) от концентрации пропамокарба гидрохлорида в растворе (мкг/см³).

Все процедуры происходят с использованием вакуума, скорость потока растворов через патрон не должна превышать 5 см³/мин.

Патрон N 1 устанавливают на алонж с отводом для вакуума, сверху в патрон вставляют шприц объемом не менее 10 см³ (используют как емкость для элюентов).

Кондиционирование: концентрирующий патрон промывают 10 см³ ацетонитрила, затем 10 см³ воды. Элюаты отбрасывают.

Из стандартного раствора пропамокарба гидрохлорида в ацетоне, содержащего 10,0 мкг/см³, отбирают 1 см³, помещают в концентратор объемом 100 см³ и выпаривают на ротационном вакуумном испарителе досуха при температуре не выше 30 °C. Сухой остаток растворяют в 1 см³ ацетонитрила, тщательно обмывая стенки концентратора, прибавляют 10 см³ воды, перемешивают и вносят на патрон. Элюат собирают в концентратор объемом по 100 см³, выпаривают на ротационном вакуумном испарителе досуха при температуре не выше 30 °C, сухой остаток растворяют в 1 см³ ацетона и 1 мм³ пробы вводят в хроматограф.

Исходный концентратор обмывают последовательно 10 см³ смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1, а затем пятью порциями смеси ацетонитрила с 0,1 н водным раствором соляной кислоты в соотношении 1:1 объемом 5 см³ каждая, полученные растворы последовательно вносят на патрон. Элюаты после прохождения каждой порции элюентов собирают в отдельные концентраторы объемом по 100 см³, выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °C, сухой остаток растворяют в 1 см ацетона и хроматографируют.

Определяют фракции, содержащие пропамокарб гидрохлорида, полноту смывания с патрона и необходимый объем элюента.

Изучение поведения пропамокарба гидрохлорида на концентрирующих патронах N 1 проводят каждый раз при отработке методики или поступлении новой партии концентрирующих патронов.

Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов", от 21.08.79 N 2051-79, а также в соответствии с ГОСТ Р 51783-01 "Лук репчатый свежий, реализуемый в розничной торговой сети. ТУ".

Пробы лука хранят в холодильнике в полиэтиленовых пакетах при температуре 0 - 4 °C не более суток. Для длительного хранения пробы замораживают и хранят в полиэтиленовой таре в морозильнике при температуре -18 °C до 2 лет.

Образец измельченного растительного материала массой 10 г помещают в полипропиленовую банку для экстракции объемом 250 см³, прибавляют туда 50 см³ смеси ацетонитрила с 0,1 М водным раствором соляной кислоты в соотношении 8:2 и помещают на аппарат для встряхивания проб на 30 мин. Экстракт фильтруют в концентратор объемом 250 см³ через фильтр средней плотности. Экстракцию повторяют еще два раза, используя каждый раз по 50 см³ смеси ацетонитрила с 0,1 н водным раствором соляной кислоты и помещая на 15 мин на аппарат для встряхивания проб. Экстракты фильтруют, объединяют в концентраторе объемом 250 см³ и выпаривают до водного остатка при температуре не выше 30 °C.

К водному остатку в концентраторе, полученному по п. 9.1.1, прибавляют 7 см³ 10 н водного раствора гидроокиси натрия, тщательно обмывая стенки концентратора, и переносят смыв в делительную воронку объемом 250 см³. В делительную воронку добавляют 3 г хлористого натрия и встряхивают воронку до полного растворения соли.

Пропамокарба гидрохлорид экстрагируют тремя порциями диэтилового эфира объемом по 50 см³, каждый раз встряхивая делительную воронку 2 мин. После полного разделения фаз в делительной воронке верхний слой (диэтиловый эфир) собирают в концентратор объемом 250 см³ через слой безводного сульфата натрия. Осушитель обмывают 10 см³ диэтилового эфира, объединяют смыв с основным экстрактом и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °C.

Далее проводят очистку пробы на концентрирующих патронах N 1.

Сухой остаток, полученный по п. 9.1.2, растворяют в 1 см³ ацетонитрила, тщательно обмывая стенки концентратора, прибавляют 10 см³ воды, перемешивают и вносят на заранее подготовленный концентрирующий патрон N 1, элюат отбрасывают. Исходную колбу обмывают 10 см³ смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1, вносят на патрон, элюат отбрасывают. Пропамокарба гидрохлорид элюируют с колонки 25 см³ смеси ацетонитрила с 0,1 М водным раствором соляной кислоты в соотношении 1:1, элюат собирают в концентратор объемом 100 см³ и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °C.

Сухой остаток растворяют в 4 см³ ацетона и 1 мм³ раствора вводят в хроматограф.

Хроматографическая система, включающая:

- хроматограф газовый с термоионным детектором (ТИД) с пределом детектирования по фосфору в Паратион-метиле 3 x 10^-14 г/см³ и снабженный приспособлениями для капиллярной колонки;

- компьютерное программное обеспечение, контролирующее работу всего прибора, обеспечивающее сбор и хранение всех хроматограмм в процессе проведения хроматографического анализа, обеспечивающее обработку результатов измерений, вывод и расчет хроматограмм и количественный анализ.

Колонка хроматографическая капиллярная из кварцевого стекла, с внутренний диаметром 0,53 мм, длиной 10 м, с неподвижной фазой, содержащей 5% дифенила и 95% диметилполисилоксана и толщиной пленки 2,65 мкм.

Температура термостата колонки программированная: начальная температура - 100 °C, выдержка 1 мин, нагрев колонки по 25 °C в минуту до 210 °C, выдержка 5 мин.

Продувка детектора после анализа азотом - 40 см³/мин в течение 3 мин. Нагрев колонки до 260 °C.

Температура испарителя - 200 °C, детектора - 300 °C.

Газ 1 - гелий (газ-носитель), давление на входе - 7 кПа, давление на выходе - 101,3 кПа, линейная скорость - 26,81 см/с, поток - 2,935 см³/мин. Мертвое время - 0,62 мин. Регулятор расхода Г1 - РРГ-10.

Газ 2 - гелий (сброс пробы), режим Splitless, расход во время анализа - 10 см³/мин, деление потока - 1:30, начало сброса - 40 с, длительность сброса - 2 мин. Регулятор расхода Г2 - РРГ-11.

Газ 4 - азот (поддув в детектор), расход во время анализа - 35 см³/мин.

Газ 5 - водород, расход во время анализа - 11,0 см³/мин.

Газ 6 - воздух, расход - 200 см³/мин.

Абсолютное время удерживания пропамокарба гидрохлорида: 5,44 +/- 2% мин.

Объем вводимой пробы: 1 мм³.

Линейный диапазон детектирования сохраняется в пределах 2,0 - 20,0 нг.

Содержание пропамокарба гидрохлорида в пробах лука-репки рассчитывают по формуле:

X - содержание пропамокарба гидрохлорида в пробе, мг/кг;

S_ст - высота (площадь) пика стандарта, мВ;

S_пр - высота (площадь) пика образца, мВ;

A - концентрация стандартного раствора, мкг/см³;

V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, см³;

m - масса анализируемого образца, г (см³);

P - содержание пропамокарба гидрохлорида в аналитическом стандарте, %.

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предел повторяемости:

X₁, X₂ - результаты параллельных определений, мг/кг;

r - значение предела повторяемости (табл. 1), при этом .

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

Результат анализа представляют в виде:

- среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

- граница абсолютной погрешности, мг/кг:

- граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

В случае если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание вещества в пробе менее 1,0 мг/кг". <*>

--------------------------------

<*> - 1,0 мг/кг - предел обнаружения.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений, а также контроль стабильности градуировочной характеристики осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-02 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

13.1. Контроль стабильности градуировочной характеристики.

Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

Контроль стабильности градуировочной характеристики для пропамокарба гидрохлорида проводят в начале и по окончании каждой серии анализов, а также при смене основных градуировочных растворов:

- N 1 - каждые 4 месяца;

- N 2, 3, 4, 5 и 6 - каждый месяц.

При контроле стабильности градуировочной характеристики проводят измерения не менее трех образцов концентраций для градуировки, содержание пропамокарба гидрохлорида в которых должно охватывать весь диапазон концентраций от 2,0 до 20,0 мкг/см³.

Градуировочная характеристика считается стабильной, если для каждого из используемого для контроля градуировочного раствора сохраняется соотношение:

X - концентрация пропамокарба гидрохлорида контрольного измерения, мкг/см³;

C - известная концентрация градуировочного раствора пропамокарба гидрохлорида в ацетоне, взятая для контроля стабильности градуировочной характеристики, мкг/см³;

6,99 - погрешность градуировочной характеристики, %.

Если величина расхождения (A) превышает 6,99%, делают вывод о невозможности применения градуировочной характеристики для дальнейших измерений. В этом случае выясняют и устраняют причины нестабильности градуировочной характеристики и повторяют контроль ее стабильности с использованием других градуировочных растворов пропамокарба гидрохлорида, предусмотренных МВИ. При повторном обнаружении нестабильности градуировочной характеристики определяют ее заново согласно п. 7.3.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом "добавок".

Величина добавки C_д должна удовлетворять условию:

- характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой соответственно) мг/кг, при этом:

- граница абсолютной погрешности, мг/кг:

- граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

Результат контроля процедуры К_к рассчитывают по формуле:

, , C_д - среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце и концентрация добавки соответственно, мг/кг.

Норматив контроля К рассчитывают по формуле:

Проводят сопоставление результата контроля процедуры (К_к) с нормативом контроля (К).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), не должно превышать предел воспроизводимости (R):

X₁, X₂ - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;

R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.