"МУК 4.1.2855-11. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств Пропиконазола в ягодах земляники и ягодных кустарников методом капиллярной газожидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 31.03.2011)

1. Разработаны Российским государственным аграрным университетом - МСХА им. К.А. Тимирязева, Учебно-научный консультационный центр "Агроэкология пестицидов и агрохимикатов" Минсельхоза России.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 28.12.2010 N 3).

3. Утверждены руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 31.03.2011.

4. Введены в действие с момента утверждения.

5. Введены впервые.

Свидетельство об аттестации методики от 01.12.2010 N 0060.29.11.10.

Настоящие методические указания устанавливают метод газожидкостной хроматографии для определения уровня остаточных количеств Пропиконазола в ягодах земляники и ягодных кустарников в диапазоне 0,025 - 0,25 мг/кг.

Название по ИЮПАК: (+/-)-1-[2-(2,4-дихлорфенил)-4-пропил-1,3-диоксолан-2-метил]-1H-1,2,4-триазол.

Структурная формула (не приводится).

Молекулярная масса: 342,2.

Агрегатное состояние: вязкая жидкость.

Цвет, запах: желтоватый.

Растворимость в воде: 100 мг/куб. дм (20 °C).

При 25 °C растворим в большинстве органических растворителей (этанол, ацетон, толуол), в гексане - 47 г/куб. дм.

Пропиконазол не существенно гидролизуется в щелочной и кислой средах.

Область применения: Пропиконазол - системный фунгицид широкого спектра действия. Он обладает высокой активностью против возбудителей мучнистой росы, пятнистостей и ржавчины.

Применяется с нормой расхода 0,125 кг д.в./га в посевах зерновых культур, 0,125 - 0,375 кг д.в./га в маточниках и питомниках смородины черной.

В России установлены следующие гигиенические нормативы:

- ДСД - 0,02 мг/кг массы человека;

- ОДК в почве - 0,2 мг/кг;

- ПДК в воздухе рабочей зоны - 0,5 мг/куб. м;

- ОБУВ в атмосферном воздухе - 0,01 мг/куб. м;

- ПДК в воде водоема - 0,15 мг/куб. дм;

- МДУ (мг/кг): в зерне хлебных злаков и в сахарной свекле - 0,1.

МДУ Пропиконазола (в импортируемой продукции): в ягодах земляники и ягодных кустарников - 0,05 мг/кг.

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций.

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительные интервалы среднего результата для полного диапазона концентраций (n = 20) приведены в табл. 2.

Метод основан на определении Пропиконазола методом капиллярной газожидкостной хроматографии с использованием детектора по захвату электронов после экстракции его из образцов ацетонитрилом и очистки экстракта перераспределением между двумя несмешивающимися растворителями.

Идентификация проводится по времени удерживания двух характерных пиков, а количественное определение - методом абсолютной калибровки по сумме двух характерных пиков.

В предлагаемых условиях анализа метод специфичен. Избирательность обеспечивается путем подбора капиллярной колонки и условий программирования температуры.

Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Допускается использование реактивов иных производителей с аналогичными или лучшими характеристиками.

Допускается применение хроматографических колонок и другого оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на газовый хроматограф.

4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 "Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны". Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004.

К выполнению измерений и обработке их результатов допускаются специалисты, имеющие высшее или специальное химическое образование, опыт работы в химической лаборатории, прошедшие обучение и владеющие техникой проведения анализа, освоившие метод анализа в процессе тренировки и уложившиеся в нормативы контроля при проведении процедуры контроля погрешности анализа.

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C, относительной влажности не более 80% и нормальном атмосферном давлении;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Выполнению измерений предшествуют следующие операции: очистка растворителей (при необходимости), приготовление растворов, кондиционирование хроматографической колонки, установление градуировочной характеристики.

Ацетонитрил, содержащий воду, предварительно осушают, добавляя в него гранулированный безводный хлористый кальций из расчета не менее 100 г/куб. дм. Выдерживают его над осушителем в течение 5 - 6 ч. Затем ацетонитрил сливают с осушителя в круглодонную колбу со шлифом объемом 4000 куб. см аппарата для перегонки растворителей.

Ацетонитрил перегоняют при температуре 81,5 °C, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше 81,5 °C, отбрасывают.

Ацетон помещают в круглодонную колбу со шлифом объемом 4000 куб. см от аппарата для перегонки растворителей, добавляют к нему марганцовокислый калий из расчета 1 г/куб. дм.

Ацетон перегоняют при температуре 56,2 °C, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше 56,2 °C, отбрасывают.

Дистиллят помещают в круглодонную колбу со шлифом объемом 4000 куб. см от аппарата для перегонки растворителей, добавляют к нему марганцовокислый калий из расчета 1 г/куб. дм и кипятят в течение 6 ч.

Собирают фракции, отогнанные при температуре 100,0 °C, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше 100,0 °C, отбрасывают.

7.2.1.1. Приготовление 50%-го водного раствора гидроокиси натрия.

50 г гидроокиси натрия переносят в мерную колбу на 100 куб. см, добавляют 50 - 60 куб. см дистиллированной воды. Затем раствор перемешивают и после охлаждения доводят водой объем в колбе до метки (при приготовлении раствора соблюдать осторожность и работать под тягой).

7.2.1.2. Приготовление 0,1 М раствора соляной кислоты.

Мерным цилиндром отбирают 8,2 куб. см концентрированной соляной кислоты и осторожно переносят в мерную колбу на 1000 куб. см, куда предварительно наливают около 400 куб. см дистиллированной воды. Затем раствор перемешивают и после охлаждения доводят водой объем в колбе до метки (при приготовлении раствора соблюдать осторожность и работать под тягой).

7.2.2.1. Стандартный раствор N 1 с концентрацией Пропиконазола 1 мг/куб. см.

Взвешивают 50 мг Пропиконазола в мерной колбе объемом 50 куб. см. Навеску растворяют в ацетоне и доводят объем до метки ацетоном. Полученный стандартный раствор N 1 используется для приготовления стандартных растворов для хроматографического исследования и установления градуировочной характеристики. Раствор хранится в холодильнике не более 120 суток.

7.2.2.2. Стандартный раствор N 2 с концентрацией Пропиконазола 10,0 мкг/куб. см.

Из стандартного раствора N 1 отбирают пипеткой 1 куб. см, помещают в мерную колбу объемом 100 куб. см и доводят объем до метки ацетоном. Стандартный раствор N 2 используется для приготовления стандартных растворов для установления градуировочной характеристики. Раствор хранится в холодильнике не более 60 суток.

7.2.2.3. Стандартный раствор N 3 с концентрацией Пропиконазола 1,0 мкг/куб. см.

Из стандартного раствора N 2 отбирают пипеткой 1 куб. см, помещают в мерную колбу объемом 10 куб. см и доводят объем до метки ацетоном. Стандартный раствор N 3 используется для приготовления стандартных растворов для установления градуировочной характеристики. Раствор хранится в холодильнике не более 60 суток.

7.2.2.4. Стандартный раствор N 4 с концентрацией Пропиконазола 0,5 мкг/куб. см.

Из стандартного раствора N 3 отбирают пипеткой 5 куб. см, помещают в мерную колбу объемом 10 куб. см и доводят объем до метки ацетоном. Стандартный раствор N 4 используется для установления градуировочной характеристики. Раствор хранится в холодильнике не более 30 суток.

7.2.2.5. Стандартный раствор N 5 с концентрацией Пропиконазола 0,2 мкг/куб. см.

Из стандартного раствора N 3 отбирают пипеткой 2 куб. см, помещают в мерную колбу объемом 10 куб. см и доводят объем до метки ацетоном. Стандартный раствор N 5 используется для установления градуировочной характеристики. Раствор хранится в холодильнике не более 30 суток.

7.2.2.6. Стандартный раствор N 6 с концентрацией Пропиконазола 0,1 мкг/куб. см.

Из стандартного раствора N 3 отбирают пипеткой 1 куб. см, помещают в мерную колбу объемом 10 куб. см и доводят объем до метки ацетоном. Стандартный раствор N 6 используется для установления градуировочной характеристики. Раствор хранится в холодильнике не более 30 суток.

7.2.2.7. Стандартный раствор N 7 с концентрацией Пропиконазола 0,05 мкг/куб. см.

Из стандартного раствора N 4 отбирают пипеткой 1 куб. см, помещают в мерную колбу объемом 10 куб. см и доводят объем до метки ацетоном. Стандартный раствор N 7 используется для установления градуировочной характеристики. Раствор хранится в холодильнике не более 30 суток.

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость суммы площадей (высоты) двух характерных пиков от концентрации Пропиконазола в растворе (мкг/куб. см), устанавливают методом абсолютной калибровки по 4 растворам для градуировки с концентрацией 0,05, 0,1, 0,2, 0,5 мкг/куб. см.

В испаритель хроматографа вводят по 1 куб. мм каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.2. Осуществляют не менее 5 параллельных измерений.

По полученным данным строят градуировочный график зависимости суммы площадей хроматографических пиков изомеров Пропиконазола в Hz от концентрации Пропиконазола в растворе в мкг/см.

Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" от 21.08.1979 N 2051-79, а также с ГОСТ 6828-89 "Земляника свежая. Требования при заготовках, поставках и реализации", ГОСТ 6829-89 "Смородина черная свежая. Требования при заготовках, поставках и реализации. ТУ".

Пробы ягод хранят в холодильнике в полиэтиленовых пакетах при температуре от 0 до 4 °C не более суток. Для длительного хранения пробы замораживают и хранят в морозильной камере при температуре -18 °C до 2 лет.

Образец измельченных ягод массой 10 г помещают в полипропиленовую банку для экстракции объемом 250 куб. см, добавляют 50 куб. см ацетонитрила и помещают на 30 мин. на аппарат для встряхивания проб. Экстракт фильтруют в концентратор объемом 250 куб. см через фильтр "красная лента". Экстракцию повторяют еще два раза, используя каждый раз по 30 куб. см ацетонитрила и помещая каждый раз на 30 мин. на аппарат для встряхивания проб. Экстракты объединяют в концентраторе объемом 250 куб. см и упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °C.

Сухой остаток, полученный в п. 9.1.1, растворяют в 50 куб. см 0,1 М раствора соляной кислоты и переносят в делительную воронку объемом 250 куб. см, доводят pH раствора при помощи 50%-го раствора гидроокиси натрия до значения 8 - 9. Пропиконазол экстрагируют тремя порциями хлороформа по 30 куб. см, каждый раз интенсивно встряхивая смесь в течение 2 мин. После разделения слоев нижний слой (хлороформ) собирают в концентратор объемом 250 куб. см, пропуская через слой безводного сульфата натрия. Объединенный экстракт упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °C.

Сухой остаток растворяют в 5 куб. см ацетона и 1 куб. мм пробы вводят в хроматограф.

Хроматограф газовый HP6890 Series GC System с детектором по захвату электронов (ЭЗД) в модификации с электронным управлением пневмонической системы (ЭУПС).

Колонка хроматографическая капиллярная кварцевая Rtx-1, (100% диметилполисилоксана), длина 30 м, внутренний диаметр 0,25 мм, толщина пленки 0,25 мкм.

Температура детектора - 300 °C, поток обдува анода (азот) - 6,0 куб. см/мин., поток поддува - 58,6 куб. см/мин.

Температура испарителя - 260 °C, тип газа гелий, режим Split, давление 24,89 psi, деление потока 20:1, split поток 28,5 куб. см/мин.

Программированный нагрев колонки с 200 °C (выдержка 1 мин.) по 2 град./мин. до 230 °C и с 230 °C (выдержка 1 мин.) по 10 град./мин. до 260 °C (выдержка 5 мин.), режим постоянное давление, поток колонки 1,4 куб. см/мин., средняя скорость 39 см/с.

Абсолютное время удерживания характерных пиков Пропиконазола: Пропиконазол 1 - 10,200 мин. +/- 3%; Пропиконазол 2 - 10,500 мин. +/- 3%.

Линейность детектирования сохраняется в пределах 0,05 - 0,5 нг.

Для обработки результатов хроматографического анализа используется программное обеспечение химического анализа HP GC ChemStation Rev. A.06.03RUS.

Альтернативная обработка результатов.

Содержание Пропиконазола рассчитывают по формуле:

A - концентрация стандартного раствора, мкг/куб. см;

V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, куб. см;

m - масса анализируемого образца, г;

P - содержание Пропиконазола в аналитическом стандарте, %.

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

Результат анализа представляют в виде:

где дельта - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

В случае, если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание вещества в пробе менее 0,025 мг/кг" <*>.

--------------------------------

<*> 0,025 мг/кг - предел обнаружения.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом добавок.

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):

R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

Российский государственный аграрный университет - МСХА им. К.А. Тимирязева.

Учебно-научный консультационный центр "Агроэкология пестицидов и агрохимикатов".

Методика прошла метрологическую экспертизу (Свидетельство об аттестации N 0060.29.11.10 от 01.12.2010 и внесена в Федеральный реестр (ФР.1.31.2011.09736).