"МУК 4.1.3077-13. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Измерение концентраций бифеназата в воздухе рабочей зоны и смывах с кожных покровов операторов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 24.07.2013)

1. Разработаны ФБУН "Федеральный научный центр гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана" Роспотребнадзора (Т.В. Юдина, Н.Е. Федорова, В.Н. Волкова, Л.П. Мухина).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 30 мая 2013 г. N 1).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 24 июля 2013 г.

4. Введены впервые.

Свидетельство об аттестации от 5.03.2013 N 01.00282-2008/0158.05.03.13.

Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения в воздухе рабочей зоны и смывах с кожных покровов операторов массовой концентрации бифеназата в диапазонах 0,05 - 1,0 мг/м³ и 0,3 - 6,0 мкг/смыв соответственно.

Методические указания носят рекомендательный характер.

Название действующего вещества по ИСО: бифеназат.

Название действующего вещества по ИЮПАК: Изопропил 3-(4-метоксибифенил-3-ил)карбазат.

Структурная формула:

Эмпирическая формула: C₁₇H₂₀N₂O₃.

Молекулярная масса: 300,4.

Белое кристаллическое вещество без запаха. Температура плавления 123 - 125 °C. Давление паров 3,8·10^-4 мПа (25 °C). Растворимость в органических растворителях (г/дм³, 20 °C): этилацетат - 102; ацетонитрил - 95,6; метанол - 44,7; толуол - 24,0; н-гексан - 0,232. Растворимость в воде при 20 °C - 2,06 мг/дм³. Коэффициент распределения в системе н-октанол-вода log K_ow = 3,4 (25 °C, pH 7).

Бифеназат стабилен более 1 года при температуре 20 °C и относительной влажности 50%. Подвергается гидролизу (при 25 °C): DT₅₀ составляет 9 - 10 дней (pH 4); 5,4 дня (pH 5); 0,8 дня (pH 7), 0,08 дня (pH 9), и фотолизу (25 °C, pH 5): DT₅₀ составляет 17 ч. Бифеназат - основание с pKa - 12,94 (23 °C).

Агрегатное состояние в воздушной среде - аэрозоль.

Бифеназат - несистемный акарицид класса бифенилгидразина с контактным действием и продолжительным последействием, рекомендуется к применению для борьбы с насекомыми на стадии яиц и личинок на плодовых деревьях (яблони, груши, цитрусовые), орехах, овощах, декоративных культурах, хлопке и кукурузе.

Методика обеспечивает выполнение измерений с погрешностью, не превышающей +/- 25%, при доверительной вероятности 0,95.

Измерения концентраций бифеназата выполняют методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на обращенной фазе с ультрафиолетовым детектором.

Концентрирование вещества из воздуха осуществляют на бумажный фильтр высокой плотности, экстракцию с фильтров выполняют смесью ацетонитрила с 1,25%-м раствором уксусной кислоты в присутствии аскорбиновой кислоты для предотвращения окисления соединения. Смыв с кожных покровов проводят этанолом. Для концентрирования проб смывов использованы патроны для твердофазной экстракции.

Нижний предел измерения в анализируемом объеме пробы - 2,5 нг. Средняя полнота извлечения с фильтров - 96%, с поверхности кожи - 84,2%.

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Примечание. Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией, не требующих дополнительной очистки растворителей.

Примечание. Допускается использование вспомогательных средств измерений, устройств и материалов с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ Р 12.1.019-09, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф.

4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и 2.2.5.2308-07. Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004-90.

К выполнению измерений допускают специалиста, прошедшего обучение, освоившего методику, владеющего техникой, имеющего опыт работы на жидкостном хроматографе, и подтвердившего соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 12.

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C и относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Выполнению измерений предшествуют следующие операции: очистка ацетонитрила (при необходимости), подготовка подвижной фазы для ВЭЖХ, смеси растворителей для экстракции и приготовления градуировочных растворов, смеси растворителей для элюирования вещества с патронов концентрирующих, кондиционирование хроматографической колонки, приготовление растворов для градуировки и внесения, установление градуировочной характеристики, подготовка фильтров и салфеток для отбора проб, отбор проб.

Ацетонитрил кипятят с обратным холодильником над пентоксидом фосфора (на 1 дм³ ацетонитрила 20 г пентоксида фосфора) не менее 1 ч, после чего перегоняют, непосредственно перед употреблением ацетонитрил повторно перегоняют над прокаленным карбонатом калия (на 1 дм³ ацетонитрила 10 г карбоната калия).

7.2.1. Приготовление раствора уксусной кислоты с массовой долей 1,25% (1,25%-й раствор). В мерную колбу вместимостью 1 000 см³ помещают 500 см³ бидистиллированной или деионизованной воды, вносят 12,5 см³ ледяной уксусной кислоты, доводят водой до метки, перемешивают.

7.2.2. Приготовление подвижной фазы. В мерную колбу вместимостью 1 000 см³ помещают 600 см³ ацетонитрила, добавляют 400 см³ 1,25%-го раствора уксусной кислоты, перемешивают, фильтруют через мембранный фильтр и дегазируют.

Подвижную фазу хранят в темном месте (в емкости из темного стекла) не более 14 дней.

Промывают колонку подвижной фазой (приготовленной по п. 7.2) при скорости подачи растворителя 0,8 см³/мин до установления стабильной базовой линии.

В мерную колбу вместимостью 1 000 см³ помещают 1 000 см³ подвижной фазы, приготовленной по п. 7.2, вносят 1,0 г аскорбиновой кислоты, перемешивают до полного растворения кислоты, фильтруют через мембранный фильтр. Срок хранения смеси не более суток.

7.5.1. Исходный раствор бифеназата для градуировки (концентрация 100 мкг/см³). В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 0,01 г бифеназата и растворяют в 50 - 60 см³ ацетонитрила, доводят ацетонитрилом до метки, тщательно перемешивают.

Раствор хранят в морозильной камере при температуре ниже -18 °C в течение 14 дней.

Растворы N 1 - 5 готовят объемным методом путем последовательного разбавления исходного раствора для градуировки.

7.5.2. Раствор N 1 бифеназата для градуировки и внесения (концентрация 10 мкг/см³). В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 10 см³ исходного раствора с концентрацией бифеназата 10 мкг/см³ (п. 7.5.1), разбавляют ацетонитрилом до метки.

Градуировочный раствор N 1 хранят в морозильной камере при температуре ниже -18 °C в течение 14 дней.

Этот раствор используют для приготовления проб с внесением при оценке полноты извлечения действующего вещества методом "внесено - найдено" и контроле качества результатов измерений методом "добавок".

7.5.3. Рабочие растворы N 2 - 5 бифеназата для градуировки (концентрации 0,05 - 1,0 мкг/см³). В 5 мерных колб вместимостью 100 см³ помещают по 0,5; 1,0; 2,0; 5,0 и 10,0 см³ градуировочного раствора N 1 с концентрацией 10 мкг/см³ (п. 7.5.2), доводят до метки смесью растворителей, приготовленной по п. 7.4, тщательно перемешивают, получают рабочие растворы N 2 - 5 с концентрацией бифеназата 0,05; 0,1; 0,2; 0,5 и 1,0 мкг/см³ соответственно.

Рабочие растворы хранят в холодильнике при температуре 4 - 6 °C не более 14 дней.

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади пика от концентрации бифеназата в растворе, устанавливают методом абсолютной калибровки по 5 растворам для градуировки N 2 - 6, приготовленным по п. 7.5.3.

В инжектор хроматографа вводят по 50 мм³ каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования, указанных ниже. Осуществляют не менее 5 параллельных измерений. Устанавливают площади пиков бифеназата, на основании которых строят градуировочную зависимость.

Измерения выполняют при следующих режимных параметрах.

Жидкостный хроматограф с быстросканирующим ультрафиолетовым детектором, снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки.

Хроматографическая колонка стальная, длиной 150 мм, внутренним диаметром 4,6 мм, заполненная обращенно-фазным сорбентом с привитыми монофункциональными полярными группами C18, зернением 5 мкм.

Рабочие длины волн: 270 и 235 нм <*>.

Температура колонки: 25 °C.

Подвижная фаза: ацетонитрил - 1,25%-й раствор уксусной кислоты (60:40, по объему).

Скорость потока элюента: 0,8 см³/мин.

Объем вводимой пробы: 50 мм³.

Линейный диапазон детектирования: 2,5 - 50 нг.

<*> Для достоверности идентификации бифеназата его детектирование возможно при длине волны 235 нм, поскольку в данной области интенсивность поглощения вещества ~ в 2 раза выше, чем при 270 нм. Соблюдение соотношения площадей пиков при этих волнах подтверждает наличие действующего вещества в пробе.

В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 90 см³ ацетонитрила, объем раствора в колбе доводят до метки 1,25%-й уксусной кислотой, вносят 0,05 г аскорбиновой кислоты, перемешивают до полного растворения осадка. Срок хранения смеси не более суток.

Диаметр бумажного фильтра высокой плотности должен соответствовать внутреннему диаметру фильтродержателя.

Фильтры последовательно по 3 раза промывают на воронке Бюхнера этанолом, затем ацетонитрилом порциями 25 - 30 см³, сушат с помощью разряжения, создаваемого водоструйным насосом, затем на воздухе при комнатной температуре. До использования фильтры хранят в герметично закрытой стеклянной таре.

Навеску (25 +/- 0,1) г натрия углекислого помещают в мерную колбу вместимостью 500 см³, растворяют в деионизированной воде, доводят водой до метки, перемешивают.

Вырезают салфетки (лоскуты) из белой бязи размером 10 x 10 см, затем их последовательно обрабатывают 5%-м раствором углекислого натрия (при кипячении), водой до нейтральной реакции промывных вод, 2-кратно промывают этиловым спиртом, сушат на воздухе при комнатной температуре. До использования салфетки хранят в герметично закрытой стеклянной таре.

Отбор проб осуществляют в соответствии с требованиями ГОСТ 12.1.005-88 "ССБТ. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны" и Р 2.2.2006-05 (прилож. 9, обязательное) "Общие методические требования к организации и проведению контроля содержания вредных веществ в воздухе рабочей зоны", п. 2 "Контроль соответствия максимальным ПДК".

Воздух с объемным расходом 2 - 5 дм³/мин аспирируют через бумажный фильтр высокой плотности, помещенный в фильтродержатель.

Для измерения концентрации вещества на уровне предела обнаружения (0,05 мг/м³) необходимо отобрать 10 дм³ воздуха.

Срок хранения отобранных проб, помещенных в полиэтиленовые пакеты, в морозильной камере при температуре ниже -18 °C не более 2 суток.

Смывы проводят в конце работы или после выполнения отдельных операций с открытых и закрытых спецодеждой или другими СИЗ участков тела (лоб, лицо, шея, грудь, предплечье, голень, кисти рук, включая межпальцевые промежутки).

До работы выбирают участок кожи, обрабатывают его для удаления загрязнений, фиксируют площадь (не менее 200 см²). При необходимости отбирают фоновые смывы.

Смыв выполняют способом обмыва фиксированного участка кожи этиловым спиртом, помещая 20 см³ в стеклянную емкостью с металлической крышкой. Тканевой салфеткой, смоченной растворителем, с помощью пинцета (индивидуально) обмывают этот участок сверху вниз. Операцию повторяют дважды.

Срок хранения отобранных проб смывов, помещенных в герметично закрытые емкости, в морозильной камере при температуре ниже -18 °C не более 7 дней.

Экспонированный бумажный фильтр переносят в химический стакан вместимостью 150 см³, заливают 10 см³ смеси ацетонитрил-1,25%-й раствор уксусной кислоты с внесением 0,1%-й аскорбиновой кислоты, приготовленной по п. 7.4, помещают на ультразвуковую баню на 5 мин. С помощью шприца отбирают около 2 см³ экстракта, фильтруют через мембранный фильтр и анализируют при условиях хроматографирования, указанных в п. 7.6. Срок хранения подготовленных для анализа образцов в холодильнике при температуре 4 - 6 °C 14 дней.

Пробу смыва сливают (через воронку) в мерный цилиндр вместимостью 25 см³ с пришлифованной пробкой, доводят объем до 20 см³ этанолом, перемешивают. С помощью пипетки отбирают 10 см³ пробы (1/2 часть), переносят в коническую колбу на 50 см³, вносят 30 см³ бидистиллированной или деионизованной воды, перемешивают и вносят на концентрирующий патрон.

Для этого патрон устанавливают на аллонж с прямым отводом для вакуума <*>. Сверху в патрон устанавливают медицинский шприц объемом не менее 10 см³, используемый в качестве емкости для элюента.

<*> В отсутствие специального аллонжа, жидкость продавливают через патрон с помощью шприца, скорость продавливания раствора не должна превышать 3 - 5 капель в секунду.

Подготовленную пробу вносят на концентрирующий патрон со скоростью пропускания раствора 3 - 5 см³/мин, используя разряжение, создаваемое водоструйным насосом. Высушивают патрон пропусканием воздуха (с использованием вакуума) в течение 2 мин. Бифеназат элюируют с патрона смесью растворителей, подготовленной по п. 7.7, собирая первые 2 см³ элюата в мерную пробирку с пришлифованной пробкой вместимостью 5 см³. Доводят объем в пробирке до 3 см³ бидистиллированной или деионизованной водой, перемешивают, фильтруют раствор через мембранный фильтр и анализируют при условиях хроматографирования, указанных в п. 7.6. Срок хранения подготовленных для анализа образцов в холодильнике при температуре 4 - 6 °C 14 дней.

Пробу вводят в испаритель хроматографа не менее двух раз. Устанавливают площадь пика бифеназата, с помощью градуировочного графика определяют концентрацию бифеназата в хроматографируемом растворе.

Образцы, дающие пики большие, чем градуировочный раствор с концентрацией 1,0 мкг/см³, разбавляют подвижной фазой (не более чем в 50 раз).

Концентрацию вещества в пробе воздуха (X), мг/м³, рассчитывают по формуле:

C - концентрация вещества в хроматографируемом растворе, найденная по градуировочному графику в соответствии с величиной площади хроматографического пика, мкг/см³;

W - объем экстракта, см³;

V_t - объем пробы воздуха, отобранный для анализа, приведенный к стандартным условиям (давление 760 мм рт. ст., температура 20 °C), дм³:

T - температура воздуха при отборе проб (на входе в аспиратор), °C;

P - атмосферное давление при отборе пробы, мм рт. ст.;

u - расход воздуха при отборе пробы, дм³/мин;

t - длительность отбора пробы, мин;

R - коэффициент, равный 0,386 для воздуха рабочей зоны.

Концентрацию вещества в пробе смыва X, мкг/смыв, рассчитывают по формуле:

C - концентрация вещества в хроматографируемом растворе, найденная по градуировочному графику в соответствии с величиной площади хроматографического пика, мкг/см³;

W - объем пробы, подготовленной для хроматографирования, см³;

K - коэффициент, учитывающий объем пробы смыва, взятый для анализа (равен 2).

Примечание. Идентификация и расчет концентрации вещества в пробах могут быть проведены с помощью компьютерной программы обработки хроматографических данных, включенной в аналитическую систему.

Результат количественного анализа представляют в виде:

- результат анализа в мг/м³ или мкг/смыв (с указанием площади смыва в см²), характеристика погрешности , % (табл.), P = 0,95 или

(мкг/смыв, площадь смыва, см²), P = 0,95, где

- среднее арифметическое параллельных измерений, мг/м³ (мкг/смыв);

- граница абсолютной погрешности, мг/м³ (мкг/смыв):

- граница относительной погрешности методики (показатель точности по диапазону концентраций, табл.), %.

Результат измерений должен иметь тот же десятичный разряд, что и погрешность.

Если содержание вещества менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание бифеназата в пробе воздуха рабочей зоны - менее 0,05 мг/м³; в пробе смыва - менее 0,3 мкг/смыв" <*>.

--------------------------------

<*> - 0,05 мг/м³; 0,3 мкг/смыв - пределы обнаружения при отборе 10 дм³ воздуха рабочей зоны; в пробе смыва (фиксированная площадь смыва, 200 см²) соответственно.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-(1-6)-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

- среднее значение массовой концентрации анализируемого компонента в пробе (мг/м³, мкг/смыв).

12.1. Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят в начале и по окончании каждой серии анализов.

При контроле стабильности градуировочной характеристики проводят измерения не менее трех образцов растворов для градуировки, содержание бифеназата в которых должно охватывать весь диапазон концентраций от 0,05 до 1,0 мкг/см³.

Градуировочная характеристика считается стабильной, если для каждого из используемого для контроля градуировочного раствора сохраняется соотношение:

X - концентрация бифеназата в растворе при контрольном измерении, мкг/см³;

C - известная концентрация градуировочного раствора бифеназата, взятая для контроля стабильности градуировочной характеристики, мкг/см³;

B - норматив контроля погрешности градуировочной характеристики, % (равен 10% при P = 0,95).

Если величина расхождения (A) превышает 10%, делают вывод о невозможности применения градуировочной характеристики для дальнейших измерений. В этом случае выясняют и устраняют причины нестабильности градуировочной характеристики и повторяют контроль ее стабильности с использованием других градуировочных растворов бифеназата, предусмотренных МВИ. При повторном обнаружении нестабильности градуировочной характеристики устанавливают ее заново согласно п. 7.6.

Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

12.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом "добавок".

Образцами для контроля являются реальные пробы воздушной среды и смывов с кожных покровов. Объем отобранных для контроля процедуры выполнения анализа проб воздуха и смывов с кожи должен соответствовать удвоенному объему, необходимому для проведения анализа по методике, фиксированная площадь смыва должна быть увеличена в 2 раза. После отбора проб экстракт с фильтра, а также пробу смыва делят на две равные части, первую из которых анализируют в точном соответствии с прописью методики и получают результат анализа исходной рабочей пробы - X. Во вторую часть делают добавку анализируемого компонента (C_д) и анализируют в точном соответствии с прописью методики, получая результат анализа рабочей пробы с добавкой - X'. Результаты анализа исходной рабочей пробы (X) и рабочей пробы с добавкой (X') получают в условиях повторяемости (один аналитик, использование одного набора мерной посуды, одной партии реактивов и т.д.).

Величина добавки C_д должна удовлетворять условию:

- характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой), мг/м³, мкг/смыв.

Допустимо характеристику погрешности результатов анализа при внедрении методики в лаборатории устанавливать на основе выражения с последующим уточнением по мере накопления информации, где - граница абсолютной погрешности, мг/м³, мкг/смыв:

- граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл.), %.

Контроль проводят путем сравнения результата контрольной процедуры К_к с нормативом контроля К.

Результат контрольной процедуры К_к рассчитывают по формуле:

, , C_д - среднее значение массовой концентрации анализируемого компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки соответственно (мг/м³, мкг/смыв).

Норматив оперативного контроля точности К рассчитывают по формуле:

Проводят сопоставление результата контрольной процедуры (К_к) с нормативом контроля (К).

Если результат контрольной процедуры удовлетворяет условию

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (1) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (1) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

12.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), не должно превышать предел воспроизводимости (R):

(воздух рабочей зоны);

(смывы);

, где X₁, X₂ - результаты измерений в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), мг/м³, мкг/смыв;

R - предел воспроизводимости (табл.), мг/м³, мкг/смыв.

Если выполняется условие (2), то воспроизводимость измерений считается удовлетворительной.

При превышении норматива контроля воспроизводимости эксперимент повторяют, при повторном превышении указанного норматива выясняют причины и по возможности их устраняют.