"МУК 4.1.3037-12. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Измерение массовых концентраций меди, цинка в желчи методом атомно-абсорбционной спектрометрии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 07.09.2012)

1. Разработаны Федеральным бюджетным учреждением науки Федеральный научный центр медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения" Роспотребнадзора (Т.С.Уланова, Н.В.Зайцева, Е.В.Стенно, Г.А.Вейхман, М.А.Баканина, Ю.В.Шардакова, Т.Д.Карнажицкая, А.В.Кислицина).

2. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г.Онищенко 7 сентября 2012 г.

3. Введены в действие с момента утверждения.

4. Введены впервые.

Свидетельство об аттестации от 30.11.2010 N 223.1.0239/01.00258/2010.

1.1. Настоящие методические указания устанавливают метод атомно-абсорбционной спектрометрии в пламени для определения в желчи массовой концентрации меди и цинка в диапазонах измерений в анализируемом растворе 0,05-0,5 мкг/см3 и 0,1-2,0 мкг/см3 соответственно. Методика может быть использована для определения более высоких концентраций элементов после разбавления минерализата.

1.2. Методические указания по определению массовых концентраций меди и цинка в желчи предназначены для использования органами и организациями Роспотребнадзора, а также лечебными и научными организациями, осуществляющими деятельность в области профпатологии и экологии человека, научно-исследовательскими институтами, занимающимися вопросами гигиены окружающей среды.

1.3. Методические указания разработаны с целью обеспечения контроля содержания металлов в биологических средах у населения, проживающего в районах с повышенным уровнем загрязнения окружающей среды.

1.4. Медь (Cu), атомная масса - 63,55.

Медь - розовый или красноватый металл. Тпл. - 1083 °С, Ткип. - 2543 °С, плотность - 8,93 г/см3. Растворим в HNO3 и горячей концентрированной H2SO4. Порошкообразная медь растворяется в 0,3%-м растворе HCI и желудочном соке [1].

Кратная токсикологическая характеристика

Относится ко 2-му классу опасности [1].

Гепатотоксичность меди и ее соединений связана со способностью повышать проницаемость мембран митохондрий [2].

Токсическая доза 200-250 мг/сут. [3].

1.5. Цинк (Zn), атомная масса - 65,37.

Цинк - голубовато-серебристый металл. Тпл. - 419,5 °С. Ткип. - 906,2 °С, плотность - 7,14 г/см3. Растворим в кислотах и щелочах [1].

Краткая токсикологическая характеристика

Относится к 3-му классу опасности [1].

Вдыхание паров цинка в течение 4-6 ч. при сварке или гальванизации может приводить к возникновению "цинковой лихорадки".

Вдыхание хлорида цинка может вызывать воспаление слизистых оболочек верхних дыхательных путей, отек легких [2].

Токсическая доза - 600 мг/день [3].

Методика обеспечивает выполнение измерений с погрешностью, не превышающей для меди +/- 16%, для цинка +/- 14% при доверительной вероятности 0,95, соответствует характеристикам, приведенным в табл. 1.

Измерения массовых концентраций меди и цинка выполняют методом атомно-абсорбционной спектрометрии, основанным на измерении величины поглощения света соответствующего длине волны исследуемого элемента в пламени.

Для измерения используется поглощение с длиной волны, соответствующей максимуму поглощения определяемого металла при прохождении через содержащий пары атомов металлов слой воздуха: меди - 324,8 нм, цинка - 213,9 нм [4].

Длительность выполнения анализа составляет около 4 ч., с учетом прогрева лампы, юстировки аппаратуры, приготовления градуировочных растворов, построения градуировочных характеристик.

Нижний предел измерения в анализируемом растворе для меди - 0,05 мкг/см3, для цинка - 0,1 мкг/см3.

Методика может быть использована для определения более высоких или низких концентраций элементов после разбавления или концентрирования минерализата.

Примечание. Допускается использование средств измерения иных производителей с аналогичными или лучшими характеристиками.

Примечание. Допускается использование реактивов иных производителей с более высокой квалификацией.

Примечание. Допускается применение оборудования и материалов иных производителей с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

5.1. При выполнении измерений массовых концентраций соблюдают требования противопожарной безопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.004-91, правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-2009, имеют средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83.

5.2. При работе необходимо соблюдать "Правила по технике безопасности и производственной санитарии при работе в химических лабораториях" [5] и "Правила устройства и безопасной эксплуатации сосудов, работающих под давлением" [6].

5.3. При работе с реактивами соблюдают требования безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими и легковоспламеняющимися веществами по ГОСТ 12.1.007-76 и ГОСТ 12.1.005-88. Помещение должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией.

5.4. При работе с биологическими средами необходимо соблюдать правила в соответствии с требованиями СП 1.3.2322-08 "Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней".

5.5. При выполнении измерений на приборе соблюдают правила, указанные в руководстве по правилам эксплуатации атомно-абсорбционного спектрофотометра.

5.6. Обучение и инструктаж по безопасности труда проводят в соответствии с ГОСТ 12.0.004-90.

К выполнению измерений и обработке их результатов допускают лиц, имеющих квалификацию не ниже инженера-химика с опытом работы на атомно-абсорбционном спектрофотометре и получивших удовлетворительные результаты при проведении проверки процедуры измерений. Операции по подготовке проб желчи к анализу может выполнять лаборант или техник, имеющий опыт работы в химической лаборатории.

К обслуживанию атомно-абсорбционного спектрометра допускают лиц, имеющих квалификацию не ниже инженера КИП и А, прошедших инструктаж по технике безопасности на рабочем месте и ознакомленных с правилами обслуживания атомно-абсорбционного спектрофотометра.

7.1. При подготовке к проведению измерений и приготовлении растворов соблюдают следующие условия:

- температура воздуха 15-25 °С;

- атмосферное давление 630-800 мм рт. ст.;

- влажность воздуха не более 80%.

7.2. Выполнение измерений на атомно-абсорбционных спектрофотометрах проводят в условиях, рекомендуемых технической документацией к прибору.

При подготовке к выполнению измерений проводят следующие работы: подготовка химически чистой и обеззараженной посуды, подготовка атомно-абсорбционного спектрофотометра к работе, приготовление деионизованной воды, приготовление 1%-й азотной кислоты (HNO3), приготовление градуировочных растворов, построение градуировочной характеристики.

Посуду моют в моющем средстве с добавлением 6%-го раствора перекиси водорода, многократно ополаскивают проточной водой, на сутки замачивают в растворе азотной кислоты, приготовленной в соотношении 1:5, а затем 2-3 раза ополаскивают бидистиллированной и 1-2 раза деионизованной водой. Посуду, которая использовалась для отбора и хранения биологических сред, перед мытьем дезинфицируют с применением дезинфицирующих средств.

Подготовку атомно-абсорбционного спектрофотометра к работе проводят в соответствии с инструкцией по эксплуатации.

Устанавливают необходимую для анализа спектральную лампу, прогревают не менее 20 мин. и после настройки прибора выводят на рабочий режим согласно инструкции. Для настройки прибора в качестве нулевого раствора используют 1%-й раствор азотной кислоты.

8.3.1. Основной раствор с содержанием определяемого металла 100 мкг/см3 (раствор готовят отдельно для каждого определяемого металла).

Раствор готовят из ГСО с массовой концентрацией ионов металла 1 мг/см3. В мерную колбу вместимостью 50 см3 вносят 5 см3 ГСО состава раствора ионов металла и доводят объем в колбе до метки 1%-м раствором азотной кислоты. Раствор устойчив в течение 1 месяца.

8.3.2. Рабочие растворы определяемых металлов (меди, цинка) с массовой концентрацией 5 мкг/см3.

Готовят из основного раствора с массовой концентрацией 100 мкг/см3. В мерную колбу вместимостью 100 см3 вносят 5 см3 основного раствора определяемого металла и доводят объем в колбе до метки 1%-м раствором азотной кислоты. Раствор устойчив в течение 3 дней.

8.3.3. Рабочие растворы определяемых металлов с массовой концентрацией 5 мкг/см3 используют для получения градуировочных растворов. Объем рабочего раствора согласно табл. 2, 3 вносят в мерную колбу на 100 см3 и доводят до метки 1%-м раствором азотной кислоты. Применяют свежеприготовленными.

8.3.4. Раствор азотной кислоты 1%-й.

Концентрированную азотную кислоту объемом 8 см3, плотностью 1,415 г/см3 смешивают с 512 см3 деионизованной воды.

Градуировочную характеристику устанавливают методом абсолютной градуировки на приготовленных градуировочных растворах металлов. Она выражает зависимость величины абсорбции от концентрации металла (мкг/см3). Градуировочную характеристику устанавливают по результатам измерений 4 серий по 4 концентрациям вещества в каждой серии.

Устанавливают начало отсчета, вводя в пламя 1%-й раствор азотной кислоты (нулевой раствор). Для построения градуировочной характеристики для каждого элемента измеряют абсорбцию градуировочных растворов в порядке возрастания концентрации определяемого элемента. Измерения повторяют дважды. По результатам измерений строят график зависимости средней величины атомного поглощения определяемого металла от его массовой концентрации в градуировочном растворе.

Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят через 5 проб в анализируемой серии измерений. Содержание металла определяют в градуировочном растворе, концентрация которого соответствует середине градуировочного интервала. Градуировка признается стабильной, если расхождение между известным значением массовой концентрации иона металла в растворе для градуировки и измеренным значением концентрации металла в этом растворе не превышает 5%:

С - измеренное значение массовой концентрации металла в растворе для градуировки, мкг/см3;

- известное значение массовой концентрации металла в растворе для градуировки, мкг/см3.

Отбор проб желчи производят из дуоденального содержимого при зондировании. Пробы для анализа на металлы объемом не менее 5 см3 отбирают в химически чистые, обеззараженные пробирки из полипропилена вместимостью 15 см3 с винтовыми крышками. Пробы помещают в морозильную камеру. Возможно хранение проб в холодильнике (от 0 до 4 °С) до 3 суток или длительное хранение при замораживании.

Замороженные пробы слегка размораживают и тщательно перемешивают стеклянной палочкой в целях гомогенизации исходного материала. Гомогенизированную пробу полностью размораживают, для минерализации отбирают 1 см3 желчи в химически чистую мерную пробирку, добавляют 1 см3 концентрированной азотной кислоты, выдерживают 15-20 мин., затем 5 мин. в пробирочном электронагревателе при температуре 120-130 °С. Полученную смесь оставляют на 2,5-3,0 ч. при комнатной температуре, добавляют 1 см3 концентрированной перекиси водорода, подогревают в пробирочном электронагревателе 5-10 мин. при температуре 120-130 °С. Объем пробы желчи для минерализации можно увеличить до 2 см3, увеличивая объемы азотной кислоты и перекиси водорода также до 2 см3. Полученный раствор охлаждают.

Для каждой серии анализов ставят 2 холостые пробы, повторяя процедуру подготовки проб желчи. Для этого используют чистые пробирки из той же серии посуды, которая используется для анализа, и добавляют реактивы, как и в анализируемых пробах. Желчь в холостой пробе заменяют деионизованной водой.

Объемы полученных растворов проб желчи и холостой пробы доводят до 5-6 см3 (при отборе 1 см3 желчи) деионизованной водой и направляют на измерение на атомно-абсорбционном спектрометре.

Измерение холостых проб проводят вместе с подготовленными пробами желчи. Среднее значение концентрации холостой пробы учитывают в формуле расчета анализа каждой пробы (п. 10).

Подготовку проб к анализу проводят в вытяжном шкафу.

9.1. Подготовленные к анализу растворы проб желчи (минерализаты) и холостые пробы анализируют на атомно-абсорбционном спектрофотометре для определения исследуемого металла (меди или цинка).

9.2. Спектральную лампу устанавливают в прибор и прогревают не менее 20 мин. Устанавливают монохроматор на нужную длину волны, выбирают ширину спектральной щели, ставят на распыление деионизованную воду, подбирают необходимое соотношение газов (ацетилен-воздух) для поддержания горения и поджигают пламя.

Капилляр, подающий раствор в пламя опускают в 1%-й раствор азотной кислоты и определяют нулевую линию.

9.3. Распыляют в пламя градуировочные растворы определяемого металла для построения градуировочной характеристики, затем вводят пробы и регистрируют значения концентраций исследуемых проб. Точность настройки прибора проверяют введением раствора заданной концентрации через каждые пять проб, в случае необходимости повторяют процедуру построения градуировочной характеристики. При высоком содержании определяемого компонента аликвоту пробы разбавляют 1 %-м раствором азотной кислоты, коэффициент разбавления учитывают при расчете результата анализа.

10.1. Массовую концентрацию определяемого металла в желчи рассчитывают по формуле:

С - массовая концентрация металла в пробе, мкг/см3;

а - массовая концентрация металла в растворе пробы, определяемая по градуировочной характеристике, мкг/см3;

xn - массовая концентрация металла в растворе холостой пробы, мкг/см3;

k - коэффициент разбавления;

V - объем раствора минерализованной пробы, см3;

V'-объем пробы желчи, взятой для анализа, см3.

10.2. За результат измерения принимают среднее арифметическое значение двух параллельных определений , , для которых выполняется условие:

r - предел повторяемости.

Значения предела повторяемости приведены в табл. 4.

При невыполнении условия (1) получают дополнительно еще два результата измерений. За результат измерений принимают среднее арифметическое четырех результатов измерений, полученных в условиях повторяемости, для которых выполняется условие:

- критический диапазон.

Значения критического диапазона приведены в табл. 4.

При невыполнении условия (2) в качестве окончательного результата измерений принимают медиану четырех результатов измерений, полученных в условиях повторяемости (параллельных определений).

Дополнительно выявляют и устраняют причины, приводящие к невыполнению условия (1).

10.3. Расхождение между результатами измерений не должно превышать предел воспроизводимости:

и - результаты измерений массовых концентраций металлов, полученные в разных лабораториях - средние арифметические двух результатов измерений, полученных в условиях повторяемости, для которых выполняется условие (1), мкг/см3;

R - значение предела воспроизводимости, приведенное в табл. 4.

При выполнении условия (3) приемлемы оба результата измерений, в качестве окончательного может быть использовано их среднее арифметическое значение. Значения предела воспроизводимости приведены в табл. 4.

Результат измерений представляют в виде , где:

- характеристика погрешности, мкг/см3, при Р = 0,95, значение рассчитывают по формуле:

значение приведено в табл. 1.

Примечание. При представлении результата измерений в документах, выдаваемых лабораторией, указывают:

- количество результатов параллельных определений, использованных для расчета результата измерений;

- способ определения результата измерений (среднее арифметическое значение или медиана результатов параллельных определений).

Контроль стабильности результатов измерений в пределах лаборатории организуют и проводят в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002 и РМГ 76-2004 ГСИ.

Периодичность получения результатов контрольных процедур и формы их регистрации приводят в документах лаборатории, устанавливающих порядок и содержание работ по организации методов контроля стабильности результатов измерений в пределах лаборатории.

Оперативный контроль процедуры измерений проводят путем сравнения результата отдельно взятой контрольной процедуры с нормативом контроля К.

Результат контрольной процедуры рассчитывают по формуле:

- результат измерений массовой концентрации металла в пробе с известной добавкой - среднее арифметическое двух результатов измерений, полученных в условиях повторяемости, расхождение между которыми удовлетворяет условию (1), мкг/см3;

- результат измерений массовой концентрации металла в исходной пробе - среднее арифметическое двух результатов измерений, полученных в условиях повторяемости, расхождение между которыми удовлетворяет условию (1), мкг/см3;

- величина введенной добавки, мкг/см3.

Норматив контроля К рассчитывают по формуле:

- значения характеристики погрешности результатов измерений, установленные в лаборатории при реализации методики, соответствующие массовой концентрации металла в пробе с известной добавкой и в исходной пробе соответственно, мкг/см3.

Примечание. Допустимо характеристику погрешности результатов измерений при внедрении методики в лаборатории устанавливать на основе выражения: с последующим уточнением по мере накопления информации в процессе контроля стабильности результатов измерений.

Процедуру измерений признают удовлетворительной при выполнении условия:

При невыполнении условия (4) контрольную процедуру повторяют. При повторном невыполнении условия (4) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

Контрольные процедуры при контроле внутрилабораторной (промежуточной) прецизионности получают с использованием рабочих проб желчи. При реализации контрольной процедуры получают два результата контрольных измерений (первичного , и повторного ) массовой концентрации металла в условиях внутрилабораторной прецизионности.

Результат контрольной процедуры признают удовлетворительным при выполнении следующего условия:

Значения предела внутрилабораторной прецизионности приведены в табл. 5.

Уланова Т.С., Зайцева Н.В., Стенно Е.В., Вейхман Г.А., Баканина М.А., Шардакова Ю.В. (ФБУН "Федеральный научный центр медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения" Роспотребнадзора).

1. Вредные вещества в промышленности: Справочник для химиков, инженеров и врачей/Под ред. Н.В.Лазарева и И.Д.Гадаскиной, Л.: "Химия", 1977. Т. III. С. 350, 444, 507.

2. Элленхорн М.Дж. Медицинская токсикология: диагностика и лечение. М.: Медицина. 2003. Т. 2.

3. Скальный А.В., Рудаков И.А. Биоэлементы в медицине. М.: "Мир", 2004. С. 92, 97, 98.

4. Ермаченко Л.А. Атомно-абсорбционный анализ в санитарно-гигиенических исследованиях: Методическое пособие. М., 1997. 207 с.

5. "Правила по технике безопасности и производственной санитарии при работе в химических лабораториях". Утверждены МЗ СССР 20.12.82. М., 1981.

6. "Правила устройства и безопасной эксплуатации сосудов, работающих под давлением". Утверждены Госгортехнадзором СССР 27.11.87. М.: Недра, 1989.

В настоящих методических указаниях использованы ссылки на следующие документы.

ГОСТ Р 52501-2005 "Вода для лабораторного анализа. Технические условия".

ГОСТ 1770-74 "Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Технические условия".

ГОСТ 7328-01 "Гири. Общие технические условия".

ГОСТ 25336-82 "Посуда и оборудование лабораторное стеклянное. Типы, основные параметры и размеры".

ГОСТ 29227-91 "Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные". Ч. 1. Общие требования.

ГОСТ 12.1.004-91 "ССБТ. Пожарная безопасность. Общие требования".

ГОСТ 12.1.005-88 "ССБТ. Общие санаторно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны".

ГОСТ 12.0.004-90 "ССБТ. Организация обучения безопасности труда. Общие положения".

ГОСТ 12.1.007-76 "ССБТ. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности".

ГОСТ 12.1.019-09 "ССБТ. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты".

ГОСТ 12.4.009-83 "ССБТ. Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание".

СП 1.3.2322-08 "Санитарно-эпидемиологические правила "Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней".

ГОСТ 949-73 "Баллоны стальные малого и среднего объема для газов".

ГОСТ 11125-84 "Реактивы. Кислота азотная. Технические условия".

ГОСТ 5457-75 "Ацетилен растворенный и газообразный технический. Технические условия".

ГОСТ 177-88 "Водорода перекись. Технические условия".

ГОСТ Р 53228-2008 "Весы неавтоматического действия. Ч. 1. Метрологические и технические требования. Испытания".

ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

РМГ 76-2004 ГСИ "Внутренний контроль качества результатов количественного химического анализа".

ТУ 2605-463-76 "Редуктор ацетиленовый".

ТУ 25-11.1592-81 "Бидистиллятор стеклянный БС".

ТУ 25-11.1630-84 "Шкаф вытяжной химический".

ТУ 64-2-300 "Пробирки из полипропилена с винтовыми крышками".

Примечание. При использовании настоящих методических указаний целесообразно проверить действие ссылочных стандартов на территории Российской Федерации по соответствующему указателю стандартов, составленному на 1 января текущего года, и по соответствующим информационным указателям, опубликованным в текущем году. Если ссылочный документ заменен (изменен), то при пользовании настоящими методическими указаниями следует руководствоваться замененным (измененным) стандартом. Если ссылочный документ отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.