"МУК 4.1.2907-11. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств прогексадиона-кальция в воде, почве, плодах и соке яблок методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 12.07.2011)

1. Разработаны сотрудниками ГНУ Всероссийского НИИ защиты растений Россельхозакадемии.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 02.06.2011 N 1).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 12 июля 2011 г.

4. Введены в действие с момента утверждения.

5. Введены впервые.

Настоящий документ устанавливает методику определения остаточных количеств прогексадиона-кальция в воде в диапазоне концентраций 0,001 - 0,01 мг/куб. дм, в почве, в плодах и соке яблок в диапазоне концентраций 0,01 - 0,1 мг/кг.

Действующее вещество: прогексадион-кальций.

Структурная формула (не приводится).

Кальция 3-оксидо-5-оксо-4-пропионилциклогекса-3-енкарбоксилат (IUPAC).

Молекулярная масса: 250,3.

Область применения: регулятор роста растений. Используется в качестве средства от полегания мелкозерновых злаков. Также может быть использован как замедлитель роста дерна, земляных орехов и цветов или для ингибирования удлинения новых побегов фруктовых деревьев.

В России для прогексадиона-кальция гигиенические нормативы не установлены.

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1, для соответствующих диапазонов концентраций.

Методика основана на определении прогексадиона-кальция по свободной кислоте прогексадиону методом ВЭЖХ с использованием УФ-детектора после его твердофазной экстракции из воды или жидкостной экстракции из твердых образцов и яблочного сока с последующей очисткой экстрактов на концентрирующих патронах, заполненных силикагелем.

Идентификация прогексадиона проводится по времени удерживания, количественное определение - методом абсолютной калибровки.

Избирательность метода обеспечивается сочетанием условий подготовки проб и хроматографирования.

Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Допускается использование реактивов квалификации не ниже указанной.

Допускается использование другого вспомогательного оборудования с техническими характеристиками не хуже указанных.

4.1. При проведении работы необходимо соблюдать требования техники безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими, легковоспламеняющимися веществами (ГОСТ 12.1.005, 12.1.007). Организация обучения работников безопасности труда по ГОСТ 12.0.004.

При выполнении измерений с использованием жидкостного хроматографа и работе с электроустановками соблюдать правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 и инструкциями по эксплуатации приборов.

4.2. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией, соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 "Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны".

Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист-химик, имеющий опыт работы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, ознакомленный с руководством по эксплуатации хроматографа, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 13.

При выполнении измерений выполняют следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C и относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Перед началом анализа колонку (Acquity BEH C18) кондиционируют в потоке подвижной фазы (0,1 - 0,2 куб. см/мин.) до стабилизации нулевой линии.

7.2.1. Приготовление 0,05%-го раствора трифторуксусной кислоты: в мерную колбу вместимостью 1 куб. дм помещают 200 куб. см воды для ВЭЖХ, прибавляют 0,5 куб. см трифторуксусной кислоты и доводят объем до метки водой для ВЭЖХ.

7.2.2. Приготовление подвижной фазы: в мерную колбу вместимостью 1 куб. дм помещают 250 куб. см ацетонитрила и доводят объем до метки раствором 0,05% трифторуксусной кислоты.

7.2.3. Приготовление 1 М раствора серной кислоты: в мерную колбу вместимостью 1000 куб. см помещают 900 куб. см воды, прибавляют 56,5 куб. см концентрированной серной кислоты, осторожно перемешивают и доводят объем до метки водой.

7.3.1. Основной раствор с концентрацией 0,1 мг/куб. см: точную навеску прогексадиона (10 +/- 0,1) мг помещают в мерную колбу вместимостью 100 куб. см, растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки тем же растворителем.

Градуировочные растворы с концентрациями 0,1, 0,2, 0,5, 0,75 и 1,0 мкг/куб. см готовят методом последовательного разбавления по объему, используя раствор подвижной фазы.

7.3.2. Раствор N 1 с концентрацией 1,0 мкг/куб. см: в мерную колбу вместимостью 100 куб. см вносят 1 куб. см основного раствора и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.3.3. Раствор N 2 с концентрацией 0,75 мкг/куб. см: в мерную колбу вместимостью 10 куб. см вносят 7,5 куб. см раствора N 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.3.4. Раствор N 3 с концентрацией 0,5 мкг/куб. см: в мерную колбу вместимостью 10 куб. см помещают 5,0 куб. см раствора N 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.3.5. Раствор N 4 с концентрацией 0,2 мкг/куб. см: в мерную колбу вместимостью 10 куб. см помещают 2,0 куб. см раствора N 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.3.6. Раствор N 5 с концентрацией 0,1 мкг/куб. см: в мерную колбу вместимостью 10 куб. см помещают 1,0 куб. см раствора N 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

Основной раствор можно хранить в холодильнике при температуре 0 - 4 °C в течение 1 недели, градуировочные растворы - в течение суток.

При изучении полноты определения для внесения в матрицу используют ацетонитрильные растворы прогексадиона с концентрациями 1,0 и 10,0 мкг/куб. см, которые готовят из основного стандартного раствора (п. 7.3.1) с концентрацией 0,1 мг/куб. см методом последовательного разбавления ацетонитрилом.

В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 1 куб. см трифторуксусной кислоты и доводят объем до метки метанолом.

Для установления градуировочной характеристики (площадь пика - концентрация прогексадиона в растворе) в хроматограф вводят по 10 куб. мм градуировочных растворов (не менее 3 параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4 точек по диапазону измеряемых концентраций). Затем измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации прогексадиона в градуировочном растворе.

Методом наименьших квадратов рассчитывают градуировочный коэффициент (K) в уравнении линейной регрессии:

где S - площадь пика градуировочного раствора.

Градуировку признают удовлетворительной, если значение коэффициента линейной корреляции оказывается не ниже 0,99.

Градуировочную характеристику необходимо проверять при замене реактивов, хроматографической колонки или элементов хроматографической системы, а также при отрицательном результате контроля градуировочного коэффициента.

Градуировочную зависимость признают стабильной при выполнении следующего условия:

7.4.1. Подготовка патронов Диапак С16. Непосредственно перед употреблением через патрон последовательно пропускают по 2 куб. см ацетонитрила и воды.

7.4.2. Подготовка патронов, заполненных силикагелем. Непосредственно перед употреблением через патрон пропускают 2,5 куб. см дихлорметана.

Отбор проб производится в соответствии с ГОСТ 29168-89 "Почвы. Отбор проб", ГОСТ Р 51592-2000 "Вода. Общие требования к отбору проб". Для длительного хранения пробы почвы подсушивают при комнатной температуре в отсутствие прямого солнечного света. Сухие почвенные образцы могут храниться в течение года. Перед анализом сухую почву доводят до стандартной влажности, просеивают через сито с отверстиями 1 мм.

Отбор проб яблок производится в соответствии с ГОСТ 27572-87 "Яблоки свежие для промышленной переработки". Пробы яблок хранят в морозильной камере при температуре не выше -18 °C в течение 10 месяцев. Перед анализом пробы яблок гомогенизируют. Пробы яблочного сока хранят до анализа в морозильной камере при температуре не выше -18 °C в течение месяца, в холодильнике при температуре 0 - 4 °C в герметичной упаковке в течение недели.

К 50 куб. см воды прибавляют 25 куб. мм трифторуксусной кислоты и пропускают через патрон Диапак С16. Фильтрат отбрасывают. Прогексадион элюируют 3 куб. см ацетонитрила. Элюат упаривают досуха на вакуумном ротационном испарителе при температуре бани не выше 40 °C. Сухой остаток растворяют в 0,5 куб. см подвижной фазы. Вводят в хроматограф 10 куб. мм полученного раствора.

К (20 +/- 0,1) г сока прибавляют 10 куб. мм трифторуксусной кислоты и 30 куб. см воды. Полученный раствор фильтруют на воронке Бюхнера через бумажный фильтр ("красная лента"). Фильтрат помещают в делительную воронку на 250 куб. см и промывают дважды порциями по 25 куб. см гексана, встряхивая воронку каждый раз в течение 1 - 2 мин. Верхний органический слой отбрасывают. Прогексадион экстрагируют тремя порциями по 25 куб. см дихлорметана, встряхивая воронку каждый раз по 2 мин. и собирая нижний органический слой. Объединенный экстракт фильтруют через слой безводного натрия сернокислого в колбу-концентратор и упаривают до объема 2 куб. см на вакуумном ротационном испарителе при температуре водяной бани не выше 40 °C. Остаток количественно переносят в откондиционированный патрон, заполненный силикагелем. Фильтрат отбрасывают. Патрон промывают 2 куб. см смеси метанол-метилен хлористый в соотношении 50:50. Прогексадион элюируют 2 куб. см 1%-го раствора трифторуксусной кислоты в метаноле, приготовленного по п. 7.4. Элюат упаривают досуха. Сухой остаток растворяют в 2 куб. см подвижной фазы и 10 куб. мм полученного раствора вводят в хроматограф.

В коническую колбу вместимостью 250 куб. см помещают (10 +/- 0,1) г образца и экстрагируют 50 куб. см смеси метанола с 1 М серной кислотой в соотношении 9:1 в ультразвуковой бане в течение 15 мин. Массу фильтруют на воронке Бюхнера через бумажный фильтр "красная лента". Экстракцию повторяют. Объединенный экстракт упаривают на вакуумном ротационном испарителе при температуре водяной бани не выше 40 °C до полного удаления метанола. Объем водного остатка доводят до 50 куб. см. Дальнейшую обработку проводят по п. 9.2, начиная с процедуры промывки пробы в делительной воронке двумя порциями гексана по 25 куб. см. Сухой остаток, полученный на последней стадии, растворяют в 1 куб. см подвижной фазы и 10 куб. мм полученного раствора вводят в хроматограф.

Ультраэффективный жидкостный хроматограф "ACQUITY" фирмы Waters с быстросканирующим УФ-детектором, снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки. Аналитическая колонка ACQUITY UPLC BEH C18 (2,1 x 100) мм, 1,7 мкм (Waters). Температура колонки (30 +/- 1) °C. Подвижная фаза: смесь ацетонитрила и 0,05% трифторуксусной кислоты в соотношении 25:75. Скорость потока элюента: 0,2 куб. см/мин. Рабочая длина волны УФ-детектора 270 нм. Объем вводимой пробы 10 куб. мм.

Время удерживания прогексадиона (4,4 +/- 0,1) мин.

Линейный диапазон детектирования сохраняется в интервале концентраций 0,1 - 1,0 мкг/куб. см.

Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки. Содержание прогексадиона-кальция в воде (мг/куб. дм), почве, плодах и соке яблок X (мг/кг) вычисляют по формуле:

Содержание остаточных количеств прогексадиона-кальция в образце вычисляют как среднее из двух параллельных определений.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор прогексадиона с концентрацией 1,0 мкг/куб. см, разбавляют подвижной фазой для ВЭЖХ.

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт защиты растений Россельхозакадемии, Санкт-Петербург.

Методика прошла метрологическую экспертизу (Свидетельство об аттестации N 01.5.04.694) и внесена в Федеральный реестр МВИ (ФР.1.31.2011.09109).