"МУК 4.1.3060-13. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Измерение остаточного содержания флуопиколида в семенах и масле рапса методом капиллярной газожидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 14.07.2013)

1. Разработаны сотрудниками ГНУ Всероссийского НИИ фитопатологии.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 30 мая 2013 г. N 1).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 14 июля 2013 г.

4. Введены впервые.

Свидетельство о метрологической аттестации от 14.12.2012 N 01.00225/205-80-12.

Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода капиллярной газожидкостной хроматографии для определения массовых концентраций флуопиколида в семенах и масле рапса в диапазоне 0,01 - 0,10 мг/кг.

Методические указания носят рекомендательный характер.

Флуопиколид

2,6-дихлор-N-[3-хлор-5-(трифторметил)-2-пиридилметил]бензамид

Эмпирическая формула: .

Молекулярная масса: 383,6.

Бежевое твердое вещество со слабым фенольным запахом. Температура плавления: (150) °C. Давление паров при 20 °C: мПа. Коэффициент распределения н-октанол/вода: . Растворимость (г/куб. дм) при 20 °C: ацетон - 74,7, этилацетат - 37,7, дихлорметан - 126, этанол - 19,2, н-гексан - 0,2; растворимость в воде - 0,0028.

Вещество стабильно при хранении на воздухе, а также в кислой и щелочной средах.

В присутствии света в водных фотолитических условиях флуопиколид достаточно устойчив с периодом полураспада 64,2 дня.

Краткая токсикологическая характеристика.

Острая пероральная токсичность для крыс - более 5000 мг/кг; острая дермальная токсичность для крыс - более 5000 мг/кг; острая ингаляционная токсичность для крыс - более 5160 мг/куб. м воздуха.

Флуопиколид не оказывает раздражающего действия на кожу и слизистую оболочку глаз, не обладает эмбриотоксическим или тератогенным действием. Для рыб - 0,75 мг/куб. дм (96 ч). Фунгицид нетоксичен для птиц, пчел, дождевых червей, дафний и почвенных микроорганизмов.

Область применения препарата.

Флуопиколид - контактно-системный фунгицид, проявляющий активность против грибов классов Оомицеты и Аскомицеты. Тормозит прорастание зооспор и конидий, подавляет спорообразование и развитие мицелия грибов в тканях растений.

Применяется в России в качестве фунгицида системного действия в составе смесевых препаратов для обработки посадок картофеля против фитофтороза при норме расхода 75 - 100 г д.в./га и четырехкратной обработке за сезон.

Проходит регистрационные испытания в Российской Федерации в качестве фунгицида в составе инсектофунгицидного протравителя семян рапса с нормой расхода 1,8 - 2,0 кг д.в./т.

При соблюдении всех регламентированных условий и проведении анализа в точном соответствии с данной методикой значение погрешности (и ее составляющих) результатов измерений не превышает значений, приведенных в табл. 1.

Метод основан на экстракции флуопиколида из семян и масла рапса водным раствором метанола, очистке экстрактов, содержащих флуопиколид, от коэкстрактивных компонентов перераспределением в системе несмешивающихся растворителей и на колонке с силикагелем, разделении компонентов очищенных экстрактов методом капиллярной газожидкостной хроматографии (ГЖХ) при программировании температуры с последующим измерением содержания флуопиколида с использованием электронозахватного детектора (ЭЗД) и обработкой хроматограмм методом абсолютной градуировки.

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Примечание. Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией.

Примечание. Допускается использование других вспомогательных средств измерений и устройств аналогичного назначения, технические характеристики которых не уступают вышеуказанным, а также материалов, обеспечивающих нормативы точности при проведении измерений.

5.1. При работе с реактивами соблюдают требования безопасности, установленные для работы с токсичными, едкими и легковоспламеняющимися веществами по ГОСТ 12.1.007-76, ГОСТ 12.1.005-88.

5.2. При проведении анализов горючих и вредных веществ соблюдают требования противопожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91, должны быть в наличии средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-90. Обучение работающих правилам безопасности труда проводят согласно ГОСТ 12.0.004-90.

5.3. При выполнении измерений с использованием хроматографа соблюдают правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 и инструкцией по эксплуатации прибора.

5.4. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией. Содержание вредных веществ в воздухе рабочей зоны не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и 2.2.5.2308-07.

К выполнению измерений и обработке их результатов допускается специалист, прошедший обучение, имеющий опыт работы в лаборатории и владеющий техникой проведения хроматографического анализа, освоивший данную методику и подтвердивший соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений.

При выполнении измерений соблюдают следующие условия.

Измерениям предшествуют следующие операции: очистка органических растворителей (при необходимости), приготовление градуировочных растворов, кондиционирование хроматографической колонки, градуировка хроматографа, подготовка колонки с силикагелем.

Растворитель последовательно промывают порциями концентрированной серной кислоты до прекращения окрашивания последней в желтый цвет, затем водой до нейтральной реакции промывных вод, перегоняют над поташом.

Приготовление раствора натрия углекислого с массовой долей 5%.

Навеску (5 +/- 0,1) г натрия углекислого в конической колбе растворяют в 40 - 60 куб. см деионизованной воды. Полученный раствор переносят в мерную колбу вместимостью 100 куб. см и доводят объем раствора до метки деионизованной водой.

Срок хранения раствора - 1 неделя.

Этилацетат промывают последовательно раствором натрия углекислого с массовой долей 5%, насыщенным раствором хлористого кальция, сушат над безводным карбонатом калия и перегоняют. Срок хранения - 1 неделя.

Капиллярную кварцевую колонку устанавливают в термостат хроматографа и, не подсоединяя к детектору, кондиционируют при температуре 280 °C и скорости газа-носителя 2 куб. см/мин. в течение 8 - 10 ч.

В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают (0,010 +/- 0,0001) г флуопиколида, растворяют в (40 - 50) куб. см ацетона, доводят этим же растворителем объем до метки, тщательно перемешивают.

Раствор хранят в морозильной камере при температуре не выше -18 °C не более 3 месяцев.

В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 1 куб. см исходного градуировочного раствора флуопиколида с массовой концентрацией 100 мкг/куб. см (п. 8.3.1), разбавляют ацетоном и доводят объем до метки. Этот раствор используют для приготовления градуировочных растворов N 2 - 5, а также для внесения в образцы семян и масла при оценке полноты извлечения флуопиколида.

Градуировочный раствор N 1 хранят при температуре не выше -18 °C не более месяца.

В 4 мерные колбы вместимостью 100 куб. см помещают 1,0; 2,0; 5,0 и 10,0 куб. см градуировочного раствора флуопиколида с массовой концентрацией 1 мкг/куб. см (п. 8.3.2), доводят объем раствора до метки ацетоном, тщательно перемешивают, получают градуировочные растворы N 2 - 5 с массовой концентрацией флуопиколида 0,01; 0,02; 0,05 и 0,1 мкг/куб. см соответственно. Растворы готовят непосредственно перед использованием.

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади пика (мВ x с) от массовой концентрации флуопиколида в растворе (мкг/куб. см), устанавливают методом абсолютной градуировки по 4 градуировочным растворам.

В инжектор хроматографа вводят по 1 куб. мм каждого градуировочного раствора (п. 8.3.3) и анализируют при условиях хроматографирования по п. 7.2. Осуществляют не менее 3 параллельных измерений. Расхождение между параллельными определениями не должно превышать предел повторяемости r.

Контроль стабильности градуировки проводят не реже 1 раза в три месяца, а также при смене реактивов или изменении условий анализа.

Для контроля стабильности используют вновь приготовленные градуировочные растворы с массовой концентрацией исследуемого вещества в начале, середине и в конце диапазона измерений, которые анализируют в точном соответствии с методикой.

Градуировочную характеристику считают стабильной, если для каждого контрольного образца выполняется условие (1):

где:

, - значение площади пика флуопиколида в образце для контроля, измеренное и найденное по градуировочной характеристике соответственно, мВ x с;

- норматив контроля, , где

- границы относительной погрешности, % (табл. 1).

Если условие стабильности не выполняется только для одного образца, то повторно анализируют этот образец для исключения результата, содержащего грубую ошибку.

Если градуировка нестабильна, выясняют причины нестабильности и повторяют контроль стабильности с использованием других образцов для градуировки, предусмотренных методикой. При повторном обнаружении нестабильности градуировки прибор градуируют заново.

Нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см и внутренним диаметром 8 - 10 мм уплотняют тампоном из стекловаты, медленно выливают в колонку (при открытом кране) суспензию 3 г силикагеля в 15 куб. см гексана. Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента и помещают на него слой безводного сульфата натрия высотой 1 см. Колонку последовательно промывают 20 куб. см ацетона и 10 куб. см гексана со скоростью 1 - 2 капли в секунду, после чего она готова к работе.

При отработке методики или поступлении новой партии силикагеля или растворителей проводят определение объема элюента, необходимого для полного вымывания флуопиколида из колонки с силикагелем.

Готовят раствор гексан-этилацетат (9:1, по объему). Для этого в мерную колбу вместимостью 500 куб. см вносят 50 куб. см этилацетата и доводят объем раствора до метки гексаном. Срок хранения раствора - 1 неделя.

Готовят раствор гексан-этилацетат (8:2, по объему). Для этого в мерную колбу вместимостью 500 куб. см вносят 100 куб. см этилацетата и доводят объем раствора до метки гексаном. Срок хранения раствора - 1 неделя.

В круглодонную колбу вместимостью 10 куб. см помещают 0,1 куб. см градуировочного раствора флуопиколида с массовой концентрацией 1 мкг/куб. см в ацетоне (п. 8.3.2) и отдувают растворитель током теплого воздуха. Остаток растворяют в 3 куб. см смеси гексан-этилацетат (9:1, по объему), помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин. Раствор наносят на колонку с силикагелем, подготовленную по п. 8.6. Пропускают через колонку 30 куб. см смеси гексан-этилацетат (9:1, по объему) со скоростью 1 - 2 капли в секунду, элюат отбрасывают. Затем колонку промывают 40 куб. см смеси гексан-этилацетат (8:2, по объему), отбирая последовательно по 5 куб. см элюата. Каждую фракцию упаривают досуха, остатки растворяют в 1 куб. см ацетона, помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин., и затем хроматографируют в соответствии с п. 7.2.

По результатам обнаружения флуопиколида в каждой из фракций определяют объем элюента, необходимого для полного вымывания вещества из колонки.

Отбор проб производят в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (от 21.08.79 N 2051-79) и правилами, определенными ГОСТ 10852-86 "Семена масличные. Правила приемки и методы отбора проб" и 8988-77 "Масло рапсовое. ТУ".

Пробы семян высушивают до стандартной влажности (в соответствии с ГОСТ 10852-86) и хранят в бумажных или тканевых мешочках в сухом, хорошо проветриваемом шкафу. Пробы масла хранят в плотно закрытой стеклянной или полиэтиленовой таре в холодильнике при температуре не выше 4 °C. В некоторых случаях масло получают из семян рапса экстракцией органическими неполярными растворителями (петролейный и диэтиловый эфиры) непосредственно перед проведением анализа.

Приготовление водного раствора метанола с объемной долей 80%

В мерную колбу вместимостью 500 куб. см помещают 100 куб. см деионизованной воды и доводят объем раствора в колбе до метки метанолом, перемешивают.

Срок хранения раствора - 1 неделя.

Образец размолотых семян массой 10 г помещают в плоскодонную колбу вместимостью 250 куб. см, добавляют 50 куб. см водного раствора метанола с объемной долей 80% и помещают на аппарат для встряхивания на 30 мин. Суспензию фильтруют под вакуумом на воронке Бюхнера через бумажный фильтр в колбу вместимостью 250 куб. см. Осадок на фильтре промывают 25 куб. см водного раствора метанола с объемной долей 80%. Экстракт и промывную жидкость переносят в химический стакан, перемешивают, измеряют объем раствора и 1/2 его часть (эквивалентную 5 г образца) переносят в делительную воронку вместимостью 100 куб. см. В воронку вносят 15 куб. см гексана, насыщенного метанолом, интенсивно встряхивают в течение 2 мин. После расслоения фаз гексановый слой отбрасывают, а водно-метанольную фракцию переносят в круглодонную колбу. Дальнейшую очистку экстракта проводят по п. 10.2.

К образцу масла массой 5 г, помещенного в плоскодонную колбу вместимостью 250 куб. см, приливают 15 куб. см гексана и перемешивают. К раствору добавляют 50 куб. см водного раствора метанола с объемной долей 80% и колбу помещают на встряхиватель на 30 мин. Верхний водно-метанольный слой декантируют в делительную воронку вместимостью 250 куб. см. К оставшемуся в колбе маслянистому остатку приливают 30 куб. см водного раствора метанола с объемной долей 80% и операцию экстракции повторяют в течение 20 мин. К объединенной водно-метанольной фазе, находящейся в делительной воронке, добавляют 15 куб. см гексана, насыщенного метанолом, и интенсивно встряхивают в течение 2 мин. После расслоения фаз гексановый слой отбрасывают, а водно-метанольную фракцию переносят в круглодонную колбу. (В случае плохого расслоения фаз в раствор добавляют 10 куб. см насыщенного раствора хлорида натрия.) Далее проводят очистку экстракта по п. 10.2.

Отобранные экстракты семян и масла, полученные по пп. 10.1.1, 10.1.2 и помещенные в круглодонные колбы, упаривают на ротационном вакуумном испарителе до водного остатка (6 - 8 куб. см) при температуре не выше 30 °C. К водному остатку добавляют 20 куб. см деионизованной воды, перемешивают и переносят в делительную воронку вместимостью 100 куб. см. В воронку вносят 30 куб. см гексана, интенсивно встряхивают в течение 2 мин. После разделения фаз верхний органический слой фильтруют через слой безводного сульфата натрия в круглодонную колбу вместимостью 100 куб. см. Операцию экстракции водной фазы проводят еще дважды, используя 30 и 20 куб. см гексана. Объединенную органическую фазу, пропущенную через слой сульфата натрия, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °C и подвергают дополнительной очистке на колонке с силикагелем по п. 10.3.

Остаток в круглодонной колбе, полученный по п. 10.2, растворяют в 2 куб. см смеси гексан-этилацетат (9:1, по объему), помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин. Раствор наносят на колонку, подготовленную по п. 8.6. Колбу обмывают 2 куб. см смеси гексан-этилацетат (9:1, по объему), которые также наносят на колонку. Промывают колонку 25 куб. см смеси гексан-этилацетат (9:1, по объему) со скоростью 1 - 2 капли в секунду, элюат отбрасывают. Флуопиколид элюируют с колонки 25 куб. см смеси гексан-этилацетат (8:2, по объему), собирая элюат непосредственно в круглодонную колбу вместимостью 100 куб. см. Раствор упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °C. Сухие остатки экстрактов семян и масла растворяют в 5 куб. см ацетона, помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин., и растворы анализируют на содержание флуопиколида по п. 11.1.

Полнота извлечения флуопиколида при проведении всех операций подготовки пробы не менее 86%.

11.1. В испаритель хроматографа вводят 1 куб. мм очищенного экстракта анализируемой пробы (пп. 10.1 - 10.3), анализируют при условиях п. 7.2 и регистрируют хроматограмму. Каждый экстракт хроматографируют дважды.

11.2. Для каждого образца повторяют операции по пп. 10.1 - 10.3, 11.1.

12.1. Для обработки результатов хроматографического анализа используют программу сбора и обработки хроматографической информации.

Альтернативная обработка результатов.

Массовую долю флуопиколида X, мг/кг, в семенах и масле рапса рассчитывают по формуле (2):

где:

- площадь пика флуопиколида в образце, мВ x с;

- площадь пика флуопиколида в градуировочном растворе, мВ x с;

A - массовая концентрация градуировочного раствора флуопиколида, мкг/куб. см;

V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, куб. см;

m - масса анализируемой части образца, соответствующая доле экстракта, использованной для очистки на колонке с силикагелем и последующего хроматографического определения, г;

0,86 - коэффициент извлечения флуопиколида, учитывающий все процедуры подготовки пробы.

12.2. За результат измерений принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, если выполняется условие приемлемости (3):

где:

, - результаты параллельных определений массовой доли флуопиколида, мг/кг;

r - значение предела повторяемости, % (табл. 1).

Если условие (3) не выполняется, выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и повторяют выполнение измерений в соответствии с требованиями МВИ.

12.3. Результат анализа в документах, предусматривающих его использование, представляют в виде:

где:

- среднее арифметическое значение результатов n определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

- границы относительной погрешности измерений, % (табл. 1).

В случае, если полученный результат измерений ниже нижней границы диапазона измерений, то результат анализа представляют в виде:

"массовая доля флуопиколида в семенах, масле менее 0,01 мг/кг".

Экстракты, при хроматографировании которых получают аналитический сигнал флуопиколида, превышающий аналитический сигнал, получаемый при хроматографировании градуировочного раствора с массовой концентрацией 0,1 мкг/куб. см, разбавляют ацетоном, но не более чем в 10 раз, и анализируют в соответствии с данной методикой.

13.1. Проверку приемлемости результатов измерений в условиях воспроизводимости проводят:

а) при возникновении спорных ситуаций между двумя лабораториями;

б) при проверке совместимости результатов измерений, полученных при сличительных испытаниях (при проведении аккредитации лабораторий и инспекционного контроля).

13.2. Для проведения проверки приемлемости результатов измерений в условиях воспроизводимости каждая лаборатория использует пробы, оставленные на хранение.

13.3. Расхождение между результатами измерений, выполненных в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), не должно превышать предела воспроизводимости (R):

где:

, - результаты измерений массовой доли флуопиколида, выполненных в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), мг/кг;

R - предел воспроизводимости, % (при этом ).

Если предел воспроизводимости не превышен, то приемлемы все результаты измерений, и в качестве окончательного результата используют их среднеарифметическое значение. Если предел воспроизводимости превышен, то выполняют процедуры, изложенные в ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002 (п. 5.3.3).

При разногласиях руководствуются ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002 (п. 5.3.4).

Контроль качества результатов измерений в лаборатории при реализации методики осуществляют по ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002, используя контроль стабильности среднеквадратического (стандартного) отклонения повторяемости по 6.2.2 ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002 и показателя правильности по п. 6.2.4 ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002.

Рекомендуется устанавливать контролируемый период так, чтобы количество результатов контрольных измерений было от 20 до 30.

При неудовлетворительных результатах контроля, например при превышении предела действия или регулярном превышении предела предупреждения, выясняют причины этих отклонений, в том числе проводят смену реактивов, проверяют работу оператора.