"МУК 4.1.2673-10. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств дитианона в ботве и клубнях картофеля методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 02.08.2010)

1. Разработаны Всероссийским НИИ защиты растений.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 10.06.2010 N 1).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 2 августа 2010 г.

4. Введены в действие с 1 октября 2010 г.

5. Введены впервые.

Настоящий документ устанавливает метод измерения массовой концентрации дитианона в ботве и клубнях картофеля в диапазоне концентраций 0,025 - 0,25 мг/кг.

Дитианон.

Название по номенклатуре ИЮПАК: 5,10-дигидро-5,10-диоксо-нафто[2,3-b]-1,4-дитиин-2,3-дикарбонитрил.

Структурная формула (не приводится).

Молекулярная масса: 296,3.

Химически чистое вещество: коричневый кристаллический порошок без запаха.

Температура плавления: 225 °C.

Гигиенические нормативы: МДУ для картофеля не установлен.

Область применения препарата: лиственный фунгицид защитного и отчасти целебного действия. Используется для контроля многих заболеваний листьев, включая паршу на фруктовых деревьях; ржавчину и скручивание листьев у абрикосов и персиков, образование пятен на листьях смородины и т.д. Эффективен против возбудителей болезней Stigmana carpophila, Coccomyces hiemalis, manlia, Didimella applanata, Mycosphaerella fragariae и др.

1.1.1. Принцип метода

Методика основана на определении дитианона методом ВЭЖХ с использованием УФ-детектора после его извлечения из образцов ботвы или клубней ацетонитрилом в присутствии ацетатного буфера, насыщенного сульфатом магния, и обеспечивающего разделение водной и органической фаз и очистки ацетонитрильного экстракта силикагелем с помощью дисперсионной твердофазной экстракции при одновременном удалении воды безводным сульфатом магния.

Учитывая чувствительность препарата к нагреванию и воздействию УФ-лучей для пробоподготовки выбран экспрессный метод, исключающий нагревание образца или его длительные экспозиции на свету.

1.1.2. Метрологические характеристики

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в таблице 1, для соответствующих диапазонов концентраций.

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для полного диапазона концентраций (n = 20) приведены в таблице 2.

1.1.3. Избирательность метода

Избирательность метода определения дитианона достигается условиями подготовки проб и хроматографического анализа.

Допускается использование реактивов квалификацией не ниже указанных.

Допускается использование приборов и посуды с метрологическими характеристиками не ниже указанных.

Отбор проб производится в соответствии с ГОСТ 26832-86 "Картофель свежий для переработки на продукты питания". Пробы клубней и ботвы картофеля для определения остатков в урожае хранят в морозильной камере при -18 °C.

2.4.1. Подготовка и очистка реактивов и растворителей

Растворители, используемые для анализа, специальной подготовки не требуют. Рекомендуется проверить чистоту применяемых растворителей. Для этого 100 куб. см растворителя испаряют при помощи вакуумного ротационного испарителя при температуре 40 °C до объема 1 куб. см и хроматографируют. При обнаружении примесей, которые могут мешать определению, растворители очищают в соответствии с типовыми методиками.

2.4.2. Кондиционирование колонки

Перед началом анализа аналитические колонки кондиционируют в потоке подвижной фазы (0,1 - 0,2 мл/мин.) до стабилизации нулевой линии в течение 1 часа.

2.4.3. Приготовление растворов

Для приготовления 0,005 М раствора ортофосфорной кислоты 0,5 г 98% ортофосфорной кислоты помещают в мерную колбу объемом 1 куб. дм, растворяют в бидистиллированной воде и доводят объем до метки.

Приготовление стандартного и градуировочных растворов:

Точную навеску дитианона (50 мг) помещают в мерную колбу объемом 100 куб. см, растворяют в ацетонитриле и доводят до метки. (Стандартный раствор с концентрацией 0,5 мг/куб. см). Градуировочные растворы с концентрациями 0,025, 0,050, 0,100, 0,200 и 0,250 мкг/куб. см готовят методом последовательного разбавления по объему, используя раствор подвижной фазы. Основной и рабочие градуировочные растворы используют свежеприготовленными. При изучении полноты извлечения дитианона из картофеля используют ацетонитрильные растворы вещества.

2.4.4. Построение градуировочного графика

Для построения градуировочного графика (площадь пика - концентрация дитианона в растворе) в хроматограф вводят по 10 куб. мм градуировочных растворов (не менее 3-х параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4-х точек по диапазону измеряемых концентраций). Затем измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации дитианона в градуировочном растворе.

Градуировочную характеристику необходимо проверять при замене реактивов, хроматографической колонки или элементов хроматографической системы, а также при отрицательном результате контроля градуировочного коэффициента.

Градуировочную зависимость признают стабильной при выполнении следующего условия:

2.4.5. Подготовка приборов и средств измерения

Установка и подготовка всех приборов и средств измерения проводится в соответствии с требованиями технической документации.

2.5.1. Определение дитианона в клубнях картофеля

10 г измельченных клубней картофеля помещают в тефлоновую центрифужную пробирку вместимостью 50 куб. см, прибавляют 2 куб. см воды, 8 куб. см ацетонитрила, 0,1 куб. см ледяной уксусной кислоты, 4 г безводного сульфата магния и 1 г уксуснокислого натрия. Пробирку плотно закрывают пробкой, встряхивают на аппарате в течение 15 мин. и центрифугируют при скорости 8000 об./мин. в течение 10 мин. Измеряют объем супернатанта и количественно переносят его в другую тефлоновую центрифужную пробирку. Прибавляют силикагель и безводный сульфат магния из расчета 50 мг силикагеля и 150 мг сульфата магния на 1 куб. см супернатанта. Пробирку плотно закрывают пробкой, встряхивают на аппарате в течение 15 мин. и центрифугируют при скорости 8000 об./мин. в течение 10 мин. Количественно отбирают с помощью шприца верхний ацетонитрильный слой, переносят его в мерную колбу вместимостью 10 куб. см и доводят объем до метки 0,005 М фосфорной кислотой. 10 куб. мм полученного раствора вводят в хроматограф.

2.5.2. Определение дитианона в ботве картофеля

10 г измельченной ботвы картофеля помещают в тефлоновую центрифужную пробирку вместимостью 50 куб. см, прибавляют 10 куб. см ацетонитрила, 0,1 куб. см ледяной уксусной кислоты, 4 г безводного сульфата магния и 1 г уксуснокислого натрия. Дальнейшую обработку пробы производят по п. 2.5.1.

2.5.3. Условия хроматографирования

Ультраэффективный жидкостной хроматограф "ACQUITY" фирмы Waters с быстросканирующим УФ-детектором, снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки. Аналитическая колонка ACQUITY UPLC BEH C18 (2,1 x 100) мм, 1,7 мкм (Waters). Температура колонки 30 +/- 1 °C. Подвижная фаза: смесь ацетонитрила и 0,005 М ортофосфорной кислоты в соотношении 50:50. Скорость потока элюента: 0,2 куб. см/мин. Рабочая длина волны УФ-детектора 235 нм. Объем вводимой пробы 10 куб. мм. Время удерживания дитианона составляет 6,3 +/- 0,1 мин.

Содержание дитианона в образцах клубней и ботвы картофеля (X, мг/кг) вычисляют по формуле:

V - объем пробы, подготовленной для хроматографического анализа, куб. см;

P - навеска анализируемого образца, г;

C - концентрация стандартного раствора дитианона, мкг/куб. см.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор дитианона 1 мкг/куб. см, разбавляют подвижной фазой для ВЭЖХ.

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

Результат анализа представляют в виде:

ДЕЛЬТА - граница абсолютной погрешности, мг/кг;

дельта - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

В случае, если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание вещества в пробе "менее нижней границы определения" (например: менее 0,005 мг/кг <*>).

--------------------------------

<*> 0,005 мг/кг - предел обнаружения.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

6.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

6.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры к их устранению.

6.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости:

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):

R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций), %.

При проведении работы необходимо соблюдать требования безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими, легковоспламеняющимися веществами (ГОСТ 12.1.005-88).

При выполнении измерений с использованием жидкостного хроматографа и работе с электроустановками соблюдать правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 и инструкциями по эксплуатации приборов.

Помещение лаборатории должно соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91.

Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист-химик, имеющий опыт работы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, ознакомленный с руководством по эксплуатации жидкостного хроматографа, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 6.

ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт защиты растений, Санкт-Петербург.