"МУК 4.1.2985-12. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств ацетамиприда в плодах и соке яблок методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 19.03.2012)

1. Рекомендованы к утверждению Комиссией по санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 22.12.2012 N 2).

2. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 19 марта 2012 г.

3. Введены в действие с момента утверждения.

4. Введены впервые.

Свидетельство о метрологической аттестации от 10.06.2011 N 01.5.04.009/01.00043/2011.

Настоящий документ устанавливает методику определения остаточных количеств ацетамиприда в плодах и соке яблок в диапазоне концентраций 0,005 - 0,1 мг/кг.

Название действующего вещества по ИСО: ацетамиприд.

Структурная формула:

Название действующего вещества по ИЮПАК: .

Молекулярная масса: 222,7.

Эмпирическая формула: .

Химически чистое вещество представляет собой белый кристаллический порошок.

Температура плавления: 98,9 °C.

Давление пара: (25 °C).

Коэффициент распределения в системе н-октанол-вода: (25 °C).

Растворимость в воде (мг/дм3, 25 °C): 4250.

Растворимость в органических растворителях: растворим в ацетоне, метаноле, этаноле, дихлорметане, хлороформе, ацетонитриле и тетрагидрофуране.

Стабилен в буферных при pH 4, 5, 7. Медленно разлагается при pH 9 и 45 °C. Устойчив к воздействию света.

Слабое основание, .

Краткая токсикологическая характеристика

Острая оральная токсичность 2148 мг/кг (крысы). При подкожном введении 4166 мг/кг (кролики). Ингаляционная токсичность более 3,0 мг на 1 дм3 воздуха (крысы, период наблюдения 4 ч). Практически не раздражает кожу и слизистую глаз у кроликов.

Область применения

Системный инсектицид - агонист никотиновых ацетилхолиновых рецепторов, влияющий на синапсы центральной нервной системы насекомых.

Механизм действия: трансламинарная активность контактного и желудочного действия.

Используется для подавления развития тли Hemiptera, Thysanoptera и Lipidoptera посредством обработки почвы и листьев растений во фруктовых садах при нормах расхода 100 - 700 г/га.

В России для ацетамиприда установлены следующие гигиенические нормативы: ДСД - 0,01 мг/кг массы человека; ОДК в почве - 0,6 мг/кг; ПДК в воде водоемов - 0,02 мг/дм3; МДУ (мг/кг) картофель и зерно пшеницы - 0,5, огурцы и томаты - 0,3.

Нормативы для плодов и сока яблок не установлены.

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1, для соответствующих диапазонов концентраций.

Методика основана на определении ацетамиприда методом ВЭЖХ с использованием УФ-детектора после его экстракции водным ацетоном и очисткой проб перераспределением в системе несмешивающихся растворителей и на концентрирующем патроне, заполненном силикагелем.

Идентификация ацетамиприда проводится по времени удерживания, количественное определение - методом абсолютной калибровки.

Полнота извлечения ацетамиприда, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для n = 20, P = 0,95.

Избирательность метода обеспечивается сочетанием условий подготовки проб и хроматографирования.

3.1. Средства измерений

Примечание. Допускается использование средств измерения иных производителей с аналогичными характеристиками.

3.2. Реактивы

Примечание. Допускается использование реактивов с аналогичной квалификацией.

3.3. Вспомогательные устройства и материалы

Примечание. Допускается использование другого вспомогательного оборудования иных производителей с аналогичными техническими характеристиками.

4.1. При проведении работы необходимо соблюдать требования техники безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими, легковоспламеняющимися веществами (ГОСТ 12.1.005, 12.1.007). Организация обучения работников безопасности труда по ГОСТ 12.0.004.

При выполнении измерений с использованием жидкостного хроматографа и работе с электроустановками соблюдать правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 и инструкциями по эксплуатации приборов.

4.2. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией, соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 "Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны".

Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист-химик, имеющий опыт работы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, ознакомленный с руководством по эксплуатации хроматографа, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 13.

При выполнении измерений выполняют следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C и относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

7.1. Кондиционирование колонки

Перед началом анализа колонку (Acquity BEH C18) кондиционируют в потоке подвижной фазы (0,1 - 0,2 см3/мин) до стабилизации нулевой линии.

7.2. Приготовление растворов

7.2.1. Приготовление 0,005%-го раствора ортофосфорной кислоты: (0,5 +/- 0,01) г 98%-й ортофосфорной кислоты помещают в мерную колбу вместимостью 1 дм3, растворяют в бидистиллированной воде и доводят объем до метки. Перемешивают.

7.2.2. Приготовление 2 М раствора хлорида натрия: в мерную колбу вместимостью 1 дм3 помещают 117 г хлорида натрия. Растворяют в бидистиллированной воде и доводят объем до метки. Перемешивают.

7.2.3. Приготовление 0,01 М раствора гидроксида натрия: в мерную колбу вместимостью 1 дм3 помещают 0,4 г гидроксида натрия. Растворяют в 0,5 дм3 бидистиллированной воды и доводят объем до метки. Перемешивают.

7.2.4. Для приготовления подвижной фазы: смешивают ацетонитрил и 0,005 М раствор ортофосфорной кислоты в соотношении 25:75 по объему, используя мерные цилиндры.

7.2.5. Приготовление элюентов для твердофазной экстракции:

Элюент 1: В мерную колбу вместимостью 100 см3 помещают 25 см3 гексана и доводят объем до метки этилацетатом. Перемешивают. Элюент хранят в вытяжном шкафу и используют свежеприготовленным.

Элюент 2: В мерную колбу вместимостью 100 см3 помещают 10 см3 гексана и доводят объем до метки этилацетатом. Перемешивают. Элюент хранят в вытяжном шкафу и используют свежеприготовленным.

7.3. Приготовление основного и градуировочных растворов

7.3.1. Основной раствор с концентрацией 0,5 мг/см3: точную навеску ацетамиприда (50 +/- 0,5) мг помещают в мерную колбу вместимостью 100 см3, растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки тем же растворителем.

Градуировочные растворы ацетамиприда с концентрациями 0,05, 0,1, 0,2, 0,5 и 1,0 мкг/см3 готовят методом последовательного разбавления по объему основного раствора подвижной фазы.

7.3.2. Раствор N 1 с концентрацией ацетамиприда 1,0 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 100 см3 вносят 0,2 см3 основного раствора и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.3.3. Раствор N 2 с концентрацией ацетамиприда 0,5 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 10 см3 вносят 5 см3 раствора N 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.3.4. Раствор N 3 с концентрацией ацетамиприда 0,2 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 10 см3 вносят 2,0 см3 раствора N 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.3.5. Раствор N 4 с концентрацией ацетамиприда 0,1 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 10 см3 вносят 1,0 см3 раствора N 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.3.6. Раствор N 5 с концентрацией ацетамиприда 0,05 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 10 см3 вносят 0,5 см3 раствора N 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

Основной раствор можно хранить в холодильнике при температуре 0 - 4 °C в течение месяца, градуировочные растворы - в течение недели.

При изучении полноты определения ацетамиприда в плодах и соке яблок используют ацетонитрильные растворы ацетамиприда. Растворы с концентрациями 1,0 и 10,0 мкг/см3 готовят из основного раствора с концентрацией 0,5 мг/см3 методом последовательного разбавления по объему ацетонитрилом.

7.4. Построение градуировочного графика

Для установления градуировочной характеристики (площадь пика - концентрация ацетамиприда в растворе) в хроматограф вводят по 10 мм3 градуировочных растворов (не менее 3 параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4 точек по диапазону измеряемых концентраций). Затем измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации ацетамиприда в градуировочном растворе.

Методом наименьших квадратов рассчитывают градуировочный коэффициент (K) в уравнении линейной регрессии:

S - площадь пика градуировочного раствора.

Градуировку признают удовлетворительной, если значение коэффициента линейной корреляции оказывается не ниже 0,99.

Градуировочную характеристику необходимо проверять при замене реактивов, хроматографической колонки или элементов хроматографической системы, а также при отрицательном результате контроля градуировочного коэффициента.

Градуировочную зависимость признают стабильной при выполнении следующего условия:

C - аттестованное значение массовой концентрации ацетамиприда в градуировочном растворе;

- результат контрольного измерения массовой концентрации ацетамиприда в градуировочном растворе;

- норматив контроля градуировочного коэффициента, % ( при P = 0,95).

7.5. Подготовка концентрирующих патронов Силикагель 60

Непосредственно перед употреблением через патрон пропускают 2 см3 элюата 1.

Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (N 2051-79 от 21.08.1979) или в соответствии с ГОСТ 27572-87 "Яблоки свежие для промышленной переработки".

Плоды яблок хранят до анализа в морозильной камере при температуре -18 °C. Пробы сока хранят в холодильнике при температуре 0 - 4 °C в течение 3 суток, при температуре -18 °C - в течение месяца (в пластиковых бутылях).

9.1. Определение ацетамиприда в соке яблок

На воронке Бюхнера фильтруют 20 см3 сока и доводят объем фильтрата до 100 см3 водой. Полученный раствор помещают в делительную воронку вместимостью 250 см3 и промывают двумя порциями гексана по 25 см3. Органический слой отделяют и отбрасывают. К водному остатку прибавляют 50 см3 2 М раствора хлорида натрия и экстрагируют ацетамиприд 25 см3 хлористого метилена, встряхивая воронку в течение 2 мин. Отделяют нижний органический слой и дважды повторяют экстракцию. Объединенный экстракт промывают 20 см3 0,01 М раствора гидроксида натрия, водный слой отделяют и отбрасывают, а органический пропускают через слой безводного сульфата натрия и упаривают досуха на вакуумном ротационном испарителе при температуре водяной бани не выше 40 °C. Сухой остаток растворяют в 1,5 см3 этилацетата, прибавляют 0,5 см3 гексана и количественно переносят пробу в подготовленный концентрирующий патрон Силикагель 60. Промывают 8 см3 элюента 1. Промывку отбрасывают. Ацетамиприд элюируют 10 см3 элюента 2. Элюат упаривают досуха на вакуумном ротационном испарителе при температуре водяной бани не выше 40 °C. Сухой остаток растворяют в 1 см3 подвижной фазы и 10 мм3 полученного раствора вводят в хроматограф.

9.2. Определение ацетамиприда в плодах яблок

В коническую колбу вместимостью 250 см3 помещают 20 г измельченных плодов, прибавляют 10 см3 воды. 40 см3 ацетона и экстрагируют в течение 10 мин в ультразвуковой ванне. Суспензию фильтруют на воронке Бюхнера через бумажный фильтр "красная лента". Экстракцию повторяют. Объединенный экстракт упаривают на вакуумном ротационном испарителе при температуре водяной бани не выше 40 °C до полного удаления ацетона. Объем водного остатка доводят водой до 100 см3 и далее обрабатывают пробу по п. 9.1.

9.3. Условия хроматографирования

Ультраэффективный жидкостный хроматограф "ACQUITY" фирмы Waters с быстросканирующим УФ-детектором, снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки. Аналитическая колонка ACQUITY UPLC BEH C18 (2,1 x 100) мм, 1,7 мкм (Waters). Температура колонки (30 +/- 1) °C. Подвижная фаза: смесь ацетонитрила и 0,005 М ортофосфорной кислоты в соотношении 25:75. Скорость потока элюента: 0,2 см3/мин. Рабочая длина волны УФ-детектора 245 нм. Объем вводимой пробы 10 мм3.

Время удерживания ацетамиприда (3,4 +/- 0,1) мин.

Линейный диапазон детектирования сохраняется в интервале концентраций 0,05 - 1,0 мкг/см3.

Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки. Содержание ацетамиприда в плодах и соке яблок (X, мг/кг) вычисляют по формуле:

- площадь пика ацетамиприда на хроматограмме испытуемого образца, мм2 (AU);

K - градуировочный коэффициент, найденный на стадии построения соответствующей градуировочной зависимости;

V - объем пробы, подготовленной для хроматографического анализа, см3:

P - навеска анализируемого образца, г;

f - полнота извлечения ацетамиприда, приведенная в табл. 2, %.

Содержание остаточных количеств ацетамиприда в образце вычисляют как среднее из двух параллельных определений.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор ацетамиприда с концентрацией 1,0 мкг/см3, разбавляют подвижной фазой для ВЭЖХ.

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости:

и - результаты параллельных определений, мг/кг;

r - значение предела повторяемости .

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

Результат анализа представляют в виде:

- среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

- граница абсолютной погрешности, мг/кг:

- граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

В случае если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание ацетамиприда в пробах плодов и сока яблок менее 0,005 мг/кг" <*>.

--------------------------------

<*> - 0,005 мг/кг - предел обнаружения ацетамиприда в пробах плодов и соке яблок.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.

Величина добавки должна удовлетворять условию:

- характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой соответственно), мг/кг; при этом

- граница абсолютной погрешности, мг/кг:

- граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

Результат контроля процедуры рассчитывают по формуле:

X', X, - среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки, соответственно, мг/кг.

Норматив контроля K рассчитывают по формуле:

Проводят сопоставление результата контроля процедуры с нормативом контроля (K).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры к их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):

и - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;

R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций), %.

Долженко В.И., Цибульская И.А., Журкович И.К., Луговкина Н.В., Ковров Н.Г. (ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт защиты растений, Санкт-Петербург).