"МУК 4.1.2854-11. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств Проквиназида в зерне и соломе зерновых культур методом капиллярной газожидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 31.03.2011)

1. Разработаны Российским государственным аграрным университетом - МСХА им. К.А. Тимирязева, Учебно-научный консультационный центр "Агроэкология пестицидов и агрохимикатов" Минсельхоза России.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 28.12.2010 N 3).

3. Утверждены руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 31.03.2011.

4. Введены в действие с момента утверждения.

5. Введены впервые.

Свидетельство об аттестации методики от 06.10.2010 N 0049.27.09.10.

Настоящие методические указания устанавливают метод газожидкостной хроматографии для определения уровня остаточных количеств Проквиназида в зерне зерновых культур в диапазоне 0,01 - 0,2 мг/кг; в соломе зерновых культур в диапазоне 0,04 - 0,4 мг/кг.

Название по ИЮПАК: 6-йодо-2-пропокси-3-пропилхиназолин-4(3H)-он.

Структурная формула (не приводится).

Молекулярная масса: 372,21.

Агрегатное состояние: кристаллы.

Цвет, запах: белого цвета, без запаха.

Растворимость в воде (при 25 °C и pH 7): 0,93 мг/куб. дм.

Растворимость в органических растворителях (г/куб. дм): в ацетоне, дихлорметане, этилацетате, н-гексане - > 250, в ацетонитриле - 154 +/- 2,1, в метаноле - 136 +/- 1,4.

Область применения: Проквиназид - фунгицид контактного действия со специфичной активностью против мучнисторосяных грибов на винограднике и зерновых колосовых культурах.

МДУ Проквиназида (в импортируемой продукции): зерно и солома зерновых - 0,02 мг/кг.

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций.

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительные интервалы среднего результата для полного диапазона концентраций (n = 20) приведены в табл. 2.

Метод основан на определении Проквиназида методом капиллярной газожидкостной хроматографии с использованием детектора по захвату электронов после экстракции его из зерна и соломы зерновых культур ацетонитрилом, очистки экстракта путем перераспределения между двумя несмешивающимися фазами и на колонках с Флоризилом.

Идентификация проводится по времени удерживания, а количественное определение - методом абсолютной калибровки.

В предлагаемых условиях анализа метод специфичен. Избирательность метода достигается за счет подбора колонки и условий программирования.

Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Допускается использование реактивов иных производителей с аналогичной или более высокой квалификацией.

Допускается применение хроматографических колонок и другого оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на газовый хроматограф.

4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 "Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны". Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004.

К выполнению измерений и обработке их результатов допускаются специалисты, имеющие высшее или специальное химическое образование, опыт работы в химической лаборатории, прошедшие обучение и владеющие техникой проведения анализа, освоившие метод анализа в процессе тренировки и уложившиеся в нормативы контроля при проведении процедуры контроля погрешности анализа.

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C, относительной влажности не более 80% и нормальном атмосферном давлении;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Выполнению измерений предшествуют следующие операции: очистка растворителей (при необходимости), приготовление растворов, кондиционирование хроматографической колонки, подготовка колонок с Флоризилом для очистки экстракта, проверка хроматографического поведения вещества на колонках с Флоризилом, построение калибровочной кривой.

Ацетонитрил, содержащий воду, предварительно осушают, добавляя в него гранулированный безводный хлористый кальций из расчета не менее 100 г/куб. дм. Выдерживают его над осушителем в течение 5 - 6 ч. Затем ацетонитрил сливают с осушителя в круглодонную колбу со шлифом объемом 4000 куб. см аппарата для перегонки растворителей.

Ацетонитрил перегоняют при температуре 81,5 °C, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше 81,5 °C, отбрасывают.

Ацетон помещают в круглодонную колбу со шлифом объемом 4000 куб. см от аппарата для перегонки растворителей, добавляют к нему марганцовокислый калий из расчета 1 г/куб. дм.

Ацетон перегоняют при температуре 56,2 °C, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше 56,2 °C, отбрасывают.

Дистиллят помещают в круглодонную колбу со шлифом объемом 4000 куб. см от аппарата для перегонки растворителей, добавляют к нему марганцовокислый калий из расчета 1 г/куб. дм и кипятят в течение 6 ч.

Собирают фракции, отогнанные при температуре 100,0 °C, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше 100,0 °C, отбрасывают.

Взвешивают 50 мг Проквиназида в мерной колбе объемом 50 куб. см. Навеску растворяют в ацетоне и доводят объем до метки ацетоном. Полученный стандартный раствор N 1 используется для приготовления стандартных растворов для хроматографического исследования и построения калибровочной кривой. Стандартный раствор N 1 хранится в холодильнике не более 4 месяцев.

Из стандартного раствора N 1 отбирают пипеткой 1 куб. см, помещают в мерную колбу объемом 100 куб. см и доводят объем до метки ацетоном. Стандартный раствор N 2 используется для приготовления стандартных растворов. Стандартный раствор N 2 хранится в холодильнике не более 30 суток.

Из стандартного раствора N 2 отбирают пипеткой 1 куб. см, помещают в мерную колбу объемом 10 куб. см и доводят объем до метки ацетоном. Стандартный раствор N 3 используется для приготовления стандартных растворов. Стандартный раствор N 3 хранится в холодильнике не более 1 месяца.

Из стандартного раствора N 3 отбирают пипеткой 2 куб. см, помещают в мерную колбу объемом 10 куб. см и доводят объем до метки ацетоном. Стандартный раствор N 4 используется для приготовления стандартных растворов и для построения калибровочной кривой. Стандартный раствор N 4 хранится в холодильнике не более 7 дней.

Из стандартного раствора N 3 отбирают пипеткой 1 куб. см, помещают в мерную колбу объемом 10 куб. см и доводят объем до метки ацетоном. Стандартный раствор N 5 используется для приготовления стандартных растворов и для построения калибровочной кривой. Стандартный раствор N 5 хранится в холодильнике не более 7 дней.

Из стандартного раствора N 5 отбирают пипеткой 5 куб. см, помещают в мерную колбу объемом 10 куб. см и доводят объем до метки ацетоном. Стандартный раствор N 6 используется для построения калибровочной кривой и хранится в холодильнике не более 7 дней.

Из стандартного раствора N 5 отбирают пипеткой 2 куб. см, помещают в мерную колбу объемом 10 куб. см и доводят объем до метки ацетоном. Стандартный раствор N 7 используется для построения калибровочной кривой и хранится в холодильнике не более 7 дней.

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади (высоты) пика от концентрации Проквиназида в растворе (мкг/куб. см), устанавливают методом абсолютной калибровки по 4 растворам для градуировки с концентрацией 0,2, 0,1, 0,05 и 0,02 мкг/куб. см.

В испаритель хроматографа вводят по 1 куб. мм каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.3. Осуществляют не менее 5 параллельных измерений.

В пластиковую или стеклянную колонку диаметром 15 мм помещают 4 г Флоризила с зернением 60/100 меш и, аккуратно постукивая по стенкам колонки, формируют слой адсорбента. На слой Флоризила наносят слой безводного сернокислого натрия толщиной 1 см.

Непосредственно перед использованием колонку промывают 10 куб. см ацетона и затем 10 куб. см гексана тщательно отжимают.

В концентратор объемом 100 куб. см вносят 1 куб. см стандартного раствора Проквиназида в ацетоне с концентрацией 0,2 мкг/куб. см и выпаривают его досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °C. Сухой остаток растворяют в 5 куб. см гексана, тщательно обмывают стенки концентратора и наносят на заранее подготовленную колонку. Элюат собирают в концентратор и выпаривают досуха при температуре не выше 30 °C. Исходную колбу обмывают 15 куб. см, наносят на колонку, элюат собирают. Затем колонку последовательно промывают четырьмя порциями смеси гексана с ацетоном в соотношении 4:1 объемом 5 куб. см каждая. Каждую порцию собирают отдельно в концентраторы и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °C.

Сухой остаток каждой фракции растворяют в 1 куб. см ацетона и 1 куб. мм пробы вводят в хроматограф.

Определяют фракции, содержащие Проквиназид, полноту смывания с колонки и необходимый объем элюата.

Изучение поведения Проквиназида на колонке проводят каждый раз при отработке методики или поступлении новой партии Флоризила.

Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов", от 21.08.1979 N 2051-79, а также по ГОСТ 13586.3-83 "Зерно. Правила приемки и методы отбора проб", ГОСТ Р 50436-92 (ИСО 950-79) "Зерновые. Отбор проб зерна" и ГОСТ 27262-87 "Корма растительного происхождения. Методы отбора проб".

Отобранные пробы зерна и соломы подсушивают до стандартной влажности и хранят в бумажных или тканевых мешочках в сухом, хорошо проветриваемом шкафу, недоступном для грызунов.

Образец измельченного зерна пшеницы массой 10 г помещают в банку для экстракции и центрифугирования объемом 200 куб. см, прибавляют 10 куб. см дистиллированной воды, 50 куб. см ацетонитрила и помещают на 45 мин. на аппарат для встряхивания проб. Пробу центрифугируют в течение 5 мин. при скорости 4000 об./мин. и экстракт фильтруют в концентратор объемом 250 куб. см через фильтр "красная лента". Экстракцию повторяют еще два раза, используя каждый раз по 50 куб. см ацетонитрила и помещая каждый раз на 30 мин. на аппарат для встряхивания проб. Экстракт объединяют в концентраторе объемом 250 куб. см и выпаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре водяной бани не выше 35 °C.

К сухому остатку в концентраторе, полученному в п. 9.1.1, прибавляют 5 куб. см ацетонитрила, тщательно обмывая стенки концентратора, помещают на 1 мин. в ультразвуковую ванну. Затем в концентратор добавляют 100 куб. см воды, 5 г хлорида натрия, перемешивают и переносят в делительную воронку объемом 250 куб. см.

Проквиназид экстрагируют тремя порциями диэтилового эфира объемом по 50 куб. см, каждый раз встряхивая делительную воронку по 2 мин. После полного разделения фаз в делительной воронке верхний слой (эфир) собирают в концентратор объемом 250 куб. см через слой безводного сульфата натрия. Объединенный экстракт выпаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре водяной бани не выше 35 °C.

Сухой остаток в концентраторе разводят в 5 куб. см и аликвоту 1 куб. мм вводят в хроматограф.

Образец измельченной соломы пшеницы массой 5 г помещают в полипропиленовую банку для экстракции объемом 250 куб. см, прибавляют 10 куб. см воды и оставляют при комнатной температуре на 10 мин. Проквиназид экстрагируют 50 куб. см ацетонитрила, помещая на 45 мин. на аппарат для встряхивания проб. Экстракт фильтруют в концентратор объемом 250 куб. см через фильтр "красная лента". Экстракцию повторяют еще два раза, используя каждый раз по 50 куб. см ацетонитрила и помещая каждый раз на 30 мин. на аппарат для встряхивания проб. Экстракт объединяют в концентраторе объемом 250 куб. см и выпаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре водяной бани не выше 35 °C.

К сухому остатку в концентраторе, полученному в п. 9.2.1, прибавляют 5 куб. см ацетонитрила и проводят очистку экстракта, как указано в п. 9.1.2.

Сухой остаток в концентраторе, полученный в п. 9.2.2, растворяют в 5 куб. см гексана, тщательно обмывая стенки концентратора, и наносят на заранее подготовленную колонку с Флоризилом. Затем колонку промывают 15 куб. см гексана, элюаты отбрасывают.

Проквиназид элюируют с колонки 15 куб. см смеси гексана с ацетоном в соотношении 4:1, элюат собирают в концентратор объемом 100 куб. см и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °C.

Сухой остаток в концентраторе растворяют в 10 куб. см ацетона и 1 куб. мм вводят в хроматограф.

Хроматограф газовый HP6890 Series GC System с детектором по захвату электронов (ЭЗД) в модификации с электронным управлением пневмонической системы (ЭУПС).

Колонка хроматографическая капиллярная кварцевая Rtx(R)-1 (100% диметилполисилоксана), длина 30 м, внутренний диаметр 0,25 мм, толщина пленки 0,25 мкм.

Температура детектора - 300 °C, поток обдува анода (азот) - 6,0 куб. см/мин., поток поддува - 58,5 куб. см/мин.

Температура испарителя - 270 °C, режим - Split, тип газа - гелий, давление - 25,65 psi, деление потока - 20:1, split поток - 29,8 куб. см/мин.

Программированный нагрев колонки с 220 °C (выдержка 1 мин.) по 10 град./мин. до 260 °C (выдержка 3 мин.), режим постоянный поток, поток колонки 1,5 куб. см/мин., средняя скорость 40 см/с.

Абсолютное время удерживания Проквиназида: 7,294 мин. +/- 3%.

Линейный диапазон детектирования сохраняется в пределах 0,02 - 0,2 нг.

Для обработки результатов хроматографического анализа используется программное обеспечение химического анализа HP GC ChemStation Rev. A.06.03RUS.

Альтернативная обработка результатов.

Содержание Проквиназида рассчитывают по формуле:

A - концентрация стандартного раствора, мкг/куб. см;

V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, куб. см;

m - масса анализируемого образца, г;

P - содержание Проквиназида в аналитическом стандарте, %.

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

Результат анализа представляют в виде:

где дельта - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

В случае, если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание вещества в пробе менее 0,01 мг/кг" <*>.

--------------------------------

<*> 0,01 мг/кг - предел обнаружения.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом добавок.

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):

R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

Российский государственный аграрный университет - МСХА им. К.А. Тимирязева.

Учебно-научный консультационный центр "Агроэкология пестицидов и агрохимикатов".

Методика прошла метрологическую экспертизу (Свидетельство об аттестации N 0049.27.09.10 от 06.10.2010 и внесена в Федеральный реестр (ФР.1.31.2010.09014).