"МУК 4.1.2988-12. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств флуроксипира в зеленой массе растений, зерне и масле кукурузы методом капиллярной газожидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 19.03.2012)

Свидетельство об аттестации от 25.07.2011 N 01.5.04.014/01.00043/2011.

Настоящие методические указания устанавливают метод капиллярной газожидкостной хроматографии для определения в зеленой массе растений, зерне и масле кукурузы массовой концентрации флуроксипира в диапазоне концентраций 0,01 - 0,08 мг/кг.

Название действующего вещества по номенклатуре ICO: флуроксипир.

Название по номенклатуре IUPAC: 4-амино-3,5-дихлор-6-фтор-2-пиридилоксиуксусная кислота.

Структурная формула:

Брутто формула: .

Молекулярная масса: 255,0.

Белое кристаллическое вещество, температура плавления - 232 - 233 °C. Давление пара (25 °C) 0,126 мПа . Растворимость (20 °C, в г/л): в воде - 0,091, метаноле - 43,7, ацетоне - 64,7, этилацетате - 11,8, ксилоле - 0,3.

(в мг/кг) для крыс > 5000. (в мг/л): для радужной форели и серебряного карпа - 0,7 (96 ч); для дафний > 0,5 (48 ч). для пчел > 0,1 мг/особь.

Гигиенические нормативы: ПДК в воде водоемов - 0,01 мг/дм3, ОДК в почве - 0,2 мг/кг, МДУ в зерне хлебных злаков, луке - 0,05 мг/кг.

Область применения: гербицид системного ауксиноподобного действия для послевсходовой некорневой обработки против широкого круга широколистных сорных растений (включая подмаренник цепкий и мокрицу-звездчатку) в зерновых, декоративных культурах; против многолетних сорных растений в плодовых садах (включая щавель, вьюнок и другие).

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений (табл. 1) для соответствующих диапазонов концентраций.

Метод основан на извлечении остаточных количеств флуроксипира из анализируемого объекта органическими растворителями, проведении очистки экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей и метилировании флуроксипира диазометаном. Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки с применением капиллярной газожидкостной хроматографии и использованием детектора электронного захвата.

Метод специфичен в присутствии других применяемых пестицидов. Проведение очистки экстрактов, а также использование капиллярной колонки и селективного детектора позволяет устранять влияние коэкстрактивных веществ на результаты анализа.

3.1. Средства измерения

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными характеристиками.

3.2. Реактивы

Примечание. Допускается использование реактивов с аналогичной квалификацией.

3.3. Вспомогательные устройства и материалы

Примечание. Допускается использование другого оборудования с аналогичными техническими характеристиками.

4.1. При проведении работы необходимо соблюдать правила техники безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими, легковоспламеняющимися веществами (ГОСТ 12.1.005, 12.1.007). Организация обучения работников по безопасности труда (ГОСТ 12.0.004).

При выполнении измерений с использованием газового хроматографа и работе с электроустановками соблюдать правила электробезопасности в соответствии с требованиями ГОСТ 12.1.019 и инструкциями по эксплуатации приборов.

4.2. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией, соответствовать требованиям пожарной безопасности (ГОСТ 12.1.004) и иметь средства пожаротушения (ГОСТ 12.4.009). Содержание вредных веществ в воздухе лабораторного помещения не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 "Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны".

Измерения может выполнять специалист-химик, имеющий опыт работы методом капиллярной газожидкостной хроматографии, ознакомленный с руководством по эксплуатации газового хроматографа, освоивший данный метод и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 13.

При выполнении измерения соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха лабораторного помещения (20 +/- 5) °C и относительной влажности воздуха не более 80%;

- выполнение измерения на газовом хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Отбор проб для анализа проводят в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" от 21.08.1979 N 2051-79.

8.1. Кондиционирование колонки

Капиллярную хроматографическую колонку устанавливают в газовый хроматограф и перед анализом кондиционируют при температуре 280 °C до установления нулевой линии.

8.2. Подготовка и очистка растворителей

Перед началом работы проверяют чистоту применяемых органических растворителей. Для этого 100 см3 растворителя упаривают в ротационном вакуумном испарителе при температуре 40 °C до объема 1,0 см3 и хроматографируют. При обнаружении мешающих определению примесей очистку растворителей производят в соответствии с общепринятыми методиками.

8.3. Приготовление эфирного раствора диазометана (из расчета метилирования экстрактов 2 проб)

N-Нитрозометилмочевину массой (0,5 +/- 0,01) г помещают во флакон объемом 2,0 - 3,0 см3 и герметизируют резиновой пробкой и колпачком с помощью приспособления для обжима колпачков на флаконах. В другой флакон объемом 5,0 см3 вносят диэтиловый эфир объемом 4,0 см3, герметизируют резиновой пробкой и колпачком и охлаждают в морозильной камере холодильника в течение 30 мин.

После этого флаконы через предварительно проколотые пробки соединяют гибкой тефлоновой трубкой (внутр. диам. ~ 1,5 - 2,0 мм), одним концом погружая ее в диэтиловый эфир на всю глубину (флакон с охлажденным диэтиловым эфиром обязательно должен еще иметь свободный выход в атмосферу). Во флакон с нитрозометилмочевиной, используя шприц с тонкой иглой и прокапывая пробку, добавляют по каплям по стенке 50% водный раствор гидроокиси калия (~ 0,3 см3) ДО прекращения реакции. Диэтиловый эфир при насыщении диазометаном окрашивается в ярко желтый цвет.

Внимание! Приготовление эфирного раствора диазометана и процедуру метилирования проводят в работающем вытяжном шкафу.

8.4. Приготовление градуировочных растворов

Основной раствор флуроксипира с содержанием 100 мкг/см3 готовят растворением в ацетоне 0,01 г аналитического стандарта флуроксипира в мерной колбе объемом 100 см3. Раствор хранят в холодильнике при температуре 4 - 6 °C не более трех месяцев.

Рабочие стандартные растворы с концентрациями 0,8, 0,4, 0,2 и 0,1 мкг/см3 готовят из основного стандартного раствора флуроксипира последовательным разбавлением ацетоном. Рабочие растворы хранят в холодильнике при температуре 4 - 6 °C не более месяца. В модельных опытах при изучении полноты извлечения флуроксипира используют ацетоновые растворы стандартного вещества.

Для приготовления градуировочных растворов в мерные пробирки со шлифом объемом 5,0 см3 вносят по 1,0 см3 рабочих растворов флуроксипира с концентрациями 0,1, 0,2, 0,4 и 0,8 мкг/см3. Растворитель в пробирках упаривают в токе азота досуха и проводят метилирование флуроксипира по п. 8.4.1.

8.4.1. Метилирование флуроксипира

В пробирки с сухим остатком добавляют по 2,0 см3 свежеприготовленного по п. 8.3 эфирного раствора диазометана. Пробирки закрывают пробками и ставят на 12 - 14 ч (на ночь) в холодильник с температурой 4 - 6 °C. После этого диэтиловый эфир в пробирках упаривают в токе азота досуха и сухой остаток растворяют в 2,0 см3 изооктана.

8.5. Построение градуировочной характеристики

Для построения градуировочного графика в инжектор хроматографа (п. 9.3) вводят по 1 мм3 приготовленных по пп. 8.4 и 8.4.1 растворов, содержащих флуроксипир (в виде производного) в концентрациях 0,1, 0,2, 0,4 и 0,8 мкг/см3. Осуществляют не менее трех параллельных измерений и находят среднее значение высоты (площади) хроматографического пика для каждой концентрации. Строят градуировочный график зависимости высоты (площади) хроматографического пика в мм (мм2) от концентрации флуроксипира в градуировочном растворе (мкг/см3). Градуировочную характеристику необходимо проверять при замене реактивов, хроматографической колонки или элементов хроматографической системы, изменении условий хроматографирования, а также при отрицательном результате контроля градуировочного коэффициента.

Градуировочную зависимость признают стабильной при выполнении следующего условия:

C - аттестованное значение массовой концентрации флуроксипира в градуировочном растворе,

- результат контрольного измерения массовой концентрации флуроксипира в градуировочном растворе,

- норматив контроля градуировочного коэффициента, % ( при P = 0,95).

8.6. Первичная обработка проб

Пробы растений кукурузы измельчают, зеленую массу перемешивают и выделяют аналитические пробы. Для длительного хранения аналитические пробы зеленой массы растений помещают в морозильную камеру с температурой -18 °C и хранят в закрытой стеклянной или полиэтиленовой таре.

Пробы зерна перед анализом рассыпают на бумаге или кальке и пинцетом удаляют включения. Зерно измельчают на лабораторной мельнице и после перемешивания измельченной массы готовят усредненные аналитические пробы.

Для исследовательских целей допускается получение в лаборатории масла из проб измельченного зерна методом экстракции органическими растворителями при температуре не выше 40 °C. Пробы масла хранят при 4 - 6 °C в закрытой стеклянной таре не более 30 сут.

9.1. Определение флуроксипира в зеленой массе и зерне кукурузы

Аналитическую пробу зеленой массы или зерна массой (10,0 +/- 0,1) г помещают в плоскодонную колбу объемом 300 см3, добавляют 150 см3 ацетона, слегка встряхивают и подвергают обработке в ультразвуковой ванне в течение 10 мин при комнатной температуре. После этого содержимое колбы фильтруют через бумажный фильтр "красная лента" в колбу-концентратор объемом 250 см3. Содержимое колбы с пробой промывают 50 см3 ацетона и также фильтруют в колбу-концентратор.

При использовании аппарата для встряхивания в плоскодонную колбу с аналитической пробой вносят 150 см3 ацетона и встряхивают в течение 60 мин. После этого содержимое колбы фильтруют через бумажный фильтр "красная лента" в колбу-концентратор объемом 250 см3. Содержимое колбы с пробой промывают 50 см3 ацетона и также фильтруют в колбу-концентратор.

Колбу-концентратор с объединенным экстрактом подсоединяют к ротационному вакуумному испарителю и упаривают растворитель до объема 10 - 20 см3 при температуре 40 °C. В колбу-концентратор добавляют 200 см3 дистиллированной воды, 2,0 см3 5,0%-го водного раствора серной кислоты и содержимое колбы перемешивают встряхиванием. Колбу-концентратор помещают в холодильник и выдерживают при температуре 4 - 6 °C в течение 4 - 5 ч. После этого содержимое колбы фильтруют через бумажный фильтр "белая лента" в делительную воронку объемом 500 см3. В воронку добавляют 10%-й водный раствор гидроокиси калия до pH 9 - 10, 30 см3 насыщенного водного раствора хлористого натрия и после перемешивания 75 см3 дихлорметана. Содержимое воронки энергично встряхивают в течение 2 мин. После 15-минутного отстаивания нижний дихлорметановый слой сливают и отбрасывают. Процедуру очистки экстракта повторяют с использованием 50 см3 дихлорметана. Далее в воронку добавляют 40 см3 насыщенного водного раствора хлористого натрия и после перемешивания 75 см3 н-гексана. Содержимое воронки энергично встряхивают в течение 2 мин. После 5-минутного отстаивания нижний ацетоно-водный слой сливают в химический стакан объемом 500 см3, а верхний гексановый слой сливают и отбрасывают.

Водный раствор пробы, находящийся в химическом стакане, подкисляют концентрированной серной кислотой до pH 2,0 и переносят в чистую делительную воронку объемом 500 см3. В воронку добавляют 75 см3 смеси н-гексан-диэтиловый эфир (50:50) и встряхивают в течение 2 мин. После полного разделения слоев нижний водный слой сливают в химический стакан, а верхний гексано-эфирный слой фильтруют через фильтр "синяя лента" со слоем безводного сульфата натрия (толщина слоя ~ 1,0 - 1,5 см) в колбу-концентратор объемом 250 см3. Экстрагирование и фильтрование повторяют с использованием 50 см3 смеси н-гексан-диэтиловый эфир (50:50). Нижний водный слой отбрасывают.

Колбу-концентратор с объединенным гексано-эфирным экстрактом подсоединяют к ротационному вакуумному испарителю и упаривают растворители при температуре 40 °C до объема 3 - 5 см3. Остаток экстракта количественно переносят в мерную пробирку со шлифом объемом 5,0 см3 и упаривают растворители в токе азота досуха при температуре 40 °C. Метилирование флуроксипира проводят по п. 8.4.1, а газохроматографический анализ - по п. 9.3.

9.2. Определение флуроксипира в масле кукурузы

Аналитическую пробу масла массой (10,0 +/- 0,1) г растворяют в 50 см3 н-гексана (насыщенного ацетонитрилом) в плоскодонной колбе объемом 100 см3 и после этого гексановый раствор масла переносят в делительную воронку объемом 250 см3. Колбу промывают 50 см3 ацетонитрила (насыщенного н-гексаном) и переносят его в воронку. Содержимое воронки встряхивают в течение 2 мин. После 5-минутного отстаивания нижний ацетонитрильный слой сливают в колбу-концентратор объемом 250 см3. Плоскодонную колбу промывают 25 см3 ацетонитрила (насыщенного н-гексаном) и также переносят в делительную воронку (250 см3). Содержимое воронки встряхивают в течение 2 мин, отстаивают 5 мин и нижний ацетонитрильный слой объединяют в колбе-концентраторе с предыдущим. Верхний гексановый слой отбрасывают.

Колбу-концентратор с объединенным ацетонитрильным экстрактом подсоединяют к ротационному вакуумному испарителю и упаривают растворитель досуха при температуре 50 °C. Сухой остаток растворяют в 20 см3 ацетона. К раствору добавляют 200 см3 дистиллированной воды, 2,0 см3 5,0%-го водного раствора серной кислоты и содержимое колбы перемешивают встряхиванием. Колбу-концентратор помещают в холодильник и выдерживают при температуре 4 - 6 °C в течение 4 - 5 ч. После этого содержимое колбы фильтруют через бумажный фильтр "белая лента" в делительную воронку объемом 500 см3. В воронку добавляют 10%-й водный раствор гидроокиси калия до pH 9 - 10, 30 см3 насыщенного водного раствора хлористого натрия и, после перемешивания, 75 см3 дихлорметана. Содержимое воронки энергично встряхивают в течение 2 мин. После 15-минутного отстаивания нижний дихлорметановый слой сливают и отбрасывают. Процедуру очистки экстракта повторяют с использованием 50 см3 дихлорметана. Далее в воронку добавляют 40 см3 насыщенного водного раствора хлористого натрия и, после перемешивания, 75 см3 н-гексана. Содержимое воронки энергично встряхивают в течение 2 мин. После 5-минутного отстаивания нижний ацетоно-водный слой сливают в химический стакан объемом 500 см3, а верхний гексановый слой сливают и отбрасывают.

Водный раствор пробы, находящийся в химическом стакане, подкисляют концентрированной серной кислотой до pH 2,0 и переносят в чистую делительную воронку объемом 500 см3. В воронку добавляют 75 см3 смеси н-гексан-диэтиловый эфир (50:50) и встряхивают в течение 2 мин. После полного разделения слоев нижний водный слой сливают в химический стакан, а верхний гексано-эфирный слой фильтруют через фильтр "синяя лента" со слоем безводного сульфата натрия (толщина слоя ~ 1,0 - 1,5 см) в колбу-концентратор объемом 250 см3. Экстрагирование и фильтрование повторяют с использованием 50 см3 смеси н-гексан-диэтиловый эфир (50:50). Нижний водный слой отбрасывают.

Колбу-концентратор с объединенным гексано-эфирным экстрактом подсоединяют к ротационному вакуумному испарителю и упаривают растворители при температуре 40 °C до объема 3 - 5 см3. Остаток экстракта количественно переносят в мерную пробирку со шлифом объемом 5,0 см3 и упаривают растворители в токе азота досуха при температуре 40 °C. Метилирование флуроксипира проводят по п. 8.4.1, а газохроматографический анализ - по п. 9.3.

9.3. Условия хроматографирования

Газовый хроматограф с детектором электронного захвата и хроматографической кварцевой капиллярной колонкой длиной 15 м, внутренним диаметром 0,32 мм с неподвижной фазой SE-52, толщина пленки 0,4 мкм.

Температура колонки: программирование от 120 (1 мин) до 280 °C (20 мин) со скоростью 8,0 °C/мин. Температура испарителя - 250 °C, детектора - 300 °C. Расход газов: газа-носителя (азот в/ч) - 1,5 см3/мин, дополнительного газа (азот в/ч) к детектору - 40 см3/мин. Пробы вводят в инжектор хроматографа в режиме разделения потока газа-носителя 1:10. Количество аликвоты, вводимое в хроматограф - 1 мкл. Время удерживания флуроксипира (в виде производного): (13,8 +/- 0,03) мин.

Количественное определение флуроксипира проводят методом абсолютной калибровки и вычисляют по формуле:

X - содержание флуроксипира в пробе, мг/кг;

- высота (площадь) пика анализируемого вещества, мм (мм2):

- высота (площадь) пика стандартного вещества, мм (мм2);

C - концентрация стандартного раствора флуроксипира, мкг/см3;

V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, см3;

P - масса (г) аналитической пробы.

Содержание остаточных количеств флуроксипира в анализируемом образце вычисляют как среднее из двух параллельных определений. При получении зашкаленных пиков анализируемый экстракт разбавляют изооктаном.

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

, - результаты параллельных определений, мг/кг;

r - значение предела повторяемости .

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

Результат анализа представляют в виде:

- среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

- граница абсолютной погрешности, мг/кг;

- граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

В случае, если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание вещества в пробе менее 0,01 мг/кг", где: 0,01 мг/кг - предел обнаружения флуроксипира в анализируемых объектах.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-02 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.

Величина добавки - должна удовлетворять условию:

- характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой, соответственно), мг/кг; при этом:

- граница абсолютной погрешности, мг/кг:

- граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

Результат контроля процедуры рассчитывают по формуле:

, X, - среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки, соответственно, мг/кг.

Норматив контроля K рассчитывают по формуле:

Проводят сопоставление результата контроля процедуры с нормативом контроля (K).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию

процедуру анализа признают удовлетворительной. При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры к их устранению.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):

, - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг:

R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций), %.

Долженко В.И., Тарарин П.А., Маханькова Т.А., Редюк С.И., Бурлакова Ю.В. (ГНУ ВИЗР Россельхозакадемии).

Методика прошла метрологическую экспертизу (Свидетельство об аттестации N 01.5.04.014/01.00043/2011) и внесена в Федеральный реестр (ФР.1.31.2011.10795).