"МУК 4.1.2861-11. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств Цимоксанила в томатном соке методом газожидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 31.03.2011)

1. Разработаны Российским государственным аграрным университетом - МСХА им. К.А. Тимирязева, Учебно-научным консультационным центром "Агроэкология пестицидов и агрохимикатов" Минсельхоза России.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 28.12.2010 N 3).

3. Утверждены руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 31 марта 2011 г.

4. Введены в действие с момента утверждения.

5. Введены впервые.

Свидетельство об аттестации методики от 01.12.2010 N 0064.30.11.10.

Настоящие Методические указания устанавливают метод газожидкостной хроматографии для определения уровня остаточных количеств Цимоксанила в томатном соке в диапазоне 0,05 - 0,5 мг/кг.

Структурная формула:

Молекулярная масса: 198,2.

Агрегатное состояние: кристаллическое вещество.

Цвет, запах: бесцветное вещество без запаха.

Температура плавления: 160 - 161 °С.

Давление паров: 0,15 мПа (при 20 °С).

Растворимость в воде, мг/куб. дм (при 20 °С и pH 5): 890.

Растворимость в органических растворителях (г/куб. дм, 20 °С): в гексане - 0,037; в толуоле - 5,29; в ацетонитриле - 57; в этилацетате - 28; в н-октаноле - 1,43; в метаноле - 22,9; в ацетоне - 62,4; в хлороформе - 103; в дихлорметане - 133,0.

В почве Цимоксанил быстро разрушается под действием микроорганизмов. В тепличных условиях период полураспада составляет около трех дней, в полевых условиях от 7 до 14 дней. Миграция по почвенному профилю слабая.

В растениях соединение быстро разрушается до нетоксичных метаболитов. Остатки Цимоксанила в клубнях картофеля не обнаруживаются. В ягодах винограда, по данным фирмы "Дюпон", остатки составляли ниже 0,2 мг/кг при обработке за несколько дней до уборки.

Область применения: Цимоксанил - контактный фунгицид с местным системным эффектом, обладающий защитным и лечащим действием. Высокоактивен против грибов, вызывающих фитофтороз и пероноспороз, не действует на возбудителей настоящей мучнистой росы. Длительность защитного действия составляет 4 - 6 дней, поэтому рекомендуется его использование в смеси с другими фунгицидами системного и защитного контактного действия.

Применяется в России в качестве фунгицида в составе смесевых препаратов на картофеле, томатах, виноградниках и подсолнечнике с нормой расхода 0,15 кг д.в./га, трехкратная обработка за сезон.

В России установлены следующие гигиенические нормативы:

- ДСД - 0,02 мг/кг массы человека;

- МДУ в продукции: картофель - 0,05 мг/кг, томаты и виноград - 0,1 мг/кг, подсолнечник (семена и масло) - 0,2 мг/кг, лук-репка - 0,5 мг/кг.

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций.

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительные интервалы среднего результата для полного диапазона концентраций (n = 20) приведены в табл. 2.

Метод основан на определении Цимоксанила методом газожидкостной хроматографии (ГЖХ) с использованием капиллярной колонки и термоионного детектора после его экстракции из образцов органическим растворителем, очистке перераспределением между двумя несмешивающимися фазами, очистке полученного экстракта от мешающих анализу веществ на колонке с Флоризилом и концентрирующих патронах Диапак С16.

Идентификация веществ проводится по времени удерживания, а количественное определение - методом абсолютной калибровки.

В предлагаемых условиях анализа метод специфичен и может применяться для определения остатков Цимоксанила в присутствии Фамоксадона. Избирательность метода достигается за счет подбора колонки и условий программирования.

Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Допускается использование реактивов иных производителей с аналогичными или лучшими характеристиками.

Допускается применение хроматографических колонок и другого оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на газовый хроматограф.

4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 "Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны". Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004.

К выполнению измерений и обработке их результатов допускаются специалисты, имеющие высшее или специальное химическое образование, опыт работы в химической лаборатории, прошедшие обучение и владеющие техникой проведения анализа, освоившие метод анализа в процессе тренировки и уложившиеся в нормативы контроля при проведении процедуры контроля погрешности анализа.

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °С, относительной влажности не более 80% и нормальном атмосферном давлении;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Выполнению измерений предшествуют следующие операции: очистка растворителей (при необходимости), приготовление растворов, кондиционирование хроматографической колонки, подготовка концентрирующих патронов Диапак С и Диапак С16 для очистки экстракта, проверка хроматографического поведения вещества на концентрирующих патронах Диапак С и Диапак С16, построение калибровочной кривой.

7.1.1. Очистка ацетонитрила

Ацетонитрил, содержащий воду, предварительно осушают, добавляя в него гранулированный безводный хлористый кальций из расчета не менее 100 г/куб. дм. Выдерживают его над осушителем в течение 5 - 6 ч. Затем ацетонитрил сливают с осушителя в круглодонную колбу со шлифом объемом 4000 куб. см от аппарата для перегонки растворителей.

Ацетонитрил перегоняют при температуре 81,5 °С, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше 81,5 °С, отбрасывают.

7.1.2. Очистка ацетона

Ацетон помещают в круглодонную колбу со шлифом объемом 4000 куб. см от аппарата для перегонки растворителей, добавляют к нему марганцовокислый калий из расчета 1 г/куб. дм.

Ацетон перегоняют при температуре 56,2 °С, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше 56,2 °С, отбрасывают.

7.1.3. Приготовление бидистиллированной воды

Дистиллят помещают в круглодонную колбу со шлифом объемом 4000 куб. см от аппарата для перегонки растворителей, добавляют к нему марганцовокислый калий из расчета 1 г/куб. дм и кипятят в течение 6 ч.

Собирают фракции, отогнанные при температуре 100,0 °С, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше 100,0 °С, отбрасывают.

7.2.1. Приготовление рабочих растворов

7.2.1.1. Приготовление подкисленного ацетонитрила.

К ацетонитрилу пипеткой добавляют концентрированную соляную кислоту до pH ~= 1. При приготовлении раствора соблюдать осторожность и работать под тягой.

7.2.1.2. Приготовление 2%-го раствора сульфата натрия.

В мерную колбу на 1000 куб. см переносят 20 г гидрокарбоната натрия, добавляют 200 - 300 куб. см дистиллированной воды, перемешивают до полного растворения и доводят водой объем в колбе до метки.

7.2.2. Приготовление градуировочных растворов

7.2.2.1. Стандартный раствор N 1 с концентрацией Цимоксанила 1,0 мг/куб. см.

Взвешивают 50 мг Цимоксанила в мерной колбе объемом 50 куб. см. Навеску растворяют в ацетоне и доводят объем до метки ацетоном. Полученный стандартный раствор N 1 используется для приготовления стандартных растворов для хроматографического исследования и построения калибровочной кривой. Раствор хранится в холодильнике около 120 суток.

7.2.2.2. Стандартный раствор N 2 с концентрацией Цимоксанила 10,0 мкг/куб. см.

Из стандартного раствора N 1 отбирают пипеткой 1 куб. см, помещают в мерную колбу объемом 100 куб. см и доводят объем до метки ацетоном. Стандартный раствор N 2 используется для приготовления стандартных растворов для построения калибровочной кривой и для внесения в контрольные образцы. Раствор может храниться в холодильнике не более 30 суток.

7.2.2.3. Стандартный раствор N 3 с концентрацией Цимоксанила 5,0 мкг/куб. см.

Из стандартного раствора N 2 отбирают пипеткой 5 куб. см, помещают в мерную колбу объемом 10 куб. см и доводят объем до метки ацетоном. Стандартный раствор N 3 используется для приготовления стандартных растворов для построения калибровочной кривой и для внесения в контрольные образцы. Раствор может храниться в холодильнике не более 30 суток.

7.2.2.4. Стандартный раствор N 4 с концентрацией Цимоксанила 2,5 мкг/куб. см.

Из стандартного раствора N 3 отбирают пипеткой 5 куб. см, помещают в мерную колбу объемом 10 куб. см и доводят объем до метки ацетоном. Стандартный раствор N 4 используется для построения калибровочной кривой и для внесения в контрольные образцы. Раствор может храниться в холодильнике не более 30 суток.

7.2.2.5. Стандартный раствор N 5 с концентрацией Цимоксанила 1,0 мкг/куб. см.

Из стандартного раствора N 2 отбирают пипеткой 1 куб. см, помещают в мерную колбу объемом 10 куб. см и доводят объем до метки ацетоном.

Стандартный раствор N 5 используется для построения калибровочной кривой и для внесения в контрольные образцы. Раствор может храниться в холодильнике не более 30 суток.

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади (высоты) пика от концентрации Цимоксанила в растворе (мкг/куб. см), устанавливают методом абсолютной калибровки по 4 растворам для градуировки с концентрацией 10,0; 5,0; 2,5 и 1,0 мкг/куб. см.

В испаритель хроматографа вводят по 1 куб. мм каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.2. Осуществляют не менее 5 параллельных измерений.

По полученным данным строят градуировочный график зависимости площади хроматографического пика (мВ) от концентрации Цимоксанила в растворе (мкг/куб. см).

7.4.1. Подготовка концентрирующих патронов Диапак С для очистки экстракта

Все процедуры происходят с использованием вакуума, скорость потока растворов через патрон не должна превышать 5 куб. см/мин.

Патрон Диапак С устанавливают на аллонж с отводом для вакуума, сверху в патрон вставляют шприц с разъемом типа Люер объемом не менее 10 куб. см (используют как емкость для элюентов).

Кондиционирование: концентрирующий патрон промывают 10 куб. см ацетона, затем 10 куб. см гексана. Элюаты отбрасывают.

7.4.2. Проверка хроматографического поведения Цимоксанила на концентрирующих патронах Диапак С

Из стандартного раствора Цимоксанила в ацетоне, содержащего 10,0 мкг/куб. см, отбирают 1 куб. см, помещают в концентратор объемом 100 куб. см и выпаривают на ротационном вакуумном испарителе досуха при температуре не выше 30 °С. Сухой остаток растворяют в 1 куб. см ацетона, тщательно обмывая стенки концентратора, прибавляют 9 куб. см гексана, перемешивают и вносят на патрон. Элюат собирают в концентратор объемом по 100 куб. см, выпаривают на ротационном вакуумном испарителе досуха при температуре не выше 30 °С, сухой остаток растворяют в 1 куб. см ацетона и 1 куб. мм пробы вводят в хроматограф.

Исходный концентратор обмывают последовательно 5 куб. см смеси ацетона с гексаном в соотношении 1:4, затем четырьмя порциями смеси ацетона с гексаном в соотношении 1:1 объемом 5 куб. см каждая, полученные растворы последовательно вносят на патрон. Элюаты после прохождения каждой порции элюентов собирают в отдельные концентраторы объемом по 100 куб. см, выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С, сухой остаток растворяют в 1 куб. см ацетона и хроматографируют.

Определяют фракции, содержащие Цимоксанил, полноту смывания с патрона и необходимый объем элюента.

Изучение поведения Цимоксанила на концентрирующих патронах Диапак С проводят каждый раз при отработке методики или поступлении новой партии концентрирующих патронов.

7.5.1. Подготовка концентрирующих патронов Диапак С16 для очистки экстракта

Все процедуры происходят с использованием вакуума, скорость потока растворов через патрон не должна превышать 5 куб. см/мин.

Патрон Диапак С16 устанавливают на аллонж с отводом для вакуума, сверху в патрон вставляют шприц с разъемом типа Люер объемом не менее 10 куб. см (используют как емкость для элюентов).

Кондиционирование: концентрирующий патрон промывают 10 куб. см ацетонитрила, затем 10 куб. см воды. Элюаты отбрасывают.

7.5.2. Проверка хроматографического поведения Цимоксанила на концентрирующих патронах Диапак С16

Из стандартного раствора Цимоксанила в ацетоне, содержащего 10,0 мкг/куб. см, отбирают 1 куб. см, помещают в концентратор объемом 100 куб. см и выпаривают на ротационном вакуумном испарителе досуха при температуре не выше 30 °С. Сухой остаток растворяют в 1 куб. см ацетонитрила, тщательно обмывая стенки концентратора, прибавляют 10 куб. см воды, перемешивают и вносят на патрон. Элюат собирают в концентратор объемом по 100 куб. см, выпаривают на ротационном вакуумном испарителе досуха при температуре не выше 30 °С, сухой остаток растворяют в 1 куб. см ацетона и 1 куб. мм пробы вводят в хроматограф.

Исходный концентратор обмывают последовательно четырьмя порциями смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:4 объемом 5 куб. см каждая, полученные растворы последовательно вносят на патрон. Элюаты после прохождения каждой порции элюентов собирают в отдельные концентраторы объемом по 100 куб. см, выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С, сухой остаток растворяют в 1 куб. см ацетона и хроматографируют.

Определяют фракции, содержащие Цимоксанил, полноту смывания с патрона и необходимый объем элюента.

Изучение поведения Цимоксанила на концентрирующих патронах Диапак С16 проводят каждый раз при отработке методики или поступлении новой партии концентрирующих патронов.

Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" от 21.08.1979 N 2051-79, а также в соответствии с ГОСТ Р 52183-2003 "Консервы. Соки овощные. Сок томатный. ТУ".

9.1.1. Экстракция

Навеску томатного сока массой 10 г помещают в делительную воронку объемом 250 куб. см, добавляют 10 куб. см насыщенного раствора хлорида натрия, перемешивают содержимое воронки, приливают 50 куб. см подкисленного ацетонитрила и встряхивают содержимое воронки в течение двух минут. После разделения фаз нижний слой сливают в стакан объемом 100 куб. см, а ацетонитрил пропускают через безводный сульфат натрия и собирают в концентратор объемом 250 куб. см. Водно-солевую фазу из стакана возвращают в делительную воронку и повторяют экстракцию Цимоксанила в подкисленный ацетонитрил еще 2 раза, используя каждый раз по 30 куб. см ацетонитрила и встряхивая смесь в течение двух минут. К объединенному ацетонитрильному экстракту приливают 20 куб. см дистиллированной воды и выпаривают до водного остатка на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.

9.1.2. Очистка экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей

К водному остатку в концентраторе, полученному по п. 9.1.1, прибавляют 50 куб. см 2%-го раствора сульфата натрия, тщательно обмывая стенки концентратора, и переносят смыв в делительную воронку объемом 250 куб. см. Затем концентратор обмывают еще 50 куб. см 2%-го раствора сульфата натрия и все смывы объединяют в делительной воронке.

Цимоксанил экстрагируют тремя порциями хлористого метилена объемом по 40, 30 и 30 куб. см, каждый раз встряхивая делительную воронку 2 мин. После полного разделения фаз в делительной воронке нижний слой (хлористый метилен) собирают в концентратор объемом 250 куб. см через слой безводного сульфата натрия. Осушитель обмывают 10 куб. см хлористого метилена, объединяют смыв с основным экстрактом и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.

Далее проводят очистку пробы на концентрирующих патронах Диапак С и Диапак С16.

9.1.3. Очистка экстракта на концентрирующих патронах Диапак С

Сухой остаток, полученный в п. 9.1.2, растворяют в 1 куб. см ацетона, тщательно обмывая стенки концентратора, прибавляют 9 куб. см гексана, перемешивают и вносят на заранее подготовленный концентрирующий патрон Диапак С, элюат отбрасывают. Исходный концентратор обмывают 5 куб. см смеси ацетона с гексаном в соотношении 1:4, элюат отбрасывают. Цимоксанил элюируют 15 куб. см смеси ацетона с гексаном в соотношении 1:1, элюат собирают в концентратор объемом 100 куб. см и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.

9.1.4. Очистка экстракта на концентрирующих патронах Диапак С16

Сухой остаток, полученный в п. 9.1.3, растворяют в 1 куб. см ацетонитрила, тщательно обмывая стенки концентратора, прибавляют 10 куб. см воды, перемешивают и вносят на заранее подготовленный концентрирующий патрон Диапак С16, элюат отбрасывают. Исходную колбу обмывают 15 куб. см смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:4 и вносят на патрон. Элюат собирают в концентратор объемом 100 куб. см и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.

Сухой остаток растворяют в 1 куб. см ацетона и 1 куб. мм пробы вводят в хроматограф.

Колонка хроматографическая капиллярная кварцевая НР-5 (5% дифенил и 95% диметилполисилоксан), длина 10 м, внутренний диаметр 0,53 мм, толщина пленки 2,7 мкм, фирма "HP".

Температура термостата колонки программированная. Начальная температура - 100 °С, выдержка 1 мин., нагрев колонки по 20 градусов в минуту до температуры 170 °С, а затем по 25 градусов в минуту до 200 °С.

Температура испарителя - 200 °С, температура детектора - 300 °С.

Газ 1 - гелий (газ-носитель), давление на входе - 6 кПа, линейная скорость - 22,984 см/с, давление на выходе - 101,3 кПа; поток через колонку - 2,504 куб. см/мин.; мертвое время - 0,73 мин.

Газ 2 - гелий, режим - Split less, деление потока - 1:30 (сброс пробы), начало сброса - 30 с, длительность сброса - 2 мин., расход во время анализа - 10 куб. см/мин.

Регулятор давления гелия - РРГ-10; регулятор расхода гелия - РРГ-11.

Газ 4 - азот (поддув в детектор), расход во время анализа - 30 куб. см/мин.

Газ 5 - водород, расход во время анализа - 12 куб. см/мин.

Газ 6 - воздух, расход - 200 куб. см/мин.

Продувка детектора и испарителя азотом после анализа - по 50 куб. см/мин. в течение 3 мин. при температуре колонки 250 °С. Расход газов: Г1 - 50; Г2 - 40; Г4 - 40 куб. см/мин.

Абсолютное время удерживания Цимоксанила: 6,01 +/- 2% мин.

Объем вводимой пробы: 1 куб. мм.

Линейный диапазон детектирования сохраняется в пределах 1,0 - 10,0 нг.

Содержание Цимоксанила в пробах пера и репки лука рассчитывают методом абсолютной калибровки по формуле:

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

Результат анализа представляют в виде:

где сигма - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

В случае если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание вещества в пробе менее 0,05 мг/кг" <*>.

--------------------------------

<*> 0,05 мг/кг - предел обнаружения.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом добавок.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):

Российский государственный аграрный университет - МСХА им. К.А. Тимирязева.

Учебно-научный консультационный центр "Агроэкология пестицидов и агрохимикатов". 127550, Москва, Тимирязевская ул., д. 53/1. Телефон: (495) 976-37-68, факс: (495) 976- 43-26.