"МУК 4.1.3020-12. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Измерение остаточных количеств мепикват хлорида в воде, почве, зеленой массе, зерне и соломе зерновых культур, семенах и масле рапса методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 03.07.2012)

Свидетельство о метрологической аттестации от 09.04.2012 N 01.5.04.072/01.00043/2012.

Настоящие методические указания устанавливают метод измерения массовой доли мепикват хлорида в воде в диапазоне 0,001 - 0,01 мг/куб. дм, в почве - 0,025 - 0,25 мг/кг, в зерне зерновых, семенах и масле рапса в диапазоне концентраций - 0,02 - 0,2 мг/кг, в зеленой массе и соломе зерновых - 0,05 - 0,5 мг/кг.

Название действующего вещества по ICO: мепикват хлорид.

Название действующего вещества по IUPAC: 1,1-диметилпиперидин.

Структурная формула:

Растворимость в воде при 20 °С > 50% (вес.); в органических растворителях (г/100 мл при 20 °С) - в метаноле 48,7, n-октаноле - 0,962, ацетонитриле - 0,280, дихлорметане - 0,051, ацетоне - 0,002, в толуоле, n-гептане и этилацетате - < 0,001.

Стабилен в водных растворах (30 дней при pH 3, 5, 7 и 9, 25 °С). Стабилен при воздействии солнечного света.

Краткая токсикологическая характеристика

Область применения препарата - регулятор роста растений.

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности Р = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций.

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для полного диапазона концентраций (n = 20) приведены в табл. 2.

Методика основана на определении мепикват хлорида методом ВЭЖХ с масс-спектрометрическим детектированием после его извлечения из образцов органическим растворителем с последующей очисткой на патронах с оксидом алюминия. Мепикват хлорид идентифицируют по абсолютному времени удерживания. Массовую концентрацию мепикват хлорида в пробе определяют в режиме автоматической обработки данных по построенной ранее градуировочной характеристике.

Избирательность метода определения мепикват хлорида достигается сочетанием условий подготовки проб и хроматографического анализа с масс-спектрометрическим детектированием.

Примечание. Допускается использование средств измерения иных производителей с аналогичными или лучшими характеристиками.

Примечание. Допускается использование реактивов иных производителей с более высокой квалификацией, не требующих дополнительной очистки растворителей.

Примечание. Допускается применение оборудования иных производителей с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (от 21.08.79 N 2051-79), а также в соответствии с ГОСТ Р 51592-2000 "Вода. Общие требования к отбору проб"; ГОСТ Р 50436-92 (ИСО 950-79) "Зерновые. Отбор проб зерна"; ГОСТ 28168-89 "Почвы. Отбор проб"; ГОСТ 10852-86 "Семена масличные. Правила приемки и методы отбора проб". Пробы зерна и соломы для определения остатков в урожае хранят в бумажной или тканевой упаковке при комнатной температуре. Семена рапса хранят при комнатной температуре в полотняных мешочках, перед анализом доводят до стандартной влажности и измельчают. Растительное масло хранят в холодильнике при температуре 0 - 4 °С в герметично закрытой стеклянной таре в течение 2 месяцев. Для длительного хранения пробы почвы подсушиваются при комнатной температуре в отсутствие прямого солнечного света. Сухие почвенные образцы могут храниться в течение года. Перед анализом сухую почву доводят до стандартной влажности, просеивают через сито с отверстиями диаметром 1 мм, зерно и солому измельчают на лабораторных мельницах.

Перед началом работы проверяют чистоту применяемых органических растворителей. Для этого 100 куб. см растворителя упаривают в ротационном вакуумном испарителе при температуре 40 °С до объема 1,0 куб. см и хроматографируют. При обнаружении мешающих определению примесей очистку растворителей производят в соответствии с общепринятыми методиками.

Перед началом анализа колонку (Zorbax Eclipse XDB-C18) кондиционируют в потоке подвижной фазы (0,6 куб. см/мин.) до стабилизации нулевой линии в течение 1 - 2 ч.

Раствор 2М HCl: в мерную колбу на 1000 куб. см вносят 197 г 36%-ной соляной кислоты, добавляют бидистиллированную воду до метки и перемешивают.

Раствор 6М HCl: в мерную колбу на 1000 куб. см вносят 605 г 36%-ной соляной кислоты, добавляют бидистиллированную воду до метки и перемешивают.

Смесь 6М HCl-MeOH (9:1): в конической колбе на 1000 куб. см вносят 900 куб. см 6М соляной кислоты и добавляют 100 куб. см метанола.

Экстрагент N 1: в колбе на 1000 куб. см смешивают 650 куб. см бидистиллированной воды, 350 куб. см метанола и 50 куб. см 2М HCl.

Элюент N 1 для очистки на патроне: в колбе на 500 куб. см смешивают 100 куб. см метанола с 400 куб. см ацетонитрила (1:4), элюента N 2 - смешивают 50 куб. см метанола с 450 куб. см ацетонитрила (1:9).

Раствор гидроксида натрия 1М: в мерную колбу на 100 куб. см помещают 4 г гидроксида натрия, растворяют в 100 куб. см дистиллированной воды, доводят водой до метки и перемешивают.

Подвижная фаза А: в мерную колбу на 1000 куб. см помещают 1000 куб. см бидистиллированной деионизованной воды, затем микродозатором вносят 1 куб. см муравьиной кислоты.

Подвижная фаза Б: в мерную колбу на 1000 куб. см помещают 1000 куб. см метилового спирта, затем микродозатором вносят 1 куб. см муравьиной кислоты.

Смесь метанола с ацетонитрилом: в колбе на 100 куб. см с помощью мерных цилиндров смешивают 20 куб. см метанола с 80 куб. см ацетонитрила (смесь 1:4) и 10 куб. см метанола с 90 куб. см ацетонитрила (смесь 1:9).

Основной раствор мепикват хлорида с массовой концентрацией 10 мкг/куб. см.

Точную навеску мепикват хлорида массой (10 +/- 0,1) мг помещают в мерную колбу вместимостью 100 куб. см и добавляют около 90 куб. см бидистиллированной воды. Содержимое колбы тщательно перемешивают, выдерживают 20 мин. при температуре 20 °С, после чего добавляют воду до метки. Затем 10 куб. см полученного раствора с концентрацией 100 мкг/куб. см вносят в мерную колбу на 100 куб. см и доводят до метки бидистиллированной водой - получен основной раствор с концентрацией 10 мкг/куб. см.

Градуировочные растворы с концентрациями 1,0; 5,0; 10,0; 15,0; 20,0 и 25,0 нг/куб. см готовят из основного раствора методом последовательного разбавления, используя подвижную фазу А.

Раствор N 1 с концентрацией мепикват хлорида 25 нг/куб. см: в мерную колбу вместимостью 100 куб. см вносят 0,25 куб. см основного раствора и доводят объем до метки подвижной фазой А.

Раствор N 2 с концентрацией мепикват хлорида 20 нг/куб. см: в мерную колбу вместимостью 100 куб. см вносят 0,2 куб. см основного раствора и доводят объем до метки подвижной фазой А.

Раствор N 3 с концентрацией мепикват хлорида 15 нг/куб. см: в мерную колбу вместимостью 100 куб. см вносят 0,15 куб. см основного раствора и доводят объем до метки подвижной фазой А.

Раствор N 4 с концентрацией мепикват хлорида 10 нг/куб. см: в мерную колбу вместимостью 10 куб. см вносят 5,0 куб. см раствора N 2 и доводят объем до метки подвижной фазой А.

Раствор N 5 с концентрацией мепикват хлорида 5 нг/куб. см: в мерную колбу вместимостью 10 куб. см вносят 5,0 куб. см раствора N 4 и доводят объем до метки подвижной фазой А.

Раствор N 6 с концентрацией мепикват хлорида 1 нг/куб. см: в мерную колбу вместимостью 10 куб. см вносят 1 куб. см раствора N 4 и доводят объем до метки подвижной фазой А.

Основной и градуировочные растворы можно хранить в холодильнике при температуре 0 - 4 °С в течение месяца.

Для внесения в контрольный образец при определении полноты извлечения используют основной раствор, разбавленный ацетонитрилом до нужного уровня концентраций методом последовательного разбавления. Растворы для внесения в масло готовят из основного раствора с концентрацией 100 мкг/куб. см методом последовательного разбавления по объему изопропиловым спиртом.

В режиме автоматической обработки данных строят градуировочную характеристику (площадь пика - концентрация мепикват хлорида в растворе). Для этого в хроматограф вводят по 10 куб. мм градуировочных растворов (не менее 3 параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4 точек по диапазону измеряемых концентраций).

Градуировочную характеристику необходимо проверять при замене реактивов, хроматографической колонки или элементов хроматографической системы, а также при отрицательном результате контроля градуировочного коэффициента:

где - норматив контроля градуировочного коэффициента, %. ( = 10% при Р = 0,95).

В картридж емкостью 10 куб. см для твердофазной экстракции вносят 2,5 г оксида алюминия 2-й степени активности и уплотняют центрифугированием 10 мин. при 8000 об./мин.

Оксид алюминия готовят в день использования и хранят в эксикаторе.

Установка и подготовка всех приборов и средств измерения проводится в соответствии с требованиями технической документации.

Подщелачивают 25 куб. см воды 1М раствором гидроксида натрия до pH 9 и пропускают через картридж с силикагелем (Диапак С) со скоростью 3 - 4 куб. см/мин. Мепикват хлорид элюируют 5 куб. см смеси 6М HCl-MeOH (9:1). Элюат выпаривают досуха. Сухой остаток растворяют в 5 куб. см смеси (метиловый спирт:подвижная фаза А в соотношении 1:9) и 10 куб. мм раствора вводят в жидкостный хроматограф.

Навеску почвы (5 +/- 0,1) г помещают в коническую колбу емкостью 250 куб. см и добавляют 50 куб. см дистиллированной воды. После перемешивания на аппарате для встряхивания в течение 5 мин. в почвенную вытяжку добавляют карбонат магния до получения нейтральной реакции. В полученную смесь добавляют 100 куб. см хлористого метилена и тщательно встряхивают. Затем ее выдерживают в ультразвуковой ванне в течение 10 мин. и декантируют в делительную воронку на 250 куб. см через стеклянную воронку с ватным фильтром. После разделения фаз нижний слой переносят в другую делительную воронку (верхний слой отбрасывают), добавляют к нему 50 куб. см разбавленной соляной кислоты (125 куб. см кислоты и 825 куб. см воды) и энергично встряхивают в течение 1 мин. После разделения слоев водную фазу (верхний слой) собирают в колбу емкостью 100 куб. см. К органической фазе (оставшийся нижний слой) повторно добавляют 50 куб. см разбавленной соляной кислоты. После разделения слоев водную фазу собирают в ту же колбу, органическую фазу отбрасывают. Из объединенной водной фазы (100 куб. см) отбирают аликвоту 2 куб. см (1/50 экстракта) и упаривают ее на ротационном испарителе при температуре водяной бани 70 °С. Дальнейшую очистку проводят на патронах с оксидом алюминия по п. 6.7.

Навеску измельченного зерна массой (5 +/- 0,05) г помещают в коническую колбу емкостью 250 куб. см и экстрагируют мепикват хлорид 100 куб. см экстрагента N 1 (вода - метанол - 2М HCl в соотношении 65:30:5) в ультразвуковой ванне в течение 10 мин. Затем в колбу добавляют 100 куб. см бидистиллированной воды и энергично встряхивают колбу в течение 1 мин. Отбирают из колбы в пробирку 10 куб. см смеси и центрифугируют 5 мин. при 4000 об./мин. Затем отбирают из пробирки 4,0 куб. см супернатанта и выпаривают до сухого остатка на роторном испарителе при 70 °С. Дальнейшую очистку проводят на патронах с оксидом алюминия по п. 6.7.

Навеску измельченной зеленой массы или соломы массой (5 +/- 0,05) г помещают в коническую колбу емкостью 250 куб. см и экстрагируют мепикват хлорид 100 куб. см экстрагента N 1 (вода - метанол - 2М HCl в соотношении 65:30:5) в ультразвуковой ванне в течение 10 мин. Затем в колбу добавляют 100 куб. см бидистиллированной воды и энергично встряхивают колбу в течение 1 мин. Отбирают из колбы в пробирку 10 куб. см смеси и центрифугируют 5 мин. при 4000 об./мин. Затем отбирают из пробирки 2,5 куб. см супернатанта и выпаривают до сухого остатка на роторном испарителе при 70 °С. Дальнейшую очистку проводят на патронах с оксидом алюминия по п. 6.7.

Навеску измельченных семян массой (5 +/- 0,05) г помещают в коническую колбу емкостью 250 куб. см и экстрагируют мепикват хлорид 100 куб. см экстрагента N 1 (вода - метанол - 2М HCl в соотношении 65:30:5) в ультразвуковой ванне в течение 10 мин. Затем в колбу добавляют 100 куб. см бидистиллированной воды и энергично встряхивают колбу в течение 1 мин. Отбирают из колбы в пробирку 10 куб. см смеси и центрифугируют 5 мин. при 4000 об./мин. Затем отбирают из пробирки 2,0 куб. см супернатанта и выпаривают до сухого остатка на роторном испарителе при 70 °С. Дальнейшую очистку проводят на патронах с оксидом алюминия по п. 6.7.

Навеску масла массой (5 +/- 0,05) г помещают в коническую колбу емкостью 250 куб. см и экстрагируют мепикват хлорид 100 куб. см экстрагента N 1 (вода - метанол - 2М HCl в соотношении 65:30:5) на ультразвуковой установке в течение 10 мин. Смесь помещают в делительную воронку емкостью 250 куб. см и промывают двумя порциями хлористого метилена по 50 куб. см, встряхивая смесь каждый раз в течение 2 - 3 мин. и собирая нижний водный слой. К водной фазе добавляют 100 куб. см бидистиллированной воды и энергично встряхивают в течение 1 мин. Аликвоту полученного водного экстракта 2,0 куб. см выпаривают досуха на роторном испарителе при 70 °С.

Дальнейшую очистку проводят на патронах с оксидом алюминия по п. 6.7.

Сухой остаток в колбе, полученный при упаривании экстрактов по пп. 6.2 - 6.6, растворяют в 1 куб. см метанола в ультразвуковой ванне в течение 0,5 мин. и добавляют 4 куб. см ацетонитрила. Полученный раствор количественно переносят в подготовленный картридж для твердофазной экстракции и дают ему впитаться. Промывают картридж 1 раз 5 куб. см смеси метанол - ацетонитрил (1:4), затем 3 раза по 5 куб. см смесью метанол - ацетонитрил (1:9). Элюат от 4 промывок собирают в грушевидную колбу емкостью 100 куб. см. Раствор упаривают досуха на вакуумном ротационном испарителе при температуре не выше 40 °С. Сухой остаток растворяют в 1 куб. см смеси метиловый спирт: подвижная фаза А (1:9, по объему) и 10 куб. мм раствора вводят в жидкостный хроматограф.

Колонка: Zorbax Eclipse XDB-C18 (150 х 4,6) мм, 5 мкм.

Температура термостата колонки (30 +/- 1) °С.

Подвижная фаза А: вода + муравьиная кислота (1000 + 1, v/v).

Подвижная фаза Б: метанол + муравьиная кислота (1000 + 1, v/v).

Скорость потока элюента: 0,4 мл/мин.

Объем вводимой пробы 10 куб. мм.

Режим элюирования: градиентный.

Анализ проводят в тех же условиях, в которых проводили градуировку прибора.

Каждый раствор хроматографируют не менее 2 раз (параллельные определения). Растворы анализируют непосредственно друг за другом.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор мепикват хлорида 25 нг/куб. см, разбавляют подвижной фазой А для ВЭЖХ.

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предел повторяемости:

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

Результат анализа представляют в виде:

где:

Х - среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

- граница абсолютной погрешности, мг/кг:

где - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

В случае если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание вещества в пробе "менее нижней границы определения" (например: менее 0,02 мг/кг <*>, где "<*>" - 0,02 мг/кг - предел обнаружения мепикват хлорида в зерне)".

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

10.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

10.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.

где - характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой соответственно), мг/кг, при этом:

где - граница абсолютной погрешности, мг/кг:

где - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры к их устранению.

10.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предел воспроизводимости (R):

11.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-2009, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф с масс-спектрометрическим детектором.

11.2. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией, соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленные ГН 2.2.5.1313-03 и 2.2.5.2308-07.

Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004-90.

Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист-химик, имеющий опыт работы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием, ознакомленный с руководством по эксплуатации прибора, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 10.

ГНУ "Всероссийский научно-исследовательский институт защиты растений" Россельхозакадемии, Санкт-Петербург.

ФГУП "Всероссийский научно-исследовательский институт метрологии им. Д.И. Менделеева", Санкт-Петербург.