"МУК 4.1.2777-10. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств Фамоксадона в луке-перо и луке-репке методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 24.11.2010)

1. Разработаны Российским государственным аграрным университетом МСХА им. К.А. Тимирязева, Учебно-научным консультационным центром "Агроэкология пестицидов и агрохимикатов" Минсельхоза России.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 14.10.2010 N 2).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 24 ноября 2010 г.

4. Введены в действие с момента утверждения.

5. Введены впервые.

Свидетельство об аттестации методики N 0030.28.05.10 от 31.05.2010.

Настоящие Методические указания устанавливают метод высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения уровня остаточных количеств Фамоксадона в луке-перо и репке-луке в диапазоне 0,05 - 0,5 мг/кг.

Название действующего вещества по ИЮПАК:

3-анилино-5-метил-5-(4-феноксифенил)-2,4-оксазолидиндион.

Структурная формула (не приводится).

Молекулярная масса: 374,4.

Агрегатное состояние: порошок.

Цвет, запах: светлый кремовый без запаха.

Область применения: Фамоксадон - фунгицид контактного действия из группы оксазолидиндионов. Является ингибитором митохондриального дыхания, высокоэффективен против широкого спектра патогенных грибов с рекомендуемой нормой расхода 50 - 200 г/га.

Применяется против фитофтороза и альтернариоза на картофеле с нормой расхода 0,15 кг д.в./га, также предлагается для применения на томатах, подсолнечнике, луке и виноградниках.

В России для Фамоксадона установлены следующие гигиенические нормативы: ДСД - 0,01 мг/кг массы тела человека; ОДК в почве - 0,1 мг/кг; ПДК в воде (общ.) - 0,01 мг/куб. дм; ОБУВ воздухе рабочей зоны - 1,0 мг/куб. м; ОБУВ в атмосферном воздухе - 0,01 мг/куб. м; МДУ в картофеле - 0,05 мг/кг; в томатах - 0,2 мг/кг; в винограде - 0,25 мг/кг; в семенах и масле подсолнечника - 0,1 мг/кг, луке-репке - 1,0 мг/кг.

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций.

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительные интервалы среднего результата для полного диапазона концентраций (n = 20) приведены в табл. 2.

Метод основан на определении Фамоксадона с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием ультрафиолетового детектора после его экстракции из образцов органическим растворителем, очистки экстракта перераспределением между двумя несмешивающимися фазами на колонках с Флоризилом и на колонках с окисью алюминия.

Идентификация веществ проводится по времени удерживания, а количественное определение - методом абсолютной калибровки.

В предлагаемых условиях анализа метод специфичен. Специфичность обеспечивается подбором состава подвижной фазы и выбором колонок различной полярности.

Допускается использование средств измерений с аналогичными или лучшими характеристиками.

Допускается использование реактивов иных производителей с аналогичными или лучшими характеристиками.

Допускается использование оборудования с аналогичными или лучшими характеристиками.

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на газовый хроматограф.

4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 "Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны". Организация обучения работников безопасности труда по ГОСТ 12.0.004.

К выполнению измерений допускают специалистов, имеющих квалификацию не ниже лаборанта-исследователя, с опытом работы на жидкостном хроматографе.

К проведению пробоподготовки допускают оператора с квалификацией "лаборант", имеющего опыт работы в химической лаборатории.

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °С и относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Выполнению измерений предшествуют следующие операции: очистка растворителей (при необходимости), приготовление растворов, кондиционирование хроматографической колонки, подготовка колонок с Флоризилом и колонок с окисью алюминия для очистки экстракта, проверка хроматографического поведения вещества на колонках с Флоризилом и на колонках с окисью алюминия, установление градуировочной характеристики.

7.1.1. Очистка ацетона

Ацетон помещают в круглодонную колбу со шлифом объемом 4000 куб. см от аппарата для перегонки растворителей, добавляют к нему марганцовокислый калий из расчета 1 г/куб. дм.

Ацетон перегоняют при температуре 56,2 °С, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше 56,2 °С, отбрасывают.

7.1.2. Очистка ацетонитрила

Ацетонитрил, содержащий воду, предварительно осушают, добавляя в него гранулированный безводный хлористый кальций из расчета не менее 100 г/куб. дм. Выдерживают его над осушителем в течение 5 - 6 часов. Затем ацетонитрил сливают с осушителя в круглодонную колбу со шлифом объемом 4000 куб. см аппарата для перегонки растворителей.

Ацетонитрил перегоняют при температуре 81,5 °С, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше 81,5 °С, отбрасывают.

7.1.3. Приготовление бидистиллированной воды

Дистиллят помещают в круглодонную колбу со шлифом объемом 4000 куб. см от аппарата для перегонки растворителей, добавляют к нему марганцовокислый калий из расчета 1 г/куб. дм и кипятят в течение 6 часов. Собирают фракции, отогнанные при температуре 100,0 °С, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше 100,0 °С, отбрасывают.

7.2.1. Приготовление рабочих растворов

7.2.1.1. Приготовление 2%-ного раствора сульфата натрия.

20 г безводного сульфата натрия переносят в мерную колбу на 1000 куб. см, добавляют 200 - 300 куб. см дистиллированной воды, перемешивают до полного растворения и доводят водой объем в колбе до метки.

7.2.1.2. Приготовление 0,1%-ного раствора калия марганцовокислого.

1 г калия марганцовокислого переносят в мерную колбу на 1000 куб. см, добавляют 200 - 300 куб. см дистиллированной воды, перемешивают до полного растворения и доводят водой объем в колбе до метки.

7.2.2. Приготовление растворов для жидкостной хроматографии

Для приготовления подвижной фазы используют свежеперегнанный ацетонитрил и 3,1 мМ раствор ортофосфорной кислоты.

7.2.2.1. Приготовление 3,1 мМ раствора ортофосфорной кислоты.

Мерной пипеткой отбирают 0,42 куб. см концентрированной (85%-ной) ортофосфорной кислоты и осторожно переносят в мерную колбу объемом 2000 куб. см, куда предварительно наливают около 500 куб. см очищенной воды. Затем раствор перемешивают и доводят водой объем в колбе до метки (при приготовлении раствора соблюдать осторожность и работать под тягой).

7.2.2.2. Приготовление подвижной фазы для ВЭЖХ.

В плоскодонную колбу объемом 1000 куб. см помещают 650 куб. см ацетонитрила и 350 куб. см 3,1 мМ раствора ортофосфорной кислоты в очищенной воде. Смесь тщательно перемешивают, пропускают через нее газообразный гелий со скоростью 20 куб. см/мин. в течение 5 минут, после чего помещают в ультразвуковую ванну для удаления растворенных газов на 1 минуту.

7.2.3. Приготовление градуировочных растворов

7.2.3.1. Стандартный раствор N 1 с концентрацией Фамоксадона 1,0 мг/куб. см.

Взвешивают 50 мг Фамоксадона в мерной колбе объемом 50 куб. см. Навеску растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки ацетонитрилом. Полученный стандартный раствор N 1 используется для приготовления стандартных растворов для хроматографического исследования и построения калибровочной кривой.

7.2.3.2. Стандартный раствор N 2 с концентрацией Фамоксадона 10,0 мкг/куб. см.

Из стандартного раствора N 1 отбирают пипеткой 1 куб. см, помещают в мерную колбу объемом 100 куб. см и доводят объем до метки ацетонитрилом. Стандартный раствор N 2 используется для приготовления стандартных растворов для построения калибровочной кривой.

7.2.3.3. Стандартный раствор N 3 с концентрацией Фамоксадона 5,0 мкг/куб. см.

Из стандартного раствора N 2 отбирают пипеткой 1 куб. см, помещают в мерную колбу объемом 10 куб. см и доводят объем до метки ацетонитрилом. Стандартный раствор N 3 используется для построения калибровочной кривой.

7.2.3.4. Стандартный раствор N 4 с концентрацией Фамоксадона 0,5 мкг/куб. см.

Из стандартного раствора N 3 отбирают пипеткой 5 куб. см, помещают в мерную колбу объемом 10 куб. см и доводят объем до метки ацетонитрилом. Стандартный раствор N 4 используется для построения калибровочной кривой.

7.2.3.5. Стандартный раствор N 5 с концентрацией Фамоксадона 0,2 мкг/куб. см.

Из стандартного раствора N 2 отбирают пипеткой 1 куб. см, помещают в мерную колбу объемом 50 куб. см и доводят объем до метки ацетонитрилом. Стандартный раствор N 5 используется для построения калибровочной кривой.

7.2.3.6. Стандартный раствор N 6 с концентрацией Фамоксадона 0,1 мкг/куб. см.

Из стандартного раствора N 2 отбирают пипеткой 1 куб. см, помещают в мерную колбу объемом 100 куб. см и доводят объем до метки ацетонитрилом. Стандартный раствор N 6 используется для построения калибровочной кривой.

7.2.3.7. Стандартные растворы Фамоксадона с концентрацией 5,0; 2,0; 1,0; и 0,5 мкг/куб. см для внесения в образцы.

Методом последовательного разведения ацетонитрилом готовят растворы, содержащие по 5,0; 2,0; 1,0; и 0,5 мкг/куб. см, и используют эти растворы для внесения в контрольные образцы.

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади (высоты) пика от концентрации Фамоксадона в растворе (мкг/куб. см), устанавливают методом абсолютной калибровки по 4-м растворам для градуировки с концентрацией 1,0; 0,5; 0,2 и 0,1 мкг/куб. см.

В инжектор хроматографа вводят по 20 куб. мм каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.2. Осуществляют не менее 5-ти параллельных измерений.

7.4.1. Подготовка колонки с окисью алюминия для очистки экстракта

В пластиковую или стеклянную колонку диаметром 15 мм помещают 3 г окиси алюминия с зернением 40/250 меш и, аккуратно постукивая по стенкам колонки, формируют слой адсорбента. Непосредственно перед использованием колонку промывают 10 куб. см ацетонитрила.

7.4.2. Проверка хроматографического поведения Фамоксадона на колонке с окисью алюминия

В концентратор объемом 100 куб. см вносят 1 куб. см стандартного раствора Фамоксадона в ацетонитриле с концентрацией 1,0 мкг/куб. см и выпаривают его досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С. Сухой остаток растворяют в 10 куб. см ацетонитрила, тщательно обмывают стенки концентратора и наносят на подготовленную колонку. Элюат собирают в концентратор и выпаривают досуха при температуре не выше 30 °С. Исходную колбу обмывают еще двумя порциями ацетонитрила объемом по 10 куб. см каждая и последовательно вносят их на колонку. Каждую порцию собирают отдельно в концентраторы и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.

Сухой остаток каждой фракции растворяют в 2 куб. см ацетонитрила и 20 куб. мм пробы вводят в хроматограф.

Определяют фракции, содержащие Фамоксадон, полноту смывания с колонки и необходимый объем элюата.

Изучение поведения Фамоксадона на колонке проводят каждый раз при отработке методики или поступлении новой партии окиси алюминия.

7.5.1. Подготовка колонки с Флоризилом для очистки экстракта

В пластиковую или стеклянную колонку диаметром 15 мм помещают 4 г Флоризила с зернением 60/100 меш и, аккуратно постукивая по стенкам колонки, формируют слой адсорбента. На слой Флоризила наносят слой безводного сернокислого натрия толщиной 1 см.

Непосредственно перед использованием колонку промывают 10 куб. см смеси гексан - этилацетат в соотношении 2:1, избыток растворителя с колонки удаляют путем продавливания воздуха. Затем колонку дополнительно промывают 10 куб. см гексана. Перед внесением экстракта на колонку ее промывают дополнительно 5 куб. см гексана.

7.5.2. Проверка хроматографического поведения Фамоксадона на колонке с Флоризилом

В концентратор объемом 100 куб. см вносят 1 куб. см стандартного раствора Фамоксадона в ацетонитриле с концентрацией 1,0 мкг/куб. см и выпаривают его досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С. Сухой остаток растворяют в 0,5 куб. см этилацетата, тщательно обмывают стенки концентратора, затем добавляют в колбу 5 куб. см гексана и полученную смесь вносят на колонку. Элюат собирают в концентратор и выпаривают досуха при температуре не выше 30 °С. Исходную колбу обмывают 15 куб. см смеси гексана с этилацетатом в соотношении 10:1 и вносят на колонку. Затем колонку последовательно промывают тремя порциями смеси гексана с этилацетатом в соотношении 2:1 объемом 10 куб. см каждая. Каждую порцию собирают отдельно в концентраторы и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.

Сухой остаток после упаривания каждой фракции растворяют в 2 мл ацетонитрила и 20 куб. мм пробы вводят в хроматограф.

Определяют фракции, содержащие Фамоксадон, полноту смывания с колонки и необходимый объем элюата.

Изучение поведения Фамоксадона на колонке проводят каждый раз при отработке методики или поступлении новой партии Флоризила.

Хроматографическую колонку Symmetry Shield RP18 с предколонкой Symmetry C8 устанавливают в термостате хроматографа и стабилизируют при температуре 30 °С и скорости потока подвижной фазы 1 куб. см/мин. 3 - 4 часа.

Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (N 2051-79 от 21.08.1979), а также в соответствии с ГОСТ Р 51783-2001 "Лук репчатый свежий, реализуемый в розничной торговой сети. ТУ".

Пробы целого растения лука и репки лука хранят в холодильнике в полиэтиленовых пакетах при температуре 0 - 4 °С не более суток. Для длительного хранения пробы замораживают и хранят в полиэтиленовой таре в морозильнике при температуре -18 °С до 2-х лет.

9.1.1. Экстракция и очистка полученного экстракта

Образец измельченного зеленого лука (или лука-репки) массой 10 г помещают в банку для экстракции объемом 250 куб. см, прибавляют 50 куб. см ацетонитрила и помещают в ультразвуковую ванну на 15 минут, а затем на 20 минут на аппарат для встряхивания проб. Экстракт фильтруют в делительную воронку объемом 250 куб. см через фильтр "красная лента". Экстракцию повторяют еще два раза, используя каждый раз по 50 куб. см ацетонитрила, помещая в ультразвуковую ванну на 10 минут, а затем на 10 минут на аппарат для встряхивания проб. Экстракты объединяют в делительной воронке объемом 250 куб. см.

К полученному экстракту добавляют 50 куб. см гексана и интенсивно встряхивают воронку 2 минуты. После полного разделения фаз в делительной воронке верхний слой (гексан) отбрасывают, а ацетонитрильный экстракт возвращают в делительную воронку и промывают еще одной порцией гексана объемом 50 куб. см. Гексан отбрасывают, а ацетонитрил собирают в концентратор объемом 250 куб. см через слой безводного сульфата натрия и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.

9.1.2. Очистка экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей

К сухому остатку в концентраторе, полученному по п. 9.1.1, прибавляют 40 куб. см хлористого метилена, тщательно обмывая стенки концентратора, и переносят смыв в делительную воронку объемом 500 куб. см. Затем концентратор обмывают еще двумя порциями хлористого метилена объемом по 30 куб. см и все смывы объединяют в делительной воронке. Туда же прибавляют 100 куб. см 2%-ного раствора сульфата натрия и встряхивают воронку 2 минуты. После полного разделения фаз в делительной воронке нижний слой (хлористый метилен) помещают в химический стакан объемом 200 куб. см, верхний (водный) слой отбрасывают.

Хлористый метилен из химического стакана переносят в чистую делительную воронку объемом 250 куб. см, прибавляют 100 куб. см 2%-ного раствора сульфата натрия, 10 куб. см 0,1%-ного раствора перманганата калия и повторяют процедуру промывки. После полного разделения фаз в делительной воронке нижний слой (хлористый метилен) собирают в концентратор объемом 250 куб. см через слой безводного сульфата натрия, осушитель обмывают 10 куб. см хлористого метилена, объединяют смыв с основным экстрактом и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.

9.1.3. Очистка экстракта на колонке с окисью алюминия

Сухой остаток, полученный по п. 9.1.2, растворяют в 10 куб. см ацетонитрила, тщательно обмывают стенки концентратора, наносят на заранее подготовленную колонку, элюат собирают в концентратор. Исходную колбу обмывают 10 куб. см ацетонитрила и вносят на колонку. Элюаты объединяют и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.

9.1.4. Очистка экстракта на колонке с Флоризилом

Сухой остаток, полученный по п. 9.1.3, растворяют в 0,5 куб. см этилацетата, обмывая стенки концентратора, затем в концентратор прибавляют 5 куб. см гексана, тщательно перемешивают и полученную смесь вносят на заранее подготовленную колонку. Колонку промывают 15 куб. см смеси гексана с этилацетатом в соотношении 10:1 и элюат отбрасывают. Фамоксадон элюируют с колонки 20 куб. см смеси гексана с этилацетатом в соотношении 2:1, элюат собирают в концентратор объемом 100 куб. см и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.

Сухой остаток растворяют в 5 куб. см ацетонитрила и 20 куб. мм раствора вводят в хроматограф.

Хроматограф жидкостный Waters 510 с ультрафиолетовым детектором с изменяемой длиной волны и чувствительностью не ниже 0,005 единиц адсорбции на шкалу, номер госрегистрации N 15311-02, или другой с аналогичными характеристиками.

Колонка стальная Symmetry Shield RP18, 250 мм х 4,6 мм, зернение 5 мкм, фирма "Waters".

Предколонка стальная Symmetry C8, 20 мм х 3,9 мм, зернение 5 мкм, фирма "Waters".

Температура колонки: 25 °С.

Подвижная фаза: ацетонитрил - 3,1 мМ ортофосфорная кислота в соотношении 650:350.

Длина волны: 245 нм.

Время удерживания Фамоксадона: 10,835 мин. +/- 2%.

Чувствительность не менее 0,003 AUFS (единиц абсорбции на шкалу).

Объем вводимой пробы: 20 куб. мм.

Линейный диапазон детектирования сохраняется в пределах 2 - 20 нг.

Для обработки результатов хроматографического анализа используется программное обеспечение химического анализа Millenium 3.05.01.

Альтернативная обработка результатов.

Содержание Фамоксадона рассчитывают по формуле:

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

Результат анализа представляют в виде:

дельта - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

В случае если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание вещества в пробе менее 0,05 мг/кг" <*>.

--------------------------------

<*> 0,05 мг/кг - предел обнаружения.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом добавок.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):